丁香酚体外抑菌作用研究

2008, Vol. 29, No. 09 食品科学 ※基础研究122 丁香酚体外抑菌作用研究 吕世明 1 ,2，陈杖榴 1 ,*，陈建新 1，邱 电 1，李春梅 1 (1.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642；2.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025) 摘 要：应用微量稀释法对丁香酚体外抑菌活性进行了研究。结果明，丁香酚对 12 种常见细菌具有较好的抑菌 作用，其中对大肠杆菌ATCC25922(质控菌)的效果最好，其最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)分别为 5μg/ml 和 10μg/ml；对蜡状芽孢杆菌作用较差，MIC 和MBC 分别为 320μg/ml 和 640μg/ml：其余菌株的MIC 和MBC 分别在 20～80μg/ml 和 40~160μg/ml 之间。而时间 - 杀菌曲线法实验结果表明，丁香酚抑菌作用特性表现为较强的浓度依赖 性，其良好的抑菌活性可作为潜在的天然食品防腐剂进一步研究和开发。 关键词：丁香酚；MIC；MBC；时间 - 杀菌曲线 Study on Antibacterial Activity of Eugenol in vitro LU Shi-ming1,2，CHEN Zhang-liu1,*，CHEN Jan-xin1，Qiu Dian1，LI Chun-mei1 (1.College of Veterinary, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China； 2.College of Animal Science, Guizhou Univesity, Guiyang 550025, China) Abstract ：The antibacterial activities of eugenol in vitro to 12 kinds of bacteria were tested by micro-volume broth dilution method, respectively. The results showed that the eugenol possesses the highest antibacterial activity against E.coli ATCC259 22 (MIC is 5 μg/ml and MBC is 10 μg/ml) and the lowest antibacterial Bacillus circulans (MIC is 320 μg/ml and MBC is 640 μg/ ml), and the MICs and MBCs of other bacteria are between 20 μg/ml and 80 μg/ml and between 40 μg/ml and 160 μg/ml, respectively. The time-bactericide curve indicated that the antibacterial activity of eugenol shows strong concentration dependent and slight time dependent. The eugenol with high antibacterial property is worthy to be researched as a sort of potential natural preservative substance. Key words：eugenol；MIC；MBC；time-bacteriocide curve 中图分类号：Q946.85 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)09-0122-03 目前植物源性食品防腐剂由于其纯天然、毒副作用 小，在国内外受到广泛的关注。丁香在我国的使用已经 有很长的历史。其挥发油主要成分—丁香酚(4- 烯丙基 -2- 甲氧基苯酚，engenol)具有较强的抑制细菌真菌作用[1-3]， 并且在 1 0 0℃以内对热稳定，因而可用作食品防腐保 鲜。食品中可能存在的污染菌种类较多，对环境的抵 抗力也不相同，目前尚未见有关丁香酚对多种致病菌的 MIC 和 MBC 测定报道。本实验测定了丁香酚对金色葡 萄球菌、溶血性链球菌、李氏特菌、伤寒杆菌、痢 疾杆菌等 12 种细菌的体外 MIC、MBC 及其抑菌特点。 1 材料与 1.1 材料与试剂 1.1.1 菌种 金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC6538、溶 血性链球菌(Streptococcus haemol-yticus)NICPBP32210、 单核增生李氏特菌(Listeria monocytogenes)NICPBP54002、 鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)NICPBP50115、志 贺痢疾杆菌(Shigellae dysenteriau)NICPBP51252、铜绿 假单孢杆菌(Pseudomonas aeruginos)ATCC9027 等购于广 州微生物研究所；大肠杆菌(E.coli)ATCC25922 购于中国 兽药监察所；都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)、猪 霍乱沙门氏菌(Salmonel la choleraesuis )、猪链球菌 (Streptococcus suis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、 大肠杆菌(E.coli)O54 华南农业大学兽医学院药理教研室。 1.1.2 试剂 收稿日期：2008-06-29 基金项目：广东省重点实验室建设资金资助项目 作者简介：吕世明(1963-)，男，副教授，主要从事兽医药理学及毒理学研究。E-mail：lvlvsm@163.com * 通讯作者：陈杖榴(1937-)，男，教授，主要从事兽医药理学研究。E-mail：zhlchen@scau.edu.cn ： liumeixue 高亮 liumeixue 高亮 123※基础研究 食品科学 2008, Vol. 29, No. 09 丁香酚(含量 98％，批号 200306091) 广州中南药 业公司；MH 肉汤(批号 2004061621)、MH 琼脂(批号 2004050331)、脑心浸汤(BHI)(批号 2004062371) 杭州天 和微生物研究所。 1.2 方法 1.2.1 菌种活化 从相应细菌的斜面培养基上挑起一环细菌，接种于 相应肉汤中，标记，37℃，180r/min，培养 12h，计数， 备用。 1.2.2 丁香酚的乳化 精确称取丁香酚,先加入少量无水乙醇，再加入吐 温 -20 和水(吐温和乙醇含量不超过 0.5％)，超声乳化、 定容、再次超声乳化。 1.2.3 MIC 的测定 按微量稀释法[ 4 ]测定。 1.2.4 MBC 的测定 用多点接种器从已观察MIC结果的微孔板上沾取培养 液，接种于无药 MH 琼脂或脑心浸汤琼脂平板上，37℃ 培养 24h(链球菌培养 48h)，观察结果。以无细菌生长 的最低浓度为细菌的 MBC 值。 1.2.5 丁香酚对鼠伤寒杆菌、福氏志贺杆菌的时间 - 杀 菌曲线测定 参照文献[5 ]方法。 2 结果与分析 2.1 丁香酚对 12 株菌的 MIC 和 MBC 值 丁香酚对 12 种细菌均有较好的作用，其中对质控 菌大肠杆菌 ATCC25922 的效果最好，MIC、MBC 分别 为 5μg /ml 和 10μg /ml；对蜡状芽孢杆菌的作用最弱， MIC、MBC 分别为 320μg/ml 和 640μg/ml；其次是铜绿 假单孢杆菌，MIC 和 MBC 为 320μg/ml；而对多数菌的 MIC 则处在 20～80μg/ml 之间。具体结果如表 1 所示。 2.2 丁香酚的时间 - 杀菌曲线的测定 丁香酚浓度为 0.5MIC 时，对鼠伤寒杆菌和福氏志 贺杆菌的抑制作用较弱；浓度为 1MIC 时细菌生长受到 抑制，细菌的数量随时间的延长出现先缓慢上升，再 缓慢下降而降低，但在以上浓度时，抑菌作用并不随 时间的延长而增强；当浓度超过 1MIC，则表现出杀菌 作用；4 M I C 下在 4 h 内将细菌全部杀灭，因此，丁香 酚体外抑菌作用表现为较强的浓度依赖性和较低的时间 依赖性，结果见表 2 、3 。 3 讨论与结论 3.1 具有抗菌作用的植物药在抗生素发现以前已有了 很长的使用历史，其中的香精油(有气味挥发性的植物 二级代谢产物)的抗微生物特性早在几个世纪以前已为人 们所认识，并被广泛应用于民间医药、食品调味剂和 保藏剂及香精工业。随着人们对药物在食品中残留的危 害有了更深的认识，从植物中寻找毒副作用小、安全、 不易在食品中产生有毒残留的天然保鲜剂，已成为新的 研究热点。丁香酚的资源丰富，生产成本低，并对多 种微生物有较好的抑制作用，因此是一种潜在的、很 有前途的食品添加剂。 3.2 丁香酚对金黄色葡萄球菌等 12 种细菌具有较好的 抗菌作用，以对大肠杆菌 ATCC25922(质控菌)的 MIC (5μg/ml)来看，其作用强度与氯霉素(2～8μg/ml)、氨苄 西林(2～8μg/ml)和头孢噻吩(4～16μg/ml)相近；而比磺胺 异噁唑(8～32μg/ml)好。结果比王浴生[6]报道 1∶2000～ 8000(约 135～542μg/ml)要好；蜡状芽孢杆菌可形成芽 孢，丁香酚为有机酚类，其杀菌作用可能是作用于细 菌细胞膜上的脂质和蛋白质[7]，使之发生变性而发挥抗 表 2 不同浓度丁香酚对鼠伤寒杆菌生长的影响 Table 2 Growth inhibition of S. typhimurium under different concentrations of eugenol 表 3 不同浓度丁香酚对福氏志贺杆菌生长的影响 Table 3 Growth inhibition of S. dysenteriau under different concentrations of eugenol 时间(h) 0 4 8 12 组别 对照 6.36 8.07 9.18 11.7 0.5 MIC 6.31 6.57 8.30 9.60 1 MIC 6.24 6.09 6.57 6.31 2 MIC 5.86 4.01 2.87 0 4 MIC 4.95 0 0 0 菌落数(lgCFU/ml) 时间(h) 0 4 8 12 组别 对 照 6.27 9.45 9.64 10.08 0.5MIC 6.55 8.43 9.28 9.67 1 MIC 6.31 7.09 7.38 7.78 2 MIC 5.22 3.53 2.66 0 4 MIC 4.11 0 0 0 菌落数(lgCFU/ml) 表1 丁香酚对12种细菌的 MIC 和 MBC 值 Table 1 MIC and MBC of eugenol to 12 kinds of bacteria 细菌 MIC MBC 细菌 MIC MBC (μg/ml) (μg/ml) (μg/ml) (μg/ml) 大肠杆菌 ATCC25922 5.0 10.0 金黄色葡萄球菌 40.0 80.0 大肠杆菌 O54 20.0 40.0 溶血性链球菌 40.0 80.0 鼠伤寒沙门氏菌 40.0 40.0 猪链球菌 10.0 20.0 猪霍乱沙门氏菌 10.0 20.0 李斯特菌 160.0 320.0 都柏林沙门氏菌 160.0 160.0 铜绿假单孢杆菌 320.0 0.0 福氏志贺杆菌 20.0 40.0 蜡状芽孢杆菌 320.0 640.0 2008, Vol. 29, No. 09 食品科学 ※基础研究124 菌作用的。因此，丁香酚对芽孢的作用较弱，其 M I C 和 M B C 最高。 3.3 对福氏志贺杆菌和鼠伤寒杆菌杀菌活性的测定结 果表明，高浓度的丁香酚具有较强的杀菌作用，呈现 较强的浓度依赖性和较弱的时间依赖性，因此，应用 丁香酚作为食品防腐保鲜剂使用时，应注意使用浓度， 只有达到 2MIC 以上浓度时才能发挥相应作用。此特性 未见相关报道。 尽管丁香酚具有较好的抗菌效果，但其香味可对产 品的口感产生一定的影响，从而限制了其应用的范围， 如何保持其抑菌活性，降低其气味，以扩大其应用还 需作进一步研究。 参考文献： [1] 周建新, 许华, 金浩, 等. 丁香油抑菌效果与抑菌成分的研究[J]. 食 品工业, 2000(3): 24-25. 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