运用MLPA技术结合DNA_cDNA测序对DMD和SMA患者及高致病风险胎儿进行基因诊断

广州医学院 硕士学位论文 运用MLPA技术结合DNA/cDNA测序对DMD和SMA患者及高致病风险 胎儿进行基因诊断 姓名：古艳 申请学位级别：硕士 专业：妇产学 指导教师：谢建生 20100501 广州医学院硕士学位论文 1 摘 要 目的：探讨多重连接依赖探针扩增（Multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA）技术结合 DNA 和 cDNA 测序对杜氏肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy，DMD)和脊髓性肌萎缩（Spinal muscular atrophy, SMA）患者及携 带者基因检测的临床应用价值，并在此基础上研究MLPA技术对家系中高致病风险胎 儿进行产前基因诊断的临床应用，为进一步创建稳定可靠的 DMD 和 SMA 产前诊断 技术平台奠定基础。 方法：运用MLPA技术对 2008年 2月至 2010年 4月来深圳市儿童医院儿科研究所 及我院就诊的 32个 DMD家系中现存 41例 DMD患者、29例女性可能携带者、6例家 系中健康男性成员、10例女性健康对照和 10例男性健康对照共 96人采集外周血提取基 因组 DNA，运用 MLPA技术对以上 96人的 DMD基因 79个外显子进行分析；并于患 者行病理活检术时取右侧腓肠肌 10-30mg 肌肉组织提取 RNA，逆转录成 cDNA；根据 研究需要选择性进行 DNA及 cDNA序列测定，验证MLPA检测结果的可靠性；同期， 对 22例 SMA患者及双亲 39人，并选择与患者无血缘关系、否认遗传病家族史的正常 男性和女性对照各 15人共 91人进行运动神经元生存基因（survival motor neuron gene， SMN）检测，用聚合酶链反应结合限制性内切酶片段长度多态性技术（Polymerase Chain Reaction restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）和 DNA测序技术对MLPA 检测结果进行验证。在此基础上，对 2个 DMD和 1个 SMA产前诊断家系中具有高患 病风险的 3 个胎儿于 16-22 孕周经羊膜腔穿刺术抽取羊水，提取胎儿羊水 DNA，采用 MLPA技术并结合 DNA测序技术对胎儿进行产前基因诊断。 结果：MLPA检测32个DMD家系中现存41例患者，其中男性患者39例，女性患者2 例。39例男性患者中外显子缺失27例（69.23%），外显子重复3例（7.69%），余9例未 检测到外显子缺失和重复（23.08%）。27例外显子缺失的患者中有24例缺失范围在外显 子42～55热点区域，7例缺失范围在外显子9～22热点区域，其中患者10和患者19～21其 缺失外显子范围较大包含了以上的两个突变热点区域。2例女性患者MLPA图谱分别为外 显子47～50和外显子35信号比正常女性明显降低，似女性携带者，其突变外显子信号峰 广州医学院硕士学位论文 2 值比正常对照显著降低。结合其临床现推测可能在另一条X染色体的DMD基因同时存 在点突变。在外显子缺失及重复家系中接受检测的29例女性可能携带者中检测出18例为 外显子缺失携带者，2例为外显子重复携带者，其MLPA图谱中外显子峰信号降低及增高 的位置与先证者外显子缺失或重复位置一致；余9例未检测到信号异常。对于4例外显子 缺失的患儿母亲，未检测到相应外显子信号异常，推测其患儿可能为新发突变。DMD 产前诊断家系1中IV2女性胎儿，MLPA结果为DMD致病基因携带者。家系2中V3男性胎 儿MLPA结果显示无DMD基因Exon43缺失，并经羊水DNA测序结果证实了DMD基因 Exon43存在，胎儿已出生，肌酶检测及基因检测均无异常。 MLPA检测22例SMA患者中16例为SMN1的外显子7和外显子8缺失纯合子，6例为 SMN1外显子7缺失纯合子；39名双亲的SMN1外显子7的信号值均明显比正常对照组平 均信号值低30%～50%。PCR-RFLP和DNA测序技术支持MLPA有关SMN基因检测结果。 SMA产前诊断家系先证者为SMN1外显子7合并外显子8缺失纯合子，胎儿和先证者基因 突变类型相同，患儿已引产，其脐带血DNA检测结果与羊水诊断结果一致。 结论： MLPA技术能简便、快速、有效地检测DMD和SMA所有外显子的缺失与重 复，结合DNA和cDNA测序技术能对患者及携带者进行可靠的基因诊断，并在此基础上 对家系中具有高致病风险的胎儿进行有效的产前基因诊断。MLPA技术结合DNA和 cDNA测序在对DMD和SMA的基因诊断和产前基因诊断中具有较高的临床实际应用价 值。 关键词：杜氏肌营养不良症；脊髓性肌萎缩；多重连接依赖探针扩增技术；基因诊 断；产前基因诊断 广州医学院硕士学位论文 3 ABSTRACT Objective: To perform gene diagnosis for the families of the Duchenne muscular dystrophy and Spinal muscular atrophy using multiplex ligation-dependent probe amplification technique (MLPA) combined with DNA and cDNA sequencing. Moreover, to study the clinical applicable value of MLPA technique in gene diagnosis and Prenatal diagnosis of the DMD and SMA，which is in order to creating a reliable prenatal diagnosis technical platform. Methods: Genomic DNA of the peripheral blood and fetal amniotic fluid cells was extracted from the pedigrees' members with DMD and SMA. RNA was extracted from the bioptic muscle of the DMD pateients and was reversed transcription to cDNA. Gene diagnosis was performed for these DMD and SMA pedigrees' members using SALSA MLPA kit P034 /P035 and SALSA MLPA kit P021 /P060 respectively. There were 96 individuals accepted the DMD gene diagnosis, including 41 patients, 29 possible carrier and 6 healthy men in 32 DMD families. 91 individuals including 22 probands and 39 carriers were detected the SMA gene in 22 families.The mutations were detected by MLPA combined with DNA and/or cDNA sequence technique in DMD and combined with DNA sequencing and PCR-RFLP in SMA. Simultaneously, the diagnostic effectiveness of the methods used in detecting DMD and SMA gene mutation was evaluated. Prenatal gene diagnosis was successfully performed for 2 fetuses with risk of DMD and 1 fetu with risk of SMA in three families . Results： DMD gene mutations were screened by MLPA technique in 39 male and 2 female patients, showing the analysis results as follows：exons deletion were found in 27(69.23%,27/39) patients ; exons duplication were found in 3（7.69%,3/39）patients；No exon deletion or duplification could be detected in 9（23.08%,9/39）patients. Lower MLPA signals of exon 47-50 from one female patient and exon 35 from another female patient were observed. MLPA pictures of the two female patients were similar to that of carrier and the signals of the involved exons were apparently lower than ones of healthy women. Among 29 possible carrier 20 were detected to be DMD carriers, including 18 exon deletion and 2 exon duplication carriers. Moreover MLPA analysis and PCR-RFLP plus DNA sequencing showed that 16 patients with SMA presented homozygous deletion of exon7 and exon 8 of SMN1. The other 6 patients were SMN1 exon7 homozygous deletion. All the 39 parents were 广州医学院硕士学位论文 4 detected to be heterozygotes of deletion of SMN1 exon 7. Their average signal of SMN1 exon7 was lower 30~50% than the average of the control group. Two DMD carrier’s pregnant women were performed prenatal gene diagnosis.One of their fetuses was DMD carrier and another was found no exon deletion. One fetus of SMA carrier’s pregnant woman was the SMN1 exon7 and exon8 homozygous deletion. The result of prenatal gene diagnosis was confirmed after birth or abortion of the fetuses. Conclution：MLPA provides a simple，rapid and reliable method of simultaneously detecting homozygous，heterozygous deletions mutation in one reaction for all exons of DMD and SMA gene. Combined with DNA and cDNA seqeuencing, it could applied into clinical gene diagnosis and prenatal diagnosis for patients and fetuses with DMD and SMA. Key Words: Duchenne muscular dystrophy（DMD）; Spinal muscular atrophy (SMA) Multiple ligation-dependent probe amplification （MLPA）; Gene diagnosis; Prenatal gene diagnosis 关于学位论文使用授权的说明 45 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所 取得的成果。文中依法引用他人的成果、对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均 已在文中做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式 的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。 本人如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果： 1．交回学校授予的学位证书； 2．学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报； 3．本人按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开 道歉。 4．本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。 论文作者签名： 古 艳 日期： 2010 年 4 月 30 日 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属广州医学院及附 属单位。广州医学院及附属单位享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果 时，署名单位仍然为广州医学院及附属单位。任何其他收存和保管本论文的单位和个人， 未经本论文作者、导师授权，不得将本论文转借他人、复制、抄录或以其他任何方式传 播，否则，引起有碍作者的著作权益问题，将会追究相应的法律责任。 论文作者签名： 古 艳 日期： 2010 年 4 月 30 日 导 师 签 名 ： 谢建生 日期： 2010 年 4 月 30 日 关于学位论文使用授权的说明 1、学校可以保留本论文的原件及复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影 印、缩印或扫描等复印手段保存、汇编学位论文； 2、本人授权学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅。 论文作者签名： 古 艳 日期： 2010 年 4 月 30 日 导 师 签 名 ： 谢建生 日期： 2010 年 4 月 30 日 广州医学院硕士学位论文 5 前 言 DMD和 SMA是临床上最常见的两种致残致死性的遗传性神经肌肉病。DMD是一 种 X连锁隐性遗传病，在活产男婴中的发病率为 1/3 500，患者一般于 2～5岁发病，主 要表现为全身骨骼肌进行性无力、萎缩和腓肠肌假性肥大，故又称为假性肥大性肌营养 不良，并随着病情加重，20岁左右死于呼吸衰竭[1]。DMD由人类 Dystrophin 基因突变 引起，该基因定位于 Xp21.1-3，DNA全长为 2.4Mb，RNA全长为 14.2Kb，含有 79个 外显子，是目前发现的人类最大的基因[2]。女性携带者一般无症状，其生育的男胎有 1/2 概率是患儿，女胎有 1/2概率是致病基因携带者。SMA是一种常染色体隐性遗传病，以 脊髓前角运动神经元退化变性为特征，表现为进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉无力、 瘫痪和萎缩。导致 SMA发病的决定性基因 SMN位于染色体 5ql1.2～l3.3区域，在 1条 染色体上有 SMN1 和 SMN2 基因，两基因均由 8 个外显子和 7 个内含子构成，全长只 有 5个碱基差异（图 16），SMN1是主要致病基因[3、4]。白种人群中的发病率为 1/16000～ 1/10000 个活产婴儿，自然人群中致病基因携带率为 1/40～1/60，我国南部正常人群此 病的携带率约 1/60【5-7】。临床上主要依靠病史、临床表现、肌电图及肌肉活检组织化学 染色等诊断该病，但因病理生理机制还不十分清楚且其临床表现变异性大，以致难确诊 及易误诊。 因这两种遗传病目前均无有效的治疗方法，所以检出携带者及对胎儿进行产前基因 诊断是有效控制致病基因传递、防止患儿出生及降低发病率的主要措施。本研究中运用 MLPA技术对DMD和SMA患者进行快速的基因诊断，并对DMD先证者进行肌肉组织 cDNA测序和SMA先证者进行DNA测序，核实先证者的基因诊断，这对于胎儿进行产前 基因诊断具有非常重要的临床意义。国内同行一直致力于以上两种疾病基因诊断研究， 但对于高致病风险胎儿的产前基因诊断仍无很好的方法。其原因主要是患儿常选择儿童 医院或儿科就诊，而产科或产前诊断机构很少接触此类病种，研究条件客观受到限制， 在产前基因诊断这一领域一直未很好地开拓。因此，本研究不仅研究患者、携带者的基 因诊断，也试图探讨具有临床应用价值的DMD和SMA产前诊断流程，旨在建立高效、 稳定、可行的遗传性神经肌肉病产前诊断技术平台。 广州医学院硕士学位论文 6 1. 材 料 1.1 临床资料 本研究中的 32个 DMD家系及 22个 SMA家系成员于 2008年 2月至 2010年 4月 来深圳市儿童医院儿科研究所及我院遗传优生门诊就诊，其中实施产前诊断的 2个DMD 家系和 1个 SMA家系因先证者父母具有优生需求来我院。以上家系中先证者均进行了 肌电图及肌酶检测，DMD 先证者有进行性行走和上楼梯困难、下肢无力、鸭步步态、 腓肠肌肥大伴其它部位的肌肉萎缩等临床表现，血清 ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草 转氨酶）、LHD（乳酸脱氢酶）、CPK（肌酸磷酸激酶）等显著增高，肌电图和神经传 导速度检查呈肌源性损害；SMA 先证者肌力减退、肌电图表现为神经源性损害、肌酶 不增高或稍有增高。 产前诊断DMD家系1（图1）由先证者的外祖父II1 将致病基因遗传给先证者IV1且 具有遗传早现表现的一少见的家系。患者II1 、II3 和II6 的发病年龄在30～35岁，现年龄 分别为69岁、67岁和58岁，为迟发型患者。先证者IV1现年9岁，于2-5岁发病，发病年龄 明显提前，其母亲III2为致病基因携带者。四位患者实验室检查：血清ALT、AST、LHD、 CPK 等均增高。DMD家系2（图2）椐回顾性家系调查，有症状类似者共8位，均为男性， 6位已逝，起病均在年龄2～5岁，病逝年龄在11～23岁。先证者V1和V2分别为16岁和8 岁，V1体检时呈现肢体严重挛缩畸形，全身肌肉重度萎缩，恶异质体质，身长约1.71米， 体重36.8Kg，听诊心音低钝、两肺吸呼音减弱，四肢力1级，目前已丧失行走能力。 本研究中的 22例 SMA患者，男性 12例，女性 10例，按国际 SMA联合会制定的 诊断[8]诊断为 SMA I型 6例、II型 6例、III型 10例。22例患者为病例组，双亲 39 人为致病基因携带者组，另选择与患者无血缘关系、否认遗传病家族史的健康体检的正 常人 30名作为正常对照组。此外，SMA产前诊断家系（图 3）中男性先证者于 8月龄 死于呼吸衰竭合并呼吸道感染，患者去世前已经明确了基因诊断。本研究在明确先证者 及其父母亲的基因诊断基础上对胎儿进行产前基因诊断。 广州医学院硕士学位论文 7 图1 DMD 产前诊断家系1 图2 DMD 产前诊断家系2 图3 SMA 产前诊断家系 已逝男性患者； 已逝女性携带者； 女性携带者； 男性患者； 正常男性； 正常女性 1.2 标本提取 1.2.1 外周血标本DNA提取 采集32个DMD家系中现存41例DMD患者、29例女性可能 广州医学院硕士学位论文 8 携带者、6例家系中健康男性成员、无血缘关系的10例女性健康对照和10例男性健康对 照共96人外周静脉血，肝素钠抗凝；采集22例SMA患者、双亲39人及无血缘关系的正常 对照组男性和女性各15人共计91人的外周静脉血。常规酚氯法提取基因组DNA，DU800 紫外分光仪（Beckman，美国）测定DNA浓度，-70保存备用。 1.2.2 羊水标本DNA提取 DMD产前诊断家系胎儿经B超鉴定性别，胎儿在孕16-22周 经腹羊膜穿刺术抽取20～30ml羊水；SMA产前诊断家系胎儿于孕16-22周经腹羊膜穿刺 术抽取20～30ml羊水。取其中15ml羊水用常规酚氯法提取胎儿基因组DNA，剩余15ml 离心后取沉淀行羊水细胞培养，进行胎儿羊水细胞遗传学分析。 1.2.3 DMD先证者肌肉组织RNA提取及逆转录 选择右侧腓肠肌中段，取绿豆大小肌 肉进行病理活检和免疫组化检测，同时取10-20mg肌肉匀浆后用TRIzol(Invitrogen公司， 美国)法提取RNA。由于DMD患者肌肉病变萎缩，有较多脂肪组织增生代偿，提取RNA 时应小心吸弃上层漂浮的脂肪组织，以减少对RNA质量的影响。用无RNA酶的纯水溶解 RNA，IMVV逆转录酶（MBI公司，美国）逆转录成cDNA，-70保存备用。 广州医学院硕士学位论文 9 2. 方 法 2.1 MLPA技术进行DMD和SMN基因分析 运用P034和P035（MRC-Holland公司，荷 兰）分析DMD基因的79个外显子，P021分析SMA患者及可能携带者SMN1和SMN2基因； 与此同时，为核实P021对携带者的诊断，运用P060对携带者进行复核检测。MLPA具体 实验操作如下：①取基因组DNA 400ng补双蒸水至2.5ul，98℃变性10min，降温至25℃ 时加入1.5ul探针混合物于室温下仔细混匀，然后60℃杂交16h。②待PCR仪降温至54℃ 加入16ul 含ligase-65连接酶的混合物进行连接反应，54℃，15min，然后加热至98 ℃灭 活连接酶5 min，得到MLPA连接产物。③准备新的PCR管每孔加15ul PCR 缓冲液，取 2中生成的连接产物5ul加入每管中混匀，并放入PCR仪加热至60 ℃，每管再加5µl DNA聚合酶混合物，充分混匀后共25ul体系进行PCR扩增。扩增条件：95℃变性5min， 95℃ 30s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，共33～35个循环，最后72℃孵育20 min。④PCR产物检 测：取1.2～1.6 µl PCR产物，与20µl甲酰胺充分混匀，小心吸至96孔板内PCR产物，用 CEQ 8000遗传分析仪（Beckman公司，美国）进行毛细管电泳分析，生成MLPA图谱。 毛细管温度为50℃；变性温度90℃，变性时间120 s；毛细管吸样针取样压力2.0 KV，30s； 4.8KV运行60 min。⑤MLPA图谱分析：CEQ8000遗传分析仪收集荧光信号并自动生成 MLPA图谱。运用CEQ 8000遗传分析仪Fragment模块及coffalyser软件（MRC-Holland公 司，荷兰）分析MLPA图谱数据，比较DMD和SMA患者、双亲、家系中可能携带者及正 常对照的各个外显子的信号峰高，以此判断DMD和SMN基因外显子缺失、重复情况。 2.2 GAPdh内参及 DMD基因的 Gap-PCR 选择管家基因 GAPdh为 PCR内参， 正、反向引物，以检测肌肉 cDNA 的质量及 PCR 扩增效果。对 DMD 基因外显子半合 子缺失的先证者，以 cDNA 为模板，运用 Primer5 分别设计正、反向引物，进行跨越 DMD 基因缺失的外显子断裂点的 Gap-PCR。引物序列及扩增产物长度见表 1，引物委 托上海生工合成。扩增产物进行 2%琼脂糖凝胶电泳，紫外成像系统分析结果。 2.3 cDNA测序检测 DMD基因外显子 根据MLPA提示外显子缺失的部位，在 DMD 基因 cDNA序列中选择缺失部位两侧的外显子序列设计正向和反向引物，进行跨越断裂 广州医学院硕士学位论文 10 点 PCR扩增。DMD家系 1患者缺失 Exon50，则在 DMD基因 cDNA序列中跨越 Exon50 设计一对引物（E48 F和 E51 R）；家系 2患者缺失 Exon43，则分别在 Exon42 和 Exon45 序列内设计 E42 F和 E45 R引物，常规 PCR体系进行扩增。扩增产物进行 2%琼脂糖凝 胶电泳，切胶纯化并以回收的 PCR产物为模板，进行测序反应。 2.4 DNA测序检测胎儿 DMD基因 经超声性别检查，家系 1胎儿为女性，有 DMD 致病基因携带风险，家系 2胎儿为男性，有患 DMD风险，经知情同意进行产前基因诊 断。根据MLPA对家系中先证者及胎儿的基因检测结果，选择家系中先证者所缺失外显 子附近的 DNA序列设计引物（表 1），胎儿羊水标本扩增产物行 DNA测序。本研究中 DMD产前诊断家系 2先证者缺失 Exon43，则在 Intro43和 Intro44的序列上分别设计引 物 In43 F和 In44 R。常规 PCR体系扩增，产物于 2%琼脂糖电泳，以切胶纯化的回收产 物为模板，进行测序检测胎儿基因。 表 1 Gap-PCR引物及扩增条件 分子水平 引物名称 引 物 序 列 退火℃ 长度 bp DNA DMD In43 F 5'–GATACAGAAGCCAAATGAAG–3' DNA DMD In44 R 5'–ATCTGATTTACGATTACCTGA–3' 55 691 cDNA DMD E42 F 5'– CTTATGTGCCTTCTACTTATTTGAC–3' cDNA DMD E45 R 5' –CATCTGTTTTGAGGATTGCT–3' 57 552 cDNA DMD E48 F 5' –AGTTAAAT CATCTGCTGCTGTG–3' cDNA DMD E51R 5'–- TCGGTAAGTTCTGTCCAAGC–3' 55 446 cDNA GAPdh F 5'–CGGGAAGCTTGTCATCAATGG–3' cDNA GAPdh R 5'–GGCAGTGATGGCATGGACTG –3' 57 350 DNA SMN E7F 5′-AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA-3′ DNA SMN E7R* 5′-CCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTTT-3′ 54 187 DNA SMN E7R 5′-CCTTCCTTCTTTTTGATTTTG-3′ 55 DNA SMN E8F 5′-GTAATAACCAAATGCAATGTGAA-3′ DNA SMN E8R 5′-CTACAACACCCTTCTCACAG -3′ 57 189 注：In:Intron 内含子; E:Exon 外显子； 2.5 PCR－RFLP对SMN基因分析 设计引物7F和7R*构建SMN基因第7外显子一个错 配位点，从而使PCR产物能被内切酶DraI识别和酶切；引物8F和8R扩增SMN基因外显子 8，选择内切酶DdeI进行酶切。常规PCR反应体系30ul，反应条件为94℃，5min；95℃变 性30s，外显子7 55℃退火30s，外显子8 60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后 广州医学院硕士学位论文 11 72℃，8min。RFLP酶切体系25ul，其中10×Buffer 2ul，牛血清蛋白0.2ul，PCR扩增产物 12ul，外显子7扩增产物中加入DraI 7U，外显子8扩增产物加入DdeI 7U，37℃酶切反应 3h。终止酶切后，取15ul PCR扩增产物在2.5%~4％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像分析 系统观察记录结果。 2.6 DNA测序检测 SMA先证者、携带者及胎儿 SMN基因突变 用正向引物 E7 F和 反向引物 E7 R扩增 SMN1和 SMN2基因的第 7外显子，正向引物 E8 F和反向引物 E8 R 扩增 SMN1和 SMN2基因的第 8外显子。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，以切胶纯化的 回收产物为模板，进行测序反应。运用遗传分析仪 CEQ8000进行碱基序列测定。 2.7数据分析 2.7.1 携带者分析 首先分析比较同一家系可能携带者与先证者的MLPA图谱中各外显 子信号高度。理论上致病基因携带者因缺失一个外显子拷贝其相应外显子高度应低于正 常同性对照的 50%，反之外显子重复则其高度应高约 50%。不能排除携带可能性则进一 步计算外显子信号相对峰高值（relative peak height，RPH）[9-10]，分析是否为致病基因 携带者。理论上正常人的 SMN1第 7外显子有父源和母源两个拷贝，而 SMA致病基因 携带者因 SMN1基因缺失了一个拷贝，其相应的的 RPH应比正常健康对照组的 RPH低 约 50%。 2.7.2 MLPA外显子信号的 RPH分析 ①计算外显子扩增片段的标准化峰高，等于样本 中单个外显子扩增片段峰高/该样本所有扩增片段的总峰高所得相对比值；②计算可能携 带者样本相应外显子的相对峰高值，等于可能携带者样本的相应外显子的标准化峰高/ 对照组所有样本相应外显子的平均标准化峰高。经过以上①、②两个计算步骤得到相应 外显子的 RPH。 广州医学院硕士学位论文 12 3. 结 果 3.1 MLPA检测DMD结果 MLPA检测32个DMD家系中现存41例患者DMD基因，其 中男性患者39例，女性患者2例。39例男性患者中外显子缺失者27例（69.23%），3例为 外显子重复（7.69%），余9例未检测到外显子缺失（23.08%）。27例外显子缺失的患者 中有24例缺失范围在外显子42～55区间，余7例缺失范围在外显子9～22区间，其中患者 10、19、20、21其缺失外显子范围跨越了以上的两个突变热点区域。2例女性患者MLPA 图谱分别为外显子47～50和35信号明显降低，似女性携带者，结合其临床表现推测可能 在别一条X染色体的DMD基因同时存在点突变。在外显子缺失或重复家系中接受检测的 29例女性可能携带者，18例为外显子缺失携带者，2例为外显子重复携带者。携带者外 显子改变与先证者外显子缺失或重复情况一致；余9例未检测到信号异常。对于4例外显 子缺失的患儿母亲，未检测到相应外显子信号异常，推测其4例患儿可能为新发突变。 结果见表2。 3.2 DMD产前诊断家系的患者、携带者及胎儿MLPA检测结果 家系1中II1 、II3 、II6 、 IV1四例患者均为DMD基因Exon50缺失（图4），女性胎儿IV2检测结果与其母亲相同， 其Exon50处信号比家系中正常女性及健康女性对照的信号低约50%（图5），故认为该 胎儿可能为DMD基因Exon50缺失携带者。家系2中V1 和V2两位患者P034检测图谱中 218bp缺失提示DMD基因Exon43缺失（图6）；III1、IV1 、IV2、和IV4均为携带者，其218bp 处信号比家系中正常女性及健康女性对照的信号低约50%（图7）；男性胎儿V3 其MLPA 检测结果未见相应外显子缺失（图8）。 图4 DMD家系1中IV1，P034检测Exon50处信号缺失 广州医学院硕士学位论文 13 图5 DMD家系1中IV2，P034检测Exon50处信号比正常女性对照低约50% 图6 DMD家系2的V1 P034缺失218bp（箭头所示）提示Exon43缺失 图7 DMD家系2中IV2 P034中218bp信号比正常者降低约50% 图8 DMD家系2胎儿V3 P034 检测未见外显子缺失 3.3 DMD产前诊断家系的先证者cDNA和胎儿羊水DNA序列检测结果 家系1患者IV1， 由引物E48 F和E51 R扩增cDNA片段为模板进行测序反应，结果见Exon49和Exon51拼接 广州医学院硕士学位论文 14 （图9），Exon50序列缺失。家系2患者V2 ，由引物E42 F和E45 R扩增的cDNA片段为模 板进行测序反应，结果见Exon42和Exon44拼接，未见Exon43碱基序列（图10）。家系2 男性胎儿V3的DNA测序结果为DMD基因Exon43序列存在（图11），与其表哥V4的DNA 测序结果相同。 表 2 DMD基因突变类型 家 系 患者 编号 性 别 MLPA检测突变类型 腓肠肌 病理检测 可能女性携带者 MLPA检测 患者 关系 1 1-4 男 Del 50（cDNA测序证实） 肌源性损害 50信号降低 外祖父三 兄弟与孙 2 5-6 男 Del 43（cDNA测序证实） 肌源性损害 43信号降低 表兄弟 3 7 男 Del 48-49 肌源性损害 48-49信号降低 4 8 男 Dup 55 肌源性损害 55信号增高 5 9 男 Del 35-43 肌源性损害 Nm 6 10 男 Del 3-44，Del 67 Nt Nt 7 11-12 男 Del 49-54（cDNA测序证实） 肌源性损害 49-54信号降低 表兄弟 8 13-14 男 Dup 22 肌源性损害 22信号增高 兄弟 9 15 男 Del 50-54（cDNA测序证实） 肌源性损害 50-54信号降低 10 16 男 Del 11-17 肌源性损害 11-17信号降低 11 17 男 Del 46-50 肌源性损害 46-50信号降低 兄弟 12 19-20 男 Del 14-15，Del 52-55 肌源性损害 Nm 舅甥 13 21 男 Del 10-40, Del 42-48 Nt Nt 14 22 男 Del 9-22 Nt Nt 15 23 男 Del 46-47（cDNA测序证实） 肌源性损害 46-47信号降低 16 24 男 Del 48-54 Nt 48-54信号降低 17 25 男 Del 49-51 肌源性损害 49-51信号降低 18 26 男 Del 53 肌源性损害 Nm 19 27 男 Del 51 Nt 51信号降低 20 28 男 Del 3-37 肌源性损害 3-37信号降低 21 29 男 Del 48-50 肌源性损害 48-50信号降低 22 30 男 Del 48-54 Nt Nm 23 31 女 47-50信号明显降低 肌源性损害 Nt 24 32 女 35信号明显降低 肌源性损害 Nt 25-32 33-41 男 Nm 肌源性损害 Nt 注：Del: deletion mutation，缺失突变; Dup: duplication mutation，重复突变; Nm: no mutation found，未发现突变; Nt: no tested，未检测.； *：死亡年龄 广州医学院硕士学位论文 15 图9 家系1患者IV1肌肉组织cDNA的DMD基因Exon50缺失 图10 家系2患者V2肌肉组织cDNA的DMD基因Exon43缺失 图11 家系2胎儿V3羊水DNA的DMD基因Exon43未缺失 3.4 Gap-PCR结果 跨越DMD基因缺失外显子所行的Gap-PCR扩增片段经1%～2%琼 脂糖凝胶电泳时用100～1000bp分子量Marker比较，其扩增产物电泳实际长度与计算的 理论长度相符。DMD 家系1先证者cDNA用引物E48 F和E51 R扩增产物长度为446bp， 家系1缺失50外显子长109bp，剩余297bp；家系2先证者cDNA用引物E42 F和E45 R扩增 产物长度为552 bp，减去缺失的43外显子173bp后总长度为379bp，琼脂糖凝胶电泳观察 实际长度与理论长度相符。 3.5 MLPA和DNA测序检测SMA结果 P021检测22例SMA患者，16例为SMN1的外显子 7和外显子8缺失纯合子，6例患者为SMN1的外显子7缺失纯合子。22例患者中有8例 SMN2外显子8信号比健康对照组相应扩增片段的平均信号明显增高。患者双亲39人的 广州医学院硕士学位论文 16 P021 SMN1外显子7扩增片段（图13-3中270bp和295bp）及P060 SMN1外显子7（图14-5 中217bp和211bp）的信号值均比对照组相应片段的平均信号值降低30%~50%，其中有28 人合并SMN1的外显子8信号降低，均为SMN致病基因携带者。22例患者有17例经DNA 测序验证结果与MLPA一致，见表3。P021和P060重要扩增片段及实验意义，见表4。 表 3 SMA患者基因突变类型 突变类型 患 者 性 别 年 龄 分 型 肌 力 运动机能 MLPA DNA测序 RFLP 1 男 12D I 0-1 不能抬头/坐 Del SMN1 E7+8 Del SMN1 E7+8 同前 2 男 8M* I 0-1 不能抬头/坐 Del SMN1 E7+8 Del SMN1 E7+8， 同前 3 男 6M* I 0-2 不能抬头/坐 Del SMN1 E7+8 Del SMN1 E7+8 同前 4 男 16M II 1-3 能独坐，不能走 Del SMN1 E7+8 Nt 同前 5 男 15M II 2-4 能抬头，不能坐/走 Del SMN1 E7+8 Del SMN1 E7+8 同前 6 男 26M* II 3-4 能独坐，不能走 Del SMN1 E7+8 Del SMN1 E7+8 同前 7 男 3Y III 3-4 能独坐，不能走 Del SMN1 E7+8 Nt 同前 8 男 5Y III 3-4 能坐/走，步态不稳 Del SMN1 E7 Del SMN1 E7 同前 9 男 5Y III 3-4 能坐/走，步态不稳 Del SMN1 E7 Del SMN1 E7 同前 10 男 8Y III 3-4 能坐/走，步态不稳 Del SMN1 E7+8 Nt 同前 11 男 12Y III 3-4 能坐/走，步态不稳 Del SMN1 E7+8 Del SMN1 E7+8 同前 12 男 12Y III 3-4 能坐/走，步态不稳 Del SMN1 E7 Del SMN1 E7 同前 13 女 11M* I 1-2 能抬头，不能坐/走 Del SMN1 E7+8 Del SMN1 E7+8 同前 14 女 6M I 1-2 不能抬头/坐 Del SMN1 E7+8 Del SMN1 E7+8 同前 15 女 11M* I 1-3 不能抬头/坐 Del SMN1 E7 Del SMN1 E7 同前 16 女 13M II 2-3 不能抬头/坐 Del SMN1 E7+8 Del SMN1 E7+8 同前 17 女 14M II 1-2 不能抬头/坐 Del SMN1 E7+8 Nt 同前 18 女 2Y II 2-3 能独坐，不能走 Del SMN1 E7+8 Del SMN1 E7+8 同前 19 女 4Y III 3-4 能独坐，不能走 Del SMN1 E7+8 Del SMN1 E7+8 同前 20 女 4Y III 3-4 能坐/走，步态不稳 Del SMN1 E7+8 Nt 同前 21 女 7Y III 3-4 能坐/走，步态不稳 Del SMN1 E7 Del SMN1 E7 同前 22 女 11Y III 3-4 不能抬头/坐 Del SMN1 E7 Del SMN1 E7 同前 23 男 孕 18W 引产 Del SMN1 E7+8 Del SMN1 E7+8， 同前 注：Y：岁； M：月； D：天; Nt: no tested, 未检测. 3.6 PCR-RFLP检测SMA结果 本研究中22例SMA患者PCR-RFLP结果为16例SMN1外 显子7和8缺失纯合子，6例SMN1外显子7缺失纯合子，支持MLPA检测结果，见表 3。SMN基因外显子7的扩增产物187bp，SMN2外显子7因借助错配引物构建了1个 广州医学院硕士学位论文 17 Dra I 酶切位点，酶切后产生163bp和24bp两个片段，SMN1基因外显子7无此酶切 位点而不能被酶切，仍为187bp，见图12。正常对照组SMN 外显子7 扩增产物经 Dra I 酶切可见187bp、163bp和24bp三条带; 而SMN1基因外显子7缺失纯合子 (患 者8、9) 和SMN1基因外显子7+ 8缺失纯合子（患者1、3、4、5）则只有163bp和 24bp二条带，无187bp带。SMN基因外显子8的扩增片段为189bp，SMN2外显子8 有一个Dde I 酶切位点，扩增片断被切成123bp和66bp；而SMN1基因外显子8无此 位点不被酶切，扩增片断仍为189bp。正常对照组SMN基因外显子8 扩增产物经酶 切后可见189bp、123bp和66bp三条带；而SMN1基因外显子8缺失纯合子（患者1、 3、4、5）因缺失SMN1 外显子8而无189bp条带，其SMN2外显子8扩增产物经Dde I 酶切后，仅见123bp和66bp两条带。 M：DNA分子标记；A～H为SMN1/2 外显子7酶切图，A：正常对照；B：患者8母亲；C～H：分别 为患者1、8、3、4、5、9。I～P为SMN1/2 外显子8酶切图，I：正常对照；J：患者8母，K～P：患 者1、8、3、4、5、9。 图12 部分患者SMN基因外显子7及外显子8 PCR-RFLP电泳图 广州医学院硕士学位论文 18 图 13 MLPA P021结果图谱 图 14 MLPA P060结果图谱 广州医学院硕士学位论文 19 表4 P021和P060多重连接探针扩增重要片段及实验意义 3.7 SMA产前诊断家系基因诊断结果 SMN1基因外显子7第6位核苷酸为C，而SMN2 基因外显子7为T。SMA产前诊断家系中先证者（患者2）的SMN基因外显子7 的 DNA测序结果缺少SMN1外显子7特异性碱基C（图15-①），测序图谱中显示为单 峰（碱基T），表明为SMN1外显子7纯合缺失。SMN1基因外显子8为G，而SMN2 基因外显子8为A，SMN基因外显子8 的DNA测序提示缺失SMN1基因外显子8特异 性碱基G，呈现单峰（碱基A），为纯合缺失SMN1基因外显子8（图15-②）。先证 者和胎儿DNA测序结果相同，均支持MLPA结果，如图13-2所示，270bp和295bp 信号完全缺失，表明SMN1的外显子7和8纯合缺失。此外，MLPA图谱（图13-2） 275bp和300bp信号比正常对照降低，提示患者2的SMN2的外显子7和8拷贝数减少。 患者2母亲SMN基因外显子7和8测序结果证明仅有SMN1基因外显子7特异性碱基 C（图15-③）和外显子8特异性碱基G（图15-④），表明为SMN2基因外显子7和外 显子8完全缺失，与MLPA图谱（图13-3）SMN2外显子7（275bp）和外显子8(300bp) 信号完全缺失结果相符。此外，MLPA图谱P021（图13-3）中270bp和295bp信号比 正常对照降低，提示其SMN1的外显子7和8拷贝数减少。P060（图14-2）也提示SMN1 的外显子7拷贝数降低，支持P021结果。患者2父亲DNA测序结果为SMN1和SMN2 基因外显子7（图15-⑤）和外显子8（图15-⑥）特异碱基双峰杂合子状态；其MLPA 编号 片段(bp) 基因及外显子 检测目的及结果判断 A P021- 184 GTF2H2 E10 降低提示 GTF2H2基因 E10存在 C>G突变 B P021-220 GTF2H2 E 7 降低提示 GTF2H2基因 E7存在 G>A突变 C P021-238 BRRC1 E5 降低提示 BRRC1基因部分缺失，患者预后不佳 D P021-270 SMN1 E7 缺失、降低分别提示 SMN1 E7纯合缺失和杂合缺失 E P021-275 SMN2 E7 缺失、降低分别提示 SMN2 E7纯合缺失和杂合缺失 F P021-295 SMN1 E8 缺失、降低分别提示 SMN1 E8纯合缺失和杂合缺失 G P021-300 SMN2 E8 缺失、降低分别提示 SMN2 E7纯合缺失和杂合缺失 H P021-328 GTF2H2 E4 降低提示 GTF2H2基因 E4存在 C>G和(或)G>A突变 I P021-362 SMN1/SMN2 E8 降低提示 SMN1+SMN2基因 E8拷贝数减少 J、K、 L P021-382 /400bp/418 SMN1+SMN2 降低提示 SMN1+SMN2拷贝数减少 M P060-174 SMN1 E7 降低提示 SMN1 E7杂合缺失， N P060-211 SMN1 E8 降低提示 SMN1 E8杂合缺失， O P060-238 BIRC1 E2 降低提示 BIRC1 E2杂合缺失。 广州医学院硕士学位论文 20 P021结果（图13-4）270bp信号比正常对照显著降低，提示SMN1的外显子7拷贝数 减少，P060（图14-3）也提示SMN1的外显子7拷贝数降低，支持P021结果。胎儿 羊水MLPA结果（图13-2）和DNA测序SMN1基因第7和8外显子结果（图15-①和图 15-②）与先证者相同，为SMN1外显子7和8缺失纯合子。胎儿引产后脐血DNA运 用MLPA和DNA测序技术检测结果与产前羊水检测结果相同。 图 15 SMA产前诊断家系 SMN基因外显子 7和外显子 8测序图 广州医学院硕士学位论文 21 4 . 讨 论 DMD由人类 Dystrophin 基因突变引起，是目前发现的人类最大的基因，主要突变 类型为外显子缺失，占全部突变的50%～70%，点突变约占25%，重复突变约占5%～10%， 突变位置无固定规律[11、12 ]。由于Dystrophin 基因