免疫亲和色谱-气相色谱／质谱法（IAC—GC／MS）检测猪肝中的沙丁胺醇与克伦特罗

畜牧兽医学报 2007，38(3)：271～275 Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica 免疫亲和色谱一气相色谱／质谱法(IAC—GC／MS)检测 猪肝中的沙丁胺醇与克伦特罗 王建平 ，史为民 ，沈建忠 (1．中国农业大学动物医学院，北京 100094；2．河北农业大学动物科技学院，保定 071000) 摘 要：制备出抗沙丁胺醇的抗血清，提取、纯化 IgG制备免疫亲和色谱柱，针对沙丁胺醇与克伦特罗的动态柱容 量分别为 400 ng／mL基质和416 ng／mL基质。猪肝样品匀浆后用稀盐酸提取 ，经免疫亲和色谱柱纯化，再用 GC／ MS检测，即为 IAC-GC／MS法。对沙丁胺醇的检测限为 0．5 ng／g，定量限为 2 ng／g，对克伦特罗的检测限为 0．8 ng／g，定量限为 2．5 ng／g。空白组织按照 1、5、10、20 ng／g的浓度添加药物，沙丁胺醇在空白肝中的添加回收率为 78．4 ～106．9 ，克伦特罗的添加回收率为 77．1 ～102．9 。本研究建立的检测猪肝中沙丁胺醇与克伦特罗的 IAC-GC／MS法乃国内首次报道。 关键词：沙丁胺醇；克伦特罗；免疫亲和色谱 ；GC／MS；猪肝 中图分 类号 ：$859．84 文献标识码 ：A 文章编号 ：0366—6964(2007)03—0271一O5 Immunoaffinity Chromatography—GC／MS for Determination of Salbutamol and Clenbuterol in Swine Liver W ANG Jian-ping ～．SHI Wei—min ．SHEN Jian-zhong (1．College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100094，China： 2．College of Animal Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 07 1000，China) Abstract：An IAC column was developed by coupling the purified specific IgG against salbutamol to CNBr-activated Sephrose 4B with the dynamic capacity of 400 ng／mL gel for salbutamol and 416 ng／mL gel for clenbutero1．After extraction with dilute HCl，the extracts of swine liver hom— ogenization was loaded on the IAC column for purification and determined bv GC／MS．The limit of detection for salbutamol and clenbuterol were 0．5 ng／g and 0．8 ng／g，and the limit of quantifi— cation for salbutamol and clenbuterol were 2．0 ng／g and 2．5 ng／g respectively．Recoveries ranged 78．4 一 106．9 for salbutamol and 77．1 一 102．9 for clenbuterol at fortified leve1s of 1，5。 1O，20 ng／g in blank swine liver．It was the first time that the IAG GC／MS for detection salbuta— mol and clenbuterol n swine liver was reported in China． Key words：salbutamol；clenbuterol；immunoaffinity chromatography；GC／MS；swine liver 沙 丁 胺 醇 (Salbutamol，SAL)与 克 伦 特 罗 (Clenbuterol，CL)均属于 62-兴奋剂 ，该种药物能选 择性作用于动物机体内的pz一受体，产生拟肾上腺素 类药物的药理作用 ，医学临床被广泛用于治疗支气 管炎 、哮喘等疾病 。将 其添加 至动物饲料 中给动物 饲喂后 ，会使动物生长加快 ，促使机体的脂肪组织向 肌肉组织转化，明显提高瘦肉率和饲料转化率，谓之 “再分配作用”，在一段 时间内曾被大量非法用于畜 收稿 日期 ：2006—01—03 作者简介：王建平(1977一)，男，博士，讲师，主要从事兽医药理与毒理学研究 *通讯作者：沈建忠，Tel：010—62732803；E—mail：sis@cau．edu．cn 维普资讯 http://www.cqvip.com 272 畜 牧 兽 医 学 报 牧业生产 中[ 。但 SAL与 CL在动物机体内残留 量大 ，残留时间长 ，给消费者 的健 康带来很 大的威 胁 ，很多国家都 禁止 J3 一兴奋 剂应用 于畜牧业 生产 中。但有一些饲养者或饲料厂仍在非法使用 ，因此， 不断有食用含有 8 一兴奋 剂残 留的动物组织而引发 中毒的事件发生_2]。 国内外很多文献资料都探讨 了动物组织 中的 sAL与 CL的残留检测方法，包括液相色谱法、气相 色谱一质谱法 、液相色谱一质 谱法、酶免疫检测法 等， 作者也 曾报道过检测 SAL残 留的 ELISA方法[3]。 笔者拟用免疫亲和色谱(IAc)技术结合 GC／MS法 对 sAL与 CL进行定性定量检测。免疫亲和色谱 是以抗原抗体可发生特异性结合和可逆性解离反应 为原理，将特异的抗体与惰性基质偶联，制成固定相 装柱 ，当含有被测组分的样品通过 IAC柱时 ，固定 相中的抗体可与待测物发生特异性结合，其他不被 识别的组分则流出 IAC柱 ，洗涤 除去杂质后，再 用 洗脱剂洗脱待测物，则样品被纯化 ，再进行检测。此 方法可大大简化组织样品 的前处理过程，并使提取 的样品进一步纯化 ，排除了样品基质 中的杂质影响， 使实际检测工作更加迅速、准确 、简便 。 l 材料与方法 1．1 试剂与溶液 用 甲醇配制浓度为 1 mg／mL的沙丁胺醇与克 伦特罗贮备液 ，4℃保存 。DEAE一纤 维素 ，SIGMA 公司。CNBr活化的 Sepharose4B干粉购 自Phama— cia公司。衍生化试剂 为含 1 TMS的三 甲基硅烷 三氟乙酸酐(Sigma—Aldrich公司)。IAC溶液系统： 磷酸盐缓 冲液 (0．01 mol／L pH7．4)，Tris缓 冲液 (0．1 mol／L pH8．0)，碳 酸氢 钠溶 液 (0．1 mol／L pH8．4)，乙酸盐缓冲液(0．1 mol／L pH4．0)，硼 酸 盐缓冲液(0．I mol／L pH8．0)。乙醇 ：水 ：乙酸盐 缓冲液(80：15：5，体积分数)为洗脱液 A，1 mL洗 脱液 A加 3 mL甲醇即为最终洗脱液 。 1．2 仪器设备及操作条件 安捷伦 6890气相色谱仪，配有安捷伦 5973质 量选择检测器与 自动进样 器。气 相色谱柱 为 HP一 5ms，0．25 mm×30 m×0．25 m。GC／MS系统的 操作条件：EI源，不分流进样，进样量 1 L；进样 口 温度 250℃ ；柱温程序为 70℃保持 2 min，再以 18 ℃／min升到 200℃，然后以 5℃／min升到 250℃ ， 最后以 25℃／min升到 300 oC并保持 5 min。载气 为氦气，流速 1．0 mL／min。传输线温度280℃。质 谱为 SIM(选择离子监控)模式 ，SAL的定性离子为 86、350、369、440，定量离子为 369，CL的定性 离子 为 86、243、262、277，定量离子为 86。 1．3 抗原及抗体的制备 sAL完全抗原的合成，抗血清的制备与鉴定参 见王建平 等的报道。 1．4 Ig6的纯化 将所得特异性抗 血清采用饱和硫 酸铵盐析法 (SAS)进行纯化，对血清进行粗提 、浓缩 ，在 PBS中 透析 48h，然后使粗 提所得的 IgG通过 DEAE-纤维 素离子交换柱 ，进一步进行纯化脱盐，即得到用于制 备 IAC柱 的纯化 IgG，用紫外分光光度计计算所得 纯化 IgG的浓度 。 1．5 IAC柱的制备与鉴定 1．5．1 免 疫 吸 附 剂 的 制 备 将 CNBr活 化 的 Sepharose4B干粉用 1 mmol／I 的稀盐酸进行溶涨 处理后 ，与 事 先 溶 于 碳 酸 氢 钠 溶 液 (0．1mol／L pH8．4)中的IgG进行偶联，并计算偶联比率。 1．5．2 装柱与柱容量测定 将制备好的免疫 吸附 剂压积 1．0 mL装 柱(玻璃 柱 100 mm×8 mm，G3 滤板)，然后依次用 10 mL PBS、5 mL去离子水 、5 mL乙醇／水(1：4，体积分数)冲洗 IAC柱，洗去结 合力弱的 IgG，最后再用 10 mL PBS平衡 。将浓度 为25 ng／mL的SAI 溶液连续加到IAC柱上，使其 自然流出，分管收集，GC／MS检测。当柱结合能力 达到饱和后(即流出液浓度与加样浓度相同)，用 30 mL去离子水洗柱，最后用 5 mL洗脱液洗脱 SAL， 收集洗脱液 ，GC／MS检测柱 容量，按 DavisE 3的方 法计算动态柱容量和绝对柱容量。同法检测 IAC 柱对 CL的柱容量。 1．5．3 IAC柱的回收率测定 将二分之一柱容量 的 SAL或 CL加到 IAC柱 上，自然流 出，洗涤 ，洗 脱，GC／MS检测，计算 IAC柱的回收率。 1．6 添加 回收率测定 取 5 g匀 浆 后 的 猪肝 组 织 ，按 照 1、5、10、20 ng／g的浓度添加 SAL或 CI 后 ，加入 10 mL 0．O1 mol／L的盐 酸溶 液，涡动 3 min，然后 3 000 g离心 10 min，取全部上清液过 0．45 p．m 的滤膜 ，然后全部 上柱进行分离纯化 ，自然重力下通过 IAC柱。用 30 mL去离子水淋洗 ，最后用 5mL洗脱 液洗脱 ，收集 于试管中。将收集的 IAC柱洗脱液在 45℃水浴锅 中用氮气吹干，然后加入 50 L衍生化试剂，涡动 1 维普资讯 http://www.cqvip.com 3期 lr建 一F等：免疫亲和色 潜 气 相色谱 。质借法(1AC c；(、。MS)谊删绪肝中的沙 r胺醇与 克伦特罗 273 rain．然 后在 80℃条忭下 反应 l h 反应 完毕 后冷 却 至 室 温 ．最 后 转 人进 样 小 瓶 中供 (；L’／MS 榆 钡0 2 结果与分析 2．1 IAC柱的制备 根据 I．2．： 中的结粜 ．删碍抗 体 IgG 的偶 联枣 为 98．4 ．茬 明抗体 1g( CNBr活化 的 Sepha Fose-1B的偶联 率很 高， ‘算公式如下： - = 惶 1i)O’。1 2．2 柱容量与回收率 本试验采用 5 nll，洗脱 液就 口J将 部 SAI 或 【J洗脱 ．说 _jH洗脱效果较 好且完 全．洗 脱曲线 网 见 图 1 经 捌定 ．IAC柱 针对 SAI 的动态 牲 容量 为 400 ng／m1．基质 ，回收 牢为 95 针对 【 I f1勺托容 量为 4l 6 I]R ml_基质 ． 收率 为 1一)2 。所制 备的 IAC柱在 1周内 蘑复使川 10次后 ．对橱种药物的件 容量均在 220 ng／mI 墼质 上 ．柱容 量变化情 况 图 2 在 馨 求 丑 SAI ■ L。L 露§_ — — 图 I IAC柱的冼脱结果 Fig．I I'he eluIion calibratirm 0r IA( colum n 5Il 4{⋯ 350 jUO S” 2[1l J 1 5o l(ii1 c) 图 2 IAC柱的柱容量下降趋势 Fig．2 rhe chan~~of colum n capllcity 2．3 标准 曲线的制备 按 2．5、5，0、10、20、4U rig／mI 系列 浓 度绘 制 SAI 、【’【_的标 准曲线 ，结果 见 4 在此 浓度 范围内两种药物的色谱峰面积与它们的质量浓度呈 线 相 关 ．其线 性 方 程 分别 打u下 ：范伦特 罗 l 一 {．74 。‘。X 1．】6 ．相关系数 R一0．997；沙 丁胺 醇 Y 一2．39 ⋯X 2．54⋯ 。’．相 关系数 R一0．996 图 3 Fig．3 “ 浓 ⋯ 4。 图 4 (I 的 G(／MS标准曲线 ¨ 4 1．he standard calibration l’r( 【／MS 1r C1 2．4 样品添加 回收率 以信躁比≥3为标准．GC／MS法的对 SA[ 的 榆 测限为 0 5 ng／g．定量限为 2 ng／g．对 【’I 的检测 限为 ·)．8 ng／g．定量限 为 2．5 ng／g 在猪肝 中按 l、 5、10、20 ng／g的l硪度 添加 SAI．干¨ C【．．样品经 IAC 朴分离纯 化后 ．GC／MS榆 删 ．添加 M收率结粜 见表 】。结果表 明．此 1A c；c／MS法能 够满 足 SAI -j (’I 残 留检 删的需 要 3 讨 论 3．1 免疫吸附剂的制备 免疫 亲和色谱 的特点 就在于它有很高的特异性 结 台能力和样 品净化能 力，所 以该净化 寓集技 术『] 前 被广 泛接 受井研干兽药残留的测定 慢 I 研 究 着对 一必备剂 IAC柱的研究还求广泛开展．因 维普资讯 http://www.cqvip.com 274 畜 牧 兽 医 学 报 表 1 空 白猪肝 中 SAL与 CL的添加 回收率 (n=6) Table 1 The recoveries of SAL and CL fortified in blank swine liver(n 6) 此作者首先建立了 IAC—GC／MS法 。若要获得性能 较好的 IAC柱，最主要的是要选择高滴度的特异性 抗体和一定的惰性基质。制备针对 SAL特异性抗 体的研究作者已进行过探讨[3]，在此不再赘述 。惰 性基质主要有吸附性硅胶 、珠状琼脂糖凝胶、葡聚糖 等。目前 IAC技术中使用最多的基质是 4 的珠状 琼脂糖，商品名为 Sepharose 4B。其分子具有疏松 的网状结构，能允许大分子 自由扩散，吸水性好，且 骨架上有大量羟基供活化和偶联之用_5]，因此 ，本试 验中选用 Sepharose 4B作为制备免疫吸附剂 的基 质。 3．2 IAC-GC／MS法的研究 Haasnoot[6 等首次报道 了将 IAC原 理用于尿 液和组织 中克伦特罗的提取净化 。他们使用抗克伦 特罗多克隆抗体制备 IAC柱，将组织提取液通过 IAC柱 后，以 乙 酸洗 脱 ，再 通 过 C18柱，然 后 用 90000 8500o 80000 7500o 7000o 65000 ；05ooo000 器 4000o 35000 3000o 2500o 2000o l5 r000 HPLC测定。之后有许多研究者将 IAC技术应用 于 0。一兴奋剂 的残 留检 测 中。Cooper 等采 用克 伦特罗多抗制备 IAC柱，提取沙丁胺醇，柱容量为 270ng／g基 质，添 加 回收 率 最 高 为 60 ；Van GinkelE。 等报道，用两种混合抗体制备 IAC柱，可 提取猪尿 中克伦特罗 、沙丁胺醇 、马布特罗 、西 马特 罗等，用 GC／MS检测，检测限达 0．1 ng／g；Pou 等 采用 SAL单克隆抗体制备了 IAC柱，净化牛组织 中的 SAL，用化学荧光免疫检测法测定。Pickett 。。 等建立 了 IAC—ELISA法 ，采用抗 克伦 特罗抗体 制 备 IAC柱浓缩 净化 牛尿 中的克伦 特罗 ，柱容量 为 260 ng／g基质，ELISA检测，回收率为 8O 左右。 本试验建立 的 IAC—GC／MS法 ，采用的是抗沙 丁胺醇抗体 IgG制备 IAC柱，可同时提取净化猪肝 组织中的 SAL与 CL，柱容量均在 400ng／mL基质 以上，比同类文献报道的柱容量高，且使用 1O次以 后 ，对两种药物的柱容量也均在 220ng／mL基质以 上。在该方法中，样 品经稀盐酸提取后可直接通过 IAC柱 ，将样 品前处理过程 大大简化，猪肝 经 IAC 柱净化后 ，在气相色谱的总离子流图中可看出，在 目 标物周 围无其他 明显 杂峰(见 图 7)，说明本实验室 建立的 IAC柱 对肝组织的净 化效果令人满 意 在 空白肝组织 中的添加 回收率范 围为 77．1 ～ 106．9 9／6，完全 能够 满足对 SAL和 CL残留检测 的 要求 ，检测 限均 在我 国农业 部 规定 的检 测 限 以下 (NY／T 468-2005，2．0 ng／g)，说明本方法具有很高 的实用性 。因此，本试验所建立的 IAC—GC／MS法 高效、灵敏，是目前国内较好的检测 SAL与 CL残 留的方法。 ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ． ． ． ． ． ． ． ． ⋯ Ⅵ ． 11．oo 11．50 12 oo 12．50 13 oo 13．50 14．oo 14．50 15 oo 15 50 16 oo 16．50 17．oo 17 50 时『日JTime 图 5 SAL与 CL标 准品的气相色谱总离子流 图 Fig．5 Total ion ehromatograms of SAL and CL standard 维普资讯 http://www.cqvip.com 3期 王建平等：免疫亲和色谱一气相色谱／质谱法(IAc—Gc／Ms)检测猪肝中的沙丁胺醇与克伦特罗 275 l10000 lOO000 90000 8Ooo0 70000 60000 50000 40000 30000 20000 l0000 l1．O0 12．O0 13．O0 14．O0 l5．00 l6 00 l7．oo l8．oo l9．O0 20．O0 21．oo 22 oo 23．O0 24．O0 时『日JTime 图 6 空 白猪肝 的气相 色谱 总离子流图 Fig．6 Total ion chromatograms of blank swine liver ． 』 1 一 CL ． =I— 一 一一 J『L U L^ ^ ． 11．OO l1 5O l2 oo l2．5O l3 OO l3．5O 14．00 14．50 l5．OO l5 5O l6．00 l6．50 l7．OO l7 5O 时间Time 图 7 空 白猪肝 中添加 SAL与 CL的气相色谱总离子流 图 Fig．7 Total ion chromatograms of fortified SAL and CL in blank swine liver 参考文献： [1] Smith D J．The pharmacokinetics，metabolism，and tissue residues of p_adrenergic agonists in livestock [J]．J Anim Sci，1998，76：173～194． [2] 王立斌，梁春穗，林协勤，等．盐酸克伦特罗引起特大 食物中毒的调查与思考[J]．华南预防医学，2002，28 (1)：54～56． [3] 王建平，沈建忠．猪肝和猪尿中沙丁胺醇和克伦特罗 残留的酶联免疫吸附检测法研究[J]．畜牧兽医学报， 2005，36(4)：397～4O1． [4] Davis G C，Hein M B，Chapman D A．Evaluation of immunosorbents for the analysis of small molecules： isolation and purification of cytokinins[J]．J Chroma— togr，1986，366：171～ 189． [5] 李俊锁，邱月明，王 超．兽药残留分析[M]．上海：上 海科技出版社，2001． [6] Haasnoot W，Ploum M E，Paulussen R J，eta1．Rap— id determination of elenbuterol residues in urine by high—performance liquid chromatography with on-line automated sample processing using immunoaffinity [7] [8] [9] [1O] chromatography[J]．J Chromatogr，1990，519：323 ～ 335． Cooper A D．Shepherd M J．Evaluation of a novel im— munoaffinity phase for the purification of cattle liver extracts prior to high—‘performance liquid chromato—‘ graphic determination of beta—agonists[J]．Food and Agricultural Immunology，1996，8(3)：205～213． Van Ginkel L A ，StephanyRW ，VanRossum H J． Development and validation of a multiresidue method for beta—agonists in biological samples and animal feed[J]．J AOAC Int，1992，75(3)：554~560． Pou K，Ong H，Adam A，eta1．Combined immunoex— traction approach coupled to a chemiluminescence en— zyme immunoassay for the determination of trace Iev— els of salbutamol and elenbuterol in tissue samples [J]．Analyst，1994，119(12)：2 659～2 662． Pickett R J H，Sauer M J． Determination of clen— buterol in bovine urine by enzyme immunoassay fol— lowing concentration and clean—up by immunoaffinity chromatography[J]．Analytiea Chimica Acta，1993， 275：269～ 273． 黜 黜黜 黜勰 黜 粼勰 1)3 ^ ^ 2 ^ ^ ^ ^2 ^ ^ 一 一 一 一 一 _ 一 _ 一 ．● 遥娶 维普资讯 http://www.cqvip.com