基于纳米金探针和基因芯片的DNA检测新方法

2009 年第 67 卷 化 学 学 报 Vol. 67, 2009 第 18 期, 2144～2148 ACTA CHIMICA SINICA No. 18, 2144～2148 * E-mail: jiachp@mail.sim.ac.cn Received November 26, 2008; revised March 19, 2009; accepted April 28, 2009. ·研究论文· 基于纳米金探针和基因芯片的 DNA 检测新方法 包 华 a,b 贾春平*,b 周忠良 a 金庆辉 b 赵建龙 b (a华东师范大学生命科学学院 上海 200062) (b中国科学院上海微系统与信息技术研究所 上海 200050) 摘要 运用荧光纳米金探针和基因芯片杂交建立一种新的DNA检测方法. 荧光纳米金探针面标记有两种DNA探针: 一种为带有 Cy5 荧光分子的信号探针 BP1, 起信号放大作用; 另一种为与靶 DNA 一部分互补的检测探针 P532, 两种探 针比例为 5∶1. 当靶 DNA 存在时, 芯片上捕捉探针(与靶 DNA 的另一部分互补)通过碱基互补配对结合靶 DNA, 将靶 DNA 固定于芯片上; 荧光纳米金探针通过检测探针与靶 DNA 及芯片结合, 在芯片上形成“三明治”复合结构, 最后通 过检测信号探针上荧光分子的信号强度来确定靶 DNA 的量. 新方法检测灵敏度高, 可以检测浓度为 1 pmol/L 的靶 DNA, 操作简单, 检测时间短. 通过改进纳米金探针的标记和优化杂交条件, 可进一步提高核酸检测的灵敏度, 这将在 核酸检测方面具有重要的应用价值. 关键词 纳米金探针; 荧光探针; 基因芯片; 杂交; DNA 检测 A Novel DNA Detection Method Based on Gold Nanoparticle Probes and Gene Chips Bao, Huaa,b Jia, Chunping*,b Zhou, Zhonglianga Jin, Qinghuib Zhao, Jianlongb (a School of Life Science, East China Normal University, Shanghai 200062) (b Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200050) Abstract A new DNA detection method based on fluorescent gold nanoparticle (AuNP) probes and DNA chips was introduced here. Firstly, chips were modified with amine-oligonucleotide probe complementary to target DNA (capture probe). Gold nanoparticles were modified with two types of probes, one was another thiolated-oligonucleotide probe complementary to target DNA (detecting probe) and the other was thiolated-oligonucleotide probe without homologous sequence to detected samples (signal probe). The end of signal probe opposite the gold nanoparticles was modified with Cy5. The ratio of them is 1∶5. Through hybridization, the sandwich structures (DNA chip-target DNA-AuNP probes) were formed. Excess samples and AuNP probes were removed by washing for several times. And the amount of target DNA was deter- mined by detecting the fluorescent signal of the AuNP probes. Low to 1 pmol/L target DNA could be de- tected with this method. Because the signal DNA probe with fluorescence rather than the target DNA was identified in this approach, the different proportions of detecting probe and signal probe could affect the de- tection signal significantly. Effect of different proportions of probes on detecting signal would be studied at a ratio of 1∶30, 1∶60, 1∶100 and higher sensitivity would be achieved. So, this will be one of the most important DNA detection methods. Keywords gold nanoparticle probe; fluorescent probe; DNA chip; hybridization; DNA detection No. 18 包 华等：基于纳米金探针和基因芯片的 DNA 检测新方法 2145 DNA 芯片技术是近年来兴起的一种快速、高敏感、 高度集成化的基因检测技术. 基因芯片是将大量的核酸 片段有序地固化于硅衬底或玻璃上构成, 与已标记的待 测样品分子杂交, 通过特定的仪器对杂交信号进行检 测, 从而快速、并行、高效地检测分析样品中的靶分子 含量[1]. 在基因突变和基因诊断等领域已获得应用. 但 是, 在用基因芯片检测时, 由于其检测灵敏度的限制, 样品中核酸往往需先经过 PCR 扩增, 才能检测出来, 操 作复杂、检测时间长、易污染且费用高, 大大限制了在 医学临床诊断方面的广泛应用[2,3]. 基于纳米材料的检测技术是最近十年来迅速发展起 来的一项临床检测技术. 纳米材料尤其是纳米金, 具有 很好的生物相容性, 颗粒直径小, 体表面积大[4], 可标记 大量生物分子, 并且标记于纳米材料表面的生物分子之 间的结合能力大大提高[2,3,5], 例如标记了纳米金的核酸 具有更高的杂交特异性, 而且寡核苷酸的修饰也更有利 于胶体金的稳定[6]. 最引人注意的是Mirkin实验室[7]提出 的一种基于纳米金探针 Bio-Bar-Code Amplification (BCA)扩增技术, 该技术中纳米金探针表面修饰了起信 号放大作用的条形码DNA和与靶核酸互补的DNA探针, 当有靶核酸存在时, 磁微粒、靶核酸、纳米金探针形成“三 明治”复合结构, 复合物经磁场分离, 富集的纳米金探针 热变性, 释放条形码 DNA, 对其进行银染或 PCR 检测, 间接检测靶核酸的量. 这种 BCA 检测方法通过多次信号 放大, 可高灵敏度检测低至 1 amol/L 的核酸, 但因具有 检测过程复杂、操作时间长、步骤繁多等局限性, 大大限 制了在临床方面的广泛应用[7]. 该实验室正于各方面进 行改进, 以进一步简化操作步骤, 提高其适用性[7]. 近年来, 将DNA探针结合于金纳米颗粒上构成纳米 金生物分子复合探针, 通过与靶DNA的杂交互补结合比 色法、荧光、电化学及银染等检测方法构建新的 DNA 检 测方法[8,9], 已成为一种趋势. 有文献[10]报道运用凝胶 电泳鉴别结合靶 DNA 的纳米金探针, 可检测经 PCR 扩 增的核酸浓度为 100 fmol/L. Maeda 等[11]用比色法检测靶 DNA, 结合了靶 DNA 的纳米金探针在一定的盐离子浓 度下会聚集, 能检测DNA的浓度为50～500 μmol/L. 此 外莫志宏等[12]、Franco 等[13]也通过纳米金凝聚变色效应 原理, 采用比色法检测目标靶 DNA 的存在, 但检测灵 敏度不高. Mo 等[14]通过靶 DNA 置换出结合到纳米金长 探针上的荧光短探针, 使淬灭的荧光发光从而验证被测 DNA 的存在, 其检测灵敏度得到提高为 50 pmol/L. 电 化学 DNA 探针的检测方法是目前比较流行的一种生物 检测方法, 但需特定电化学仪器对信号进行检测[15～17]. 如运用 TBR 标记的纳米金探针结合靶 DNA, 通过直接 检测 TBR 电化学发光来确定靶 DNA 的存在. 这种方法 可直接检测未经提纯的生物样本, 简单, 可检测最低浓 度为 1 fmol/L 的核酸[18]. 此外 Lin 等[19]运用磷酸镉修饰 的纳米金探针与核酸突变位点完全互补结合, 通过电化 学溶出分析镉含量来确定被测突变核酸的量, 可检测 21.5 amol/L 的突变核酸. 虽然上述方法都对纳米金用于 DNA 生物检测进行 了一定的研究, 但仅仅局限于实验室的研究, 目前在临 床诊断中尚未能应用. 本文介绍一种新的基因芯片结合 纳米金探针检测 DNA 的方法, 即在纳米金表面按照一 定的比例, 同时标记与靶DNA互补的检测DNA探针和 带有荧光的信号探针构成纳米金探针, 利用荧光纳米金 探针的信号放大作用, 获得较高的检测灵敏度, 并利用 此方法检测 P53 基因. P53 是一种抑癌基因, 它的缺失、 突变或失活与多种肿瘤的发生有关, 据统计, 50%的肺 癌患者体内发生 p53 基因突变[20]. P53 基因是肺癌中突 变率最高的基因, 并在肺癌发生早期及癌前病变就发生 突变[20], 因此 P53 基因突变的检测对肺癌早期诊断有重 要的指导意义. 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 1.1.1 试剂 纳米金溶液、基因芯片由本实验室自行制备; 杂交缓 冲液, 购自罗氏公司; 鱼精DNA, 吐温20 (Tween 20), 牛 血清蛋白(BSA), 聚乙二醇(PEG8000)购自 Sigma 公司; 胶体金重悬液(0.1 mol/L PB, 蔗糖); 0.1 mol/L 磷酸缓冲 液(PB) (pH 7.2 0.2 mol/L Na2HPO4, 0.2 mol/L NaH2PO4); 0.1 mol/L 磷酸缓冲生理盐水(PBS); 0.1 mol/L NaCl; 0.2× 洗液(SSC: 0.1%十二烷基磺酸钠(SDS), 0.03 mol/L NaCl, 0.3 mmol/L C6H5Na3O7•2H2O); 银染液; NaNO3洗液. 如表 1 所示, 所需探针序列均由 TakaRa 公司合成. 表 1 核酸探针序列表 Table 1 DNA sequences 名称 探针序列 靶 DNA P53DNA 5'-gTggCTCCTgACCTggAgTCTTCCA(T)16ATgggCCTCCggTTCATgCC-3' 芯片表面的捕捉探针 NH2-P531 5'-(NH2)-(T)16-ggCATgAACCggAggCCCAT-3' 纳米金上的检测探针 SH-P532 5'-TggAAgACTCCAggTCAggAgCCAC(T)10-(SH)-3' 纳米金上的信号探针 Cy5-BP1-SH 5'-(SH)-(CH2)6-(T)10AgCTACgAgTTgAgAATCCTgAATgCgACg(T)10(CY5)-3' 2146 化 学 学 报 Vol. 67, 2009 1.1.2 主要仪器 芯片点样仪(型号为 Prosys 5510A)、芯片扫描仪(型 号为 Gene Pix 4000 B), 紫外-可见光光谱仪(型号为 J∧ S.C.O V-670 spectrophtometer)等. 1.2 芯片制备 芯片点样仪将 NH2-P531 探针修饰于芯片(表面醛基 化)表面, 点直径 100 μm, 点间距 500 μm, 点样量为 0.7 nL, DNA 探针浓度为 75 μmol/L. 1.3 纳米金探针制备 1.3.1 纳米金颗粒的制备 配制 1 mmol/L 的 HAuCl4, 38.8 mmol/L 柠檬酸三钠 溶液. 按预先设计的反应条件量取 250 mL HAuCl4加热 并搅拌 10 min, 快速加入柠檬酸三钠溶液, 颜色由浅黄 迅速变为深红时, 再持续搅拌 15 min, 待溶液冷却至室 温, 用硝酸纤维薄膜过滤器过滤, 即可得到纳米金溶液. 1.3.2 纳米金探针标记 纳米金颗粒表面标记有两种巯基修饰的 DNA 探针: 一种是带有Cy5 荧光分子的信号探针BP1, 起信号放大作 用; 第二种是能与靶DNA另一部分互补的检测探针P532. 纳米金探针的标记方法: 取浓度为 10 nmol/L 的 10 nm 纳米金溶液 1 mL, 9000 r/min 离心 50 min, 去上清, 100 μL 无菌去离子水重悬; 加入体积比为 1∶5, 浓度均 为 100 μmol/L 的两种 DNA 探针共 5 μL, 使总探针的终 浓度为 5 μmol/L, 室温放置 16 h 以上; 分 3 次逐渐加入 1 mol/L NaCl, 0.1 mol/L PB (pH 7.2)至终浓度分别为 0.1 mol/L, 10 mmol/L, 充分混匀, 室温放置 48 h 以上; 用 0.01 mol/L PB (0.1 mol/L NaCl)溶液 9000 r/min 离心 50 min 洗 2 次, 胶体金重悬液洗 1 次, 去上清, 再加 100 μL 的胶体金重悬液, 4 ℃储存备用. 用紫外-可见光光谱仪 测其吸光光谱及 OD 值; 用透射电镜扫描 DNA 探针标 记前后的纳米金. 1.4 芯片杂交 检测过程: 3 μL 待测 DNA 与 16 μL 杂交液混匀, 均 匀滴于芯片上, 48 ℃杂交 1 h, 0.2×SSC 洗液清洗芯片 1 min, 晾干待用. 3 μL 纳米金探针溶液与 16 μL 杂交液 (1%鱼精DNA, 0.05% Tween)混匀, 室温封闭 30 min. 封 闭后的纳米金溶液均匀滴于晾干芯片的点阵区, 48 ℃ 杂交, 1 h. 0.2×SSC 洗液, 避光清洗芯片 1 min, 晾干. 芯片扫描仪扫检测荧光信号(图 1). 2 结果与分析讨论 2.1 纳米金探针制备及表征结果分析 如 TEM 图 2a, 图 2b 所示, 未标记 DNA 探针的纳 图 1 纳米金探针标记过程和 DNA 检测过程示意图 Figure 1 Schematic of preparation of AuNP probes and hy- bridization procedure 米金颗粒周围界面清晰, 而标记后的纳米金颗粒周围存 在一圈灰黑色的“晕”环, 表明 DNA 探针已标记到纳米 金颗粒表面, 并且由图可见 DNA 探针的标记并未使纳米 金颗粒聚集, 其仍稳定存在, 分散性好. 纳米金随粒径的 增大, 对应吸收峰的峰位呈现向长波段红移的趋势[21,22]. 从图 2c 光谱扫描图可以看出, 标记了 DNA 探针的纳米 金最大吸收峰的波长后移了 4.0 nm(标记前后最大吸收 峰波长分别是 520 和 524 nm). 波峰的移动说明 DNA 分 子标记到纳米金颗粒的表面, 使纳米金粒子尺寸和形状 有所改变[21], 从而改变了纳米金颗粒的光谱特征. 图 2 标记 DNA 探针前后的纳米金 TEM 图和紫外-可见光光 谱扫描图 Figure 2 Scanning results of AuNP probes with TEM and UV-Vis spectrum (a), (b) represents the TEM figure of AuNPs before and after modified by DNA probes, respectively; (c) represents it's UV-Vis spectrum 2.2 核酸检测结果与分析 基因芯片常用的荧光探针检测法: 即直接用带有荧 No. 18 包 华等：基于纳米金探针和基因芯片的 DNA 检测新方法 2147 光分子 Cy5 的信号探针同芯片上的捕捉探针杂交并检 测相应的荧光信号. 荧光探针直接检测核酸方法(图 3a) 检测核酸分子的最低浓度为 1 nmol/L, 结果见图 4. 图 3 基于基因芯片的三种不同检测方法的比较示意图 Figure 3 Schematic of different DNA detection methods based on the gene chip (a), (b), (c) represents fluorescent DNA probes; fluorescent gold nanoparticle probes; gold nanoparticle probes and silver staining, respectively 图 4 荧光探针直接检测不同浓度靶核酸的芯片扫描结果图 Figure 4 Results of detected DNA with fluorescent DNA probes (a) 10－8 mol/L; (b) 10－9 mol/L; (c) 0 mol/L 本文中采用荧光纳米金探针结合基因芯片的检测 方法(图 3b), 所用纳米金探针上检测探针与信号探针比 例为 1∶5, 可以检测最低浓度为 1 pmol/L 的靶核酸分 子, 检测信号好, 点阵清晰, 且随靶 DNA 分子浓度降 低, 信号结果呈现减弱趋势变化, 差异较明显(图 5). 图 5 荧光纳米金探针检测不同浓度核酸的芯片扫描结果图 Figure 5 Results of detected DNA with fluorescent gold nanoparticle probes (a) 10－8 mol/L; (b) 10－9 mol/L; (c) 10－10 mol/L; (d) 10－11 mol/L; (e) 10－12 mol/L; (f) 0 mol/L 目前, 基于纳米金探针结合基因芯片银染的检测方 法已有报道[23,24]. 通过将待测 DNA 分子与纳米金探针 置于芯片上杂交, 杂交后清洗芯片并晾干, 而后银染并 检测银染信号来判断靶 DNA 的存在. 用图 5 荧光检测 后的基因芯片进行银染, 以比较荧光检测法与银染检测 法的灵敏度, 如图 3c 所示, 纳米金探针-银染方法虽然 通过银染得到可目视化结果, 无需仪器测量, 但其检测 过程对纳米金探针和待检测核酸的要求量都很高, 其检 测灵敏度为浓度 0.1 nmol/L 的核酸分子(图 6). 图 6 纳米金探针-银染方法检测不同浓度靶核酸的芯片扫描 结果图 Figure 6 Results of detected DNA with gold nanoparticle probes and silver staining (a) 10－8 mol/L; (b) 10－9 mol/L; (c) 10－10 mol/L; (d) 10－11 mol/L; (e) 10－12 mol/L; (f) 0 mol/L 上述结果比较可知, 基于纳米金探针芯片银染方法 和荧光探针直接检测方法的灵敏度(检测靶核酸的最低 浓度分别为 0.1, 1 nmol/L)均低于本文荧光纳米金探针 结合基因芯片检测方法的灵敏度(检测靶核酸的最低浓 度为 1 pmol/L). 由此可见, 本文方法在检测过程中运用 荧光标记的纳米金探针使检测信号得到放大, 核酸检测 具有更高的灵敏度. 纳米金颗粒表面按照一定比例标记有检测探针和 荧光信号探针, 两种 DNA 探针具有不同作用: 检测探 针与已结合到芯片表面的靶核酸结合, 同时将纳米金 (带有荧光信号探针)也结合于芯片表面; 检测过程中检 测信号探针上的荧光信号. 当纳米金表面检测探针和信 号探针比例为 1∶5 时, 芯片表面结合一个检测探针, 同 时可结合至少 5 个信号探针, 因而荧光纳米金探针对检 测起到信号放大作用. 由此可知, 结合于芯片表面(靶核 酸)的检测探针量越多, 荧光信号探针量将越多, 被检测 到的信号会越强, 核酸检测的灵敏度越高. 目前, 纳米金颗粒表面检测探针和荧光信号探针的 比例较小(1∶5), 即标记的荧光信号探针数量相对较少, 检测到荧光信号探针的量较少 , 但仍可检测低至 1 pmol/L的靶核酸, 检测灵敏度高于直接运用荧光探针检 测(可检测浓度为 1 nmol/L 的靶核酸), 说明纳米金颗粒 表面该比例探针的确对检测起到信号放大作用. 因此, 2148 化 学 学 报 Vol. 67, 2009 在纳米金探针制备过程中, 将纳米金表面检测探针和荧 光信号探针的标记比例提高到 1∶30, 1∶60 或 1∶100 等, 即增大荧光信号探针在纳米金表面所占比例, 该荧 光纳米金探针的信号放大作用会增强, 运用此纳米金探 针进行核酸检测的灵敏度将会得到进一步提高. 但是, 随纳米金颗粒表面荧光信号探针量的增加, 与靶 DNA 互补配对的检测探针量将减少, 加之受空间位阻的影 响, 杂交效率会降低[7], 因此需要对杂交条件、纳米金探 针的标记等方面进一步优化, 可得到较高的检测灵敏 度. 综上所述, 本文所提出的运用荧光纳米金探针结合 基因芯片的核酸检测新方法有如下优点: 节约核酸探针 的用量, 影响因素少, 杂交反应的非特异性小; 用荧光 分子标记的信号探针检测信号, 相对银染检测信号, 操 作简单, 灵敏度更高; 以纳米金为载体, 通过标记一定 比例的检测探针和荧光信号探针构成荧光纳米金探针, 不仅有利于杂交反应, 而且对检测起信号放大作用. 因 此, 本文阐述的 DNA 检测方法将具有更广阔的应用前 景. 3 结论 本文提出的纳米金结合基因芯片的新方法, 是根据 纳米材料的特性, 在运用纳米材料的基础上, 将纳米技 术和基因芯片技术结合而建立起来的一种新的核酸检 测方法. 通过检测实验, 初步确定当纳米金的检测探针 和信号探针比例为 1∶5 时, 该方法的检测灵敏度为 1 pmol/L(靶核酸浓度), 通过改进纳米金探针的标记和优 化杂交条件, 可以进一步提高核酸检测的灵敏度, 这种 检测方法在核酸检测中将有较高的应用价值. 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