蛇莓中齐墩果酸对肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用

306 中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2011年第32卷第4期 在本实验中选用了反相色谱系统，在选择色谱柱时， 比较了KromasilC18柱(250mmx4．6mm，5p,m)和 CEC—C18柱(150mm×4．6mm，5斗m)，前者他米巴 罗汀在37．136rain出峰，保留时间较长，而后者他 米巴罗汀在13．014min出峰，因此选择CEC-C。。柱。 在选择流动相时，由于C，。链在水相中不易保持伸展 状态，故流动相中有机溶剂的比例应不低于5％。 经过多次试验，选择乙腈旬．1％磷酸．甲醇(1：l：1) 为流动相，流速为1．0mL／min，检测波长为235nm。 这种色谱条件既可以使他米巴罗汀在色谱柱上有适 当的保留时间，又可以有效地消除有关物质和辅料 的影响，优于文献报道的方法旧。。试验结果表明， 采用本法测定他米巴罗汀的含量，操作简便、结果准 确可靠、重现性好、专属性强，可用于他米巴罗汀胶 囊的质量控制。 参考文献： [I]刘春燕．急性早幼粒细胞白血病的克星——全反式维甲酸 [J]．开卷有益：求医问药，2007(3)：10． [2]Kazunori0．PML—RARainhibitors(ATRA．tamibaroten，arsenic troxide)foracutepromyelocytieleukemia[J]．JpnSocClinOn· col。2007(12)：313-317． [3]王杰松，陈志哲．急性早幼粒细胞白血病的治疗现状[J]．医学 综述，2007，13(11)：838-840． [4]杨立平．他米巴罗汀药理学研究进展[J]．中华临床医学杂志， 2008，9(7)：57-60． [5]赖树清。须媚．急性早幼粒细胞性白血病治疗药——他米巴 罗汀(tamibarotene)[J]．世界I临床药物，2007，28(4)：252-253． [6]张丽华，黄仁杰．他米巴罗汀胶囊制备及其含量测定[J]．今日 药学，2010，20(10)：10—12． 蛇莓中齐墩果酸对肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用 吴英俊，王超男，刘洁婷，李洪志，袁晓环 (牡丹江医学院黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室，黑龙江牡丹江157011) 摘要：目的探讨蛇莓中齐墩果酸(OA)对人肝癌SMMC-7721细胞增值的抑制作用。方法建立人肝癌 SMMC-7721细胞体外培养模型。MTT法检测不同浓度OA对人肝癌SMMC一772l细胞的影响。结果与对照组比 较，药物组在24h对肝癌细胞具有明显的抑制作用(P<0．05)，并在48h内随着浓度的增加，抑制率增加。结论 OA对人肝癌SMMC．7721细胞的抑制作用具有时间和浓度的依赖性，OA有良好的体外抗肿瘤作用。 关键词：齐墩果酸；蛇莓；人肝癌sMMc-772l细胞；抗癌活性 中图分类号：R285．5文献标识码：A 文章编号：1005-1678(2011)04-03064)3 TheeffectofoleanolicacidintheHerbaDuchesneseindicae onSMMC-7721 cellsline WUYing-jun，WANGChao—nan，LIUJie-ting，LiHong-zhi，YUANXiao-huan (HeilongjiangKeyLaboratoryofAnti-fibrosisBiotherapy，MudanjiangMedicalCollege， Mudanjiang157011，China) Abstract：PurposeTostudytheeffectofoleanolicacid(OA)intheHerbaDuchesneseindicaeon SMMC．772lcellsline．MethodsCulturemodeinvitrowasestablishedwithSMMC-7721ceilsline．The effectofOAOnsurvivorofSMMC-7721cellswasobservedbyMTTassay．ResultsComparedwithcontrol 收稿日期：2010-12-2≯ 基金项目：黑龙江看卫生厅项目(2007-006) 作者简介：吴英俊．男，从事药学研究；袁晓环。女，通信作者， 教授，从事药物分析及天然药物开发研究工作，Tel：0453-6582647， Email：yuanxiaohuani969@163．corn。 万方数据 中国生化药物杂志ChineseJourna]ofBioehemicalPharmaeeuti‘．s2011年第32卷第4期 307 group，theOAgrouphastheinhibitioneffectonSMMC-7721 cellsin24h(P<0．05)，andplayaroleof inhibitionproliferationobviouslyin48h，withtheinhibitionraterisingwithOAincreasing． ConclusionWeobserveddose．-dependentinhibitionandtime．-dependentinhibitionofSMMC-7721cells byOA．ItisshownthatOAhasagoodanti—canceractivityinvitro． Keywords：oleanolicacid；Duchesneseindicae；SMMC-7721cells；anti—canceractivity 蛇莓[Duchesneaindicae(Andr)Focke]为蔷薇科 蛇莓属植物，在我国绝大部分区域包括东部、中部、 南部和西南都有广泛分布⋯。具有清热解毒、消肿 散瘀，收敛止血、凉血之功效，现代药理研究表明蛇 莓具有较强的抗癌活性旧引，已从蛇莓中分离得到的 化合物主要有三萜及其苷类、香豆素类、黄酮类、甾 醇类等”剖，其中的齐墩果酸(oleanolic，OA)为五环 三萜类天然化合物，其毒性很低，具有抗病毒、消炎、 双向调节、抑制血小板凝集、降血脂、降血糖、保肝、 护肾和抗艾滋病病毒等作用。临床上OA主要用于 治疗急性黄痘型和慢性中毒型肝炎，并作为抗癌辅 助药物∞1。但其作用机制还不清楚。本实验用四 甲基偶氮唑盐(MTT)法检测OA对人肝癌SMMC- 7721细胞的抑制作用，为揭示蛇莓中OA的抗肿瘤 作用提供依据。 1 材料 人肝癌SMMC一7721细胞，哈尔滨医科大学赠 送；中药蛇莓饮片(090307／05)，哈尔滨市盛泰中药 饮片加工厂；OA对照品(110709-200905)，中国药品 生物制品检定所；胎牛血清，杭州四季青公司；MTT、 二甲基亚砜(DMSO)，Sigma公司；RPMI1640培养 基，Gibco公司。 Bio．Rad550酶标仪，美国Bio—Rad公司；MCO． 15AC二氧化碳培养箱，三洋公司；KQ-500DE超声 波清洗器，昆山市超声仪器公司；IX70—142倒置式 生物显微镜，日本奥林巴斯。 2方法与结果 2．1 SMMC-7721细胞培养 采用RPMI1640培养基，含有10％胎牛血清， 100u／mL青霉素，100u／mL链霉素，常规细胞培 养，隔天换液，每周传代1次。取对数生长期的 SMMC-7721细胞，计数后以1×105的密度接种于 96孔板，每孔100¨L，培养24h后用于实验。试验 设3次重复，每组4孔。 2．2 药物配制 取蛇莓干燥全草600g粉碎，按一定料液比，加 入95％的乙醇溶液，浸泡过夜，过滤，然后用等体积 石油醚萃取3次，萃取后的原料液水浴加热浓缩至 干，得OA提取物0．58g，4oC冰箱保存备用。高效 液相色谱法"1测得提取物OA含量为94．5％。 ’ 用含有10％胎牛血清，100u／mL青霉素，100 u／mL链霉素的RPMI1640培养液溶解OA提取物， 配制成浓度为80l乩g／mL的原液，一20℃储存。使 用时用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基稀释， 配制成终浓度为20，40，80¨g／mL的使用液。 2．3 OA提取液对sMMC-7721细胞增值抑制作用 的形态学观察 实验设对照组、OA对照品组(40斗g／mL)和低、 中、高3个剂量(20，40，80斗g／mL)OA提取液组。 各组细胞培养液中RPMI1640的终浓度约为 0．05％。取对数期的人肝癌SMMC-7721细胞株用 磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍后，每瓶用0．25％胰 酶溶液500IxL消化，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液制成单细胞悬液，计数调节细胞为3．5 ×105／mL，于96孑L培养板中，每孔加入单细胞悬液 300斗L。2h后，细胞贴壁后将培养基吸出，对照组 加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养液270斗L， 低、中、高剂量组加入浓度分别为20，40，80斗s／mL的 OA提取液270斗I／孔。每组均设3个复孔，放入CO： 培养箱中培养分别培养24h。观察细胞增殖情况。 OA对SMMC-7721细胞增值抑制作用见图1。 与对照组人肝癌SMMC-7721，细胞膜完整，细胞轮 廓清楚，形态饱满，细胞核大且呈深色，近似圆形透 亮。药物组，细胞呈不形状，并有尖端突起，细 胞核呈深褐色，可见白色圆形凋亡细胞，漂浮于培养 基表面，且随着药物浓度的增加，活细胞数量减少。 2．4 OA提取液对SMMC-7721细胞增值抑制作用 的浓度依赖性实验 按2．3项下方法培养细胞和分组，每组均设3 个复孔，放入CO：培养箱中培养分别培养24h。每 ：fLail入5mg／mLMTT溶液30斗L，放回CO：培养 箱，2h后将孔内液体吸走，每孔再加入DMSO150 ixL，振荡10min。用酶标仪在波长450nm处测定 吸光度(A)值。细胞抑制率=l一(A加药／A对照)× 100％，实验重复2次。测定OA对人肝癌SMMC． 7721细胞的增值抑制率。结果见表l。 万方数据 308 ‘}l吲生化药物杂忐ChineseJoumat“BiochemicalPha珊aceuties20t1年第32卷第4娟 —硇 甄习随嘲簿F●龇燃怒i蟹a AW月m．B—nnⅢ～OA#m№204080“∥mLm．EOAH月n自【 ^Contml舯“P；B-DOA20．40．80lL∥mLgnmp”spcclively，EOAslandanlR胁p 圉1 蛇毒巾齐墩果酸对人肝癌SMMC·772I细胞的影响作用 FigI EffectsofOAinDw^#⋯indicaeacIonSMblC-772】eells 表1 24hOA埘人肝癌SMMC-7721细胞抑制作用(；±s，n3讨论 =3) Tab1 InhibitoryelfeelofOAonSMMC-7721cellsprolifera— tionin24h(；±sn=3) j*月H目＆#：4P‘005‘P(00I Compandwithcon[mlgwup-。P(O052Pc0OI 2．5 OA提取液对SMMC-7721细胞增值抑制作用 的时间依赖性实验 按23项下方法培养细胞，选择中剂繁药物组， 设3个复孔，放入CO：培养箱中分别培养12，24，48 h。每扎加人5mg／mLMTT溶液30“L，放回CO： 培养箱，2h后将孔内液体吸走．每孔再加人DMSO 150“【．，振荡10min。用酶标仪在渡长450Bm处铡 定^值，并计算抑制牢，结果见表2。 表2 OA不同时间对人肝癌5MMC-7721细胞抑制作用(； ±5Ⅱ=31 OA提取液对SMMC-772I细胞增值抑制作用的 形态学脱察试验中，实验各组加药后，我们分别用台 盼蓝染色．混匀后镜F舰察．没有发现细胞坐蓝，细 胞膜完整，细胞为正常细胞或凋亡细胞，说明OA提 取液对SMMC·7721细胞没有细胞毒作用，『『1f是抑制 作用。但其抑制作用机制不甚清楚，有待进一步 研究。 在作用24h时，OA对人肝癌SMMC-7721细胞 的抑制作用随着OA浓度的增加而增加，20¨异／mL 时对人肝癌SMMC-7721细胞有抑制作用．但不明 显，40和80¨g／mL时有明硅的抑制作用，80pg／mL 时细胞的存活率很低。OA对人肝癌SMMC．772l细 胞抑制作用具有时间依赖性，40“g／mL在12h时 没有表现抑制作用，细胞还是表现为增殖，可能是时 间较短，药物作用没有发挥出来，具体原因需要进一 步探讨，24h时抑制率达到50％，48h存括率很低． 说明蛇莓中OA对人肝痛SMMC·7721细胞增殖有 明显的抑制作用。 参考文献： fj]n##Ⅸ々％十药^#弗【M]FⅢL*：±*H＆H{＆ #，1985：2lj Tab2 1Ⅲ晌。q。雎‘1。!oA祁⋯5””6’7721。。帅”1订'[21&*“，Ⅻm}淳鬻#莓抗*Ⅻ怍月*￡⋯中药自4 emlionindifferenlperiod(⋯．n=3) ’j#《．1998．14(3)：28 组w??，。装。， ‰ 翟” 对照组 12 —0223±0001 —4 24 —0789±0008 — 48 — 1 132±0013 一 【3 OA组 12 40 0402±0005 —8027 24 40 0395±O005。 5006 【o 48 40 0104±00081 9081—————————————————————————————————————————_- bⅣ月a＆#。P‘005．2P<0OI 【’ Comparedwithconl∞lg”“p：1P‘005。P(0OI ＆ 琳．*m女．Hm等《莓z醇捱m#∞镕*抗*nⅫ ⅡE【J]毕十##^学}推：Ⅸ々Ⅸ．2009．38(4)481485 许z束．林口i目H，等《莓的化学成分【j]％拜1*辩^ {fm，2007．24(7)：402_406 *i球．林4R目悻，等《莓黄目*娄化}成分研MJ】 十目§{》{．2007．42{13)：98l-983 f∞t，*№m＆ⅢA*m＆[J】*津药{，200315(3)：56 58 直晓Ⅱ．t伟№，}春g，等HPLC☆橹月#《十*№*№∞ 自射】j十目±化自翱女女．2010．3I(3)195197 万方数据 蛇莓中齐墩果酸对肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用 作者： 吴英俊， 王超男， 刘洁婷， 李洪志， 袁晓环， WU Ying-jun， WANG Chao-nan， LIU Jie-ting， Li Hong-zhi， YUAN Xiao-huan 作者单位： 牡丹江医学院黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室,黑龙江牡丹江,157011 刊名： 中国生化药物杂志 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF BIOCHEMICAL PHARMACEUTICS 年，卷(期)： 2011,32(4) 参考文献(7条) 1.袁晓环;王伟光;李春彦 HPLC法检测蛇莓中齐墩果酸的含量 2010(03) 2.许文东;林厚文;邱峰 蛇莓黄酮苷类化学成分研究 2007(13) 3.许文东;林厚文;邱峰 蛇莓的化学成分 2007(07) 4.庞然;张淑玲;赵雷 蛇莓乙醇提取物的体外抗炎机制研究 2009(04) 5.段泾云;刘小平;李秦 蛇莓抗肿瘤作用研究 1998(03) 6.江苏新医学院 中药大辞典 1985 7.王德仁 齐墩果酸研究新进展 2003(03) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgshywzz201104016.aspx