川乌与白芍配伍的免疫调节作用初探

nephropathy, which is probably due to t he effects of diur etic property, immunity enhancement and blood stasis amelioration. [Key words] � Yishenqing; cationic bovine serum albumin; membranous nephropathy [责任编辑 � 方文贤] 川乌与白芍配伍的免疫调节作用初探 秦 � 林, 张少华, 李晓丽 (山东中医药大学, 山东 济南 � 250014 ) [摘要] � 目的: 研究川乌配伍白芍的免疫调节作用。方法: 小鼠迟发性超敏反应( DTH)、大鼠免疫变态反应 性炎症、单核巨噬细胞( M� )吞噬功能和特异性抗体生成等。结果与结论: 在本文实验条件下,乌芍配伍对细胞免疫 有明显的双向调节作用,既可显著抑制正常和免疫增高小鼠 DTH, 明显抑制大鼠佐剂继发性关节炎, 又能明显提高免 疫低下的小鼠 M� 吞噬功能。与之相比,各单味药的调节作用较弱。根据风湿痹证免疫调节紊乱的病理机理, 本文 结果可能是临床应用乌芍配伍治疗风湿痹证的重要机制之一。 [关键词] � 配伍; 川乌;白芍; 免疫调节 [中图分类号] � R 285. 1; � R 285. 5 � [文献标识码] � B � [文章编号] � 1001-5302( 2002) 07-0541-03 � � 川乌与白芍(以下简称乌芍)是中医治疗风湿痹 证的常用传统药对, 也是现代治疗风湿性关节炎、类 风湿性关节炎等疾病的常用配伍药对[ 1]。笔者在研 究了二药配伍能增强镇痛抗炎作用以及增强抑制免 疫变态反应性炎症 (大鼠佐剂性关节炎 ) 的基础 上[ 2, 3] ,又进一步探讨了乌芍配伍前后, 对机体免疫 功能的调节作用。 1 � 材料 1.1 � 药材 � 川乌为毛茛科多年生草本植物乌头 ( Aconitum carmichaeli Debx. )的块根, 白芍为毛茛 科多年生草本植物白芍( Paeonia lact if lora Pall)的 根。二药均购自济南市中药饮片厂, 由本校中药鉴 定教研室石俊英教授鉴定。 1. 2 � 药物制备 1. 2. 1 � 川乌、白芍、乌芍 1�1以及乌芍 1�2水煎液 制备见参考文献[ 2]。 1. 2. 2 � 环磷酰胺( Cyclophosphamide, Cyc ) : 上海华 联制药有限公司,生产批号 970501; 2, 4-二硝基氟苯 ( DNFB ) , 上海金山县六塔化工厂, 生产批号: [收稿日期] � 2001- 11-30 [通讯作者] � 电话: ( 0531) 2613280 [基金项目] � 国家自然科学基金资助课 ( 39670868) 850601,临用时用丙酮�麻油( 1�1)混合溶媒配制成 10 g�L-1DNFB 溶液。刚果红, 北京化工厂, 生产批 号: 700809,临用时以生理盐水配制成 1%溶液。 1. 3 � 动物 � � 昆明种小白鼠 18~ 22g, � �各半, 购自山东省 医学科学院动物中心。 2 � 方法和结果 2. 1 � 对 2, 4-二硝基氟苯( DNFB)所致小鼠迟发型 超敏反应( DTH )的影响 2. 1. 1 � 对正常小鼠 DTH 的影响 � 取小鼠 60只,随 机分为 6组: � NS 组; � Cyc组; � 川乌组; �白芍 组; �乌芍 1�1组; �乌芍 1�2组。实验当天,参照 Corsini法[ 4]稍加改良,于每鼠腹部去毛处涂抹 10 g� L- 1DNFB 50 �L 致敏,次日同法强化 1次。致敏当 天各组小鼠分别 ig, 灌胃量 0. 2 mL�( 20 g ) - 1,正常 对照组给等容量生理盐水, 连续给药 5 d。Cyc组于 致敏当天( d1)和第 3天( d3) ,各 ip Cyc 100 mg�kg- 1 1次。第 6 天, 每鼠右耳廓内外两侧面均匀涂抹 DNFB 10 �L 攻击, 24 h 后脱颈椎处死, 用直径 8 mm 打孔器打下左右耳廓同部位耳片, 称重。以左 右耳片重量之差( mg)为迟发型超敏反应值。结果 以方差 t 检验法进行统计学处理(见表 1)。 �541� 第 27卷第 7期 2002年 7月 � � � � � � � � � � � � 中 国 中 药 杂 志China Journal of Chinese Materia Medica � � � � � � � � � Vol. 27, No. 7 July, 2002 表 1� 乌芍配伍前后对正常小鼠 DTH 的影响( x � s ) � 组别 n 剂量 / g�kg- 1 DTH / mg 肿胀率 / % 抑制率 / % NS组 10 等容量 � 12. 5 � 3. 9 101. 38 � Cyc组 8 � 0. 1 8. 3 � 3. 0 1) 81. 21 33. 60 川乌组 9 20 12. 8 � 4. 8 107. 65 � 白芍组 9 20 11. 1 � 3. 4 86. 11 11. 20 乌芍( 1�1)组 9 20 8. 1 � 4. 8 1) 62. 99 35. 20 乌芍( 1�2)组 10 20 10. 8 � 3. 4 79. 41 13. 60 � � 注: � 剂量( 20 g� kg- 1)为药物水煎液中川乌或相当于川乌的 含量(下表同) � � 与 NS组比较1) P< 0. 05 结果表明, 在本文实验条件下,各单味药组对正 常模型的影响不明显,与之相比, 乌芍( 1�1)配伍组 出现明显的抑制作用,与正常对照组有明显差异。 2. 1. 2 � 对 Cyc诱导小鼠 DTH 升高模型的影响 � 取 小鼠 60只, 随机分为 6 组: � NS 组; � Cycip+ NS 组; � Cycip+ 川乌组; �Cycip+ 白芍组; � Cycip+ 乌芍 1�1 组; �Cycip+ 乌芍 1�2组。参照文献[ 5, 6] ,于致敏前3 d( - 3 d) , 1次 ip Cyc 250 mg�kg- 1诱 导DTH 升高模型。实验当天,各组均按实验 2. 1. 1 方法致敏,并同时分别给各组小鼠 ig, 灌胃量为 0. 2 mL�( 20 g) - 1或等量生理盐水,连续给药 5 d。第 6 天按实验 2. 1. 1方法攻击并处理(见表 2)。 表 2� 乌芍配伍前后对 Cyc诱导小鼠 DTH 升高模型的影响 ( x � s ) 组别 � � � � � � n 剂量 / g�kg- 1 DTH / mg 肿胀率 / % NS组 10 等容量 � 13. 1 � 5. 4 � 107. 38 DTH 升高模型 � � � � Cycip+ NS组 8 等容量 24. 9 � 4. 92) 228. 86 Cycip+ 川乌组 9 20 22, 0 � 6. 02) 200. 00 Cycip+ 白芍组 9 20 16. 3 � 6. 13) 139. 67 Cycip+ 乌芍( 1�1)组 9 20 16. 7 � 1. 73) 141. 17 Cycip+ 乌芍( 1�2)组 10 20 15. 3 � 2. 43) 136. 61 � � 注:与NS组比较 � 2) P < 0. 01 � 与Cycip+ NS组比较 � 3) P < 0. 05 结果表明, Cyc 升高模型生理盐水组明显高于 正常对照组( P< 0. 01) , 说明造模成功。白芍组以 及各配伍组均可明显抑制升高模型的 DTH, 与升高 模型生理盐水组有显著差异。 2. 2 � 对小鼠单核巨噬细胞( M � )吞噬功能的影响 2. 2. 1 � 正常小鼠 � 参照文献[ 7~ 9]所报道的方法。 取正常健康小鼠 50只, 随机分为 5 组: � NS 组; � 川乌组; � 白芍组; �乌芍 1�1 组; �乌芍 1�2 组。 每天等容量 ig1次,连续 7 d。于末次给药 1 h后,用 肝素处理过的定量毛细血管,从小鼠眶后静脉丛取 血40 �L,立即放入 4 mL 蒸馏水中,使血标本完全 溶血作为空白对照管, 随即从小鼠尾静脉注入刚果 红溶液 0. 1 mL�( 10 g) - 1,至注射后 30 s, 同上法取 血40 �L,放入 4 mL 蒸馏水中,使其完全溶血作为 实验管。然后用 721型分光光度计,在 510 nm 波长 下以空白对照管调吸光度� 0�点, 测试实验管吸光 度,计算血清刚果红含量( mg%) ,根据含量多少说 明 M� 吞噬功能强弱, 即含量少, 说明吞噬力强; 反 之,为吞噬力弱(见表 3) (刚果红曲线, 以回归 方程计算得出 Y = 2. 6477X - 0. 002, r = 0. 9998)。 结果表明,在本文实验条件下,各给药组对正常 小鼠单核 M � 的吞噬功能均无明显的影响作用。川 乌组略呈抑制趋势, 与白芍配伍后则可对抗其抑制 而略呈提高趋势,配伍前后有显著差异。 表 3� 乌芍配伍前后对正常小鼠单核 巨噬细胞吞噬功能的影响( x � s, n= 10) 组别 给药量/ g�kg- 1 血清刚果红含量/ mg% NS组 等容量 � 1. 279 � 0. 254 川乌组 20 1. 390 � 0. 172 白芍组 20 1. 271 � 0. 222 乌芍( 1�1)组 20 1. 191 � 0. 1434) 乌芍( 1�2)组 20 1. 223 � 0. 1694) � � 注:与川乌组比较 � 4) P < 0. 05 2. 2. 2 � 免疫低下模型小鼠 � 参照 Marchal. G[ 10]和 刘进学等[ 6]方法加以改良,把小鼠随机分为 6组: � NS组; � Cyc+ NS 组; � Cyc+ 川乌组; �Cyc + 白 芍组; � Cyc+ 乌芍 1�1 组; �Cyc + 乌芍 1�2 组。 给药连续 5 d期间,分别于第 1 d, 3 d, 5 d, ip Cyc 70 mg�kg- 1,造成免疫低下模型。仍然按照上述方法 进行实验检测(见表 4)。 表 4� 乌芍配伍前后对免疫低下小鼠 单核巨噬细胞吞噬功能的影响( x � s, n= 10) 组别 � � � 给药量/ g�kg- 1 血清刚果红含量/ mg% NS组 等容量 � 1. 136 � 0. 257 Cyc+ NS组 同上 1. 507 � 0. 2542) Cyc+ 川乌组 20 1. 395 � 0. 1861) Cyc+ 白芍组 20 1. 440 � 0. 1672) Cyc+ 乌芍( 1�1) 20 1. 313 � 0. 183 Cyc+ 乌芍( 1�2) 20 1. 319 � 0. 185 � � 注:与 NS组比较 � 1) P < 0. 05� 2)P < 0. 01 结果表明:对于免疫低下小鼠单核 M � 的吞噬 功能, 各单味药没有明显提高作用,与正常 NS 组有 显著差异; 配伍组则能提高低下的吞噬功能, 并使之 �542� 第 27卷第 7期 2002年 7月 � � � � � � � � � � � � 中 国 中 药 杂 志China Journal of Chinese Materia Medica � � � � � � � � � Vol. 27, No. 7 July, 2002 恢复至正常 NS 组水平。 2. 3 � 对小鼠血清溶血素(抗鸡红细胞抗体)生成的 影响 参照文献报道的方法[ 11] ,取正常健康小鼠随 机分为 5组: � NS 组; � 川乌组; � 白芍组; �乌芍 1�1组; �乌芍 1�2组。于免疫刺激当天开始给药, 连续给药 7 d, 于末次给药 1 h后眶静脉取血,离心, 取血清用生理盐水稀释 100倍,取上述血清1 mL 与 5%鸡红细胞混悬液 0. 5 mL 混合,在 0 � 冰箱中加 10%补体 0. 5 mL, 37 � 恒温箱中保温 30 min, 在 0 � 冰箱中终止反应, 离心,取上清液于 721分光光度 计 540 nm 处比色, 另设不加血清的空白管作对照。 实验重复两遍。 结果表明: 在本文实验条件下,乌芍配伍前后对 溶血素的生成均没有明显的影响。其中, 单味药的 结果与文献报道结果略有出入,分析原因可能与给 药剂量有关。乌芍配伍后也未出现明显的变化(表 略)。 3 � 讨论和小结 3. 1 � 类风湿性关节炎(风湿痹证)等慢性炎症的发 病机制与机体免疫调节紊乱密切相关。对此若单独 应用抗炎药、免疫抑制或免疫增强药, 疗效均欠佳, 长期应用还可能加重病情,延长病程。因此, 学者们 提出: 寻找�抗炎免疫调节药�, 是抗炎药理的重要发 展方向之一[ 12]。现代医学逐渐重视免疫应答中的 各种调节关系, 尤其是 20世纪 80年代的研究更加 深入[ 13]。但是, 深入阐明免疫应答的各种调节规 律,仍是今后的努力方向[ 14]。抗炎免疫调节药物的 研究仍未取得突破性进展,尤其是能根治疾病且不 良反应较小的药物(包括生物调节剂 )的研制,仍然 任重道远[ 15]。中药的多重生物活性以及药物配伍, 在治疗免疫功能紊乱疾病方面具有突出的优势。其 机理在于调整阴阳寒热, 疏通气血经络[ 1]。笔者实 验研究初步发现, 寒热配伍的代表药对 � � � 乌芍配 伍,对免疫功能的调节作用较为显著。 3. 2 � 本文从小鼠 DTH、单核 M � 吞噬功能和特异 性抗体生成等方面, 对川乌与白芍配伍前后的免疫 药理活性进行了实验研究。结合笔者以往对大鼠免 疫变态反应性炎症的实验结果[ 3] ,发现乌芍配伍后 对正常和免疫增高小鼠 DTH, 以及对大鼠佐剂继发 性损害,均有明显的抑制作用;而对正常和免疫低下 的小鼠 M � 吞噬功能,却表现为配伍后能提高免疫 低下小鼠单核 M � 吞噬功能。研究提示, 在本文剂 量条件下,乌芍配伍对细胞免疫有较为明显的抑制 和促进双向作用,而各单味药的作用则略弱一些。 3. 3 � 近来徐叔云等报道,白芍中的白芍总苷有抗炎 免疫调节作用[ 12]。笔者的药化分析实验发现,乌芍 配伍后芍药苷含量明显增加(正在整理当中) , 这可 能是乌芍配伍后抗炎免疫调节作用略强于单味药的 依据之一。笔者将进一步从分子细胞水平深入探讨 寒热配伍的抗炎免疫调节作用。 [参考文献] [ 1] � 秦 � 林,彭 � 欣.论寒热配伍在痹证治疗中的意义. 中国中药 杂志, 1999, 24( 2) : 112. [ 2] � 秦 � 林,彭 � 欣, 李晓丽,等.川乌配伍白芍对实验性疼痛的影 响.中国中药杂志, 1999, 24 ( 10) : 629. [ 3] � 薛 � 玲,张惠云,秦 � 林,等.川乌与白芍配伍前后对大鼠佐剂 关节炎的影响.中国中药杂志, 2000, 25( 3) : 175. [ 4] � Corsini A C, Bellucci S B, Costa MG, et al. A simple Method of Evaluat ing Delayed T ype Hypersensit ivity in Mice. Immunol. Methods, 1979, 30( 4) : 195. [ 5] � 李小玉,童乐民, 金筠芳,等.氧代赖氨酸对免疫反应的增强作 用.中国药理学报, 1987, 8( 2) : 173. [ 6] � 刘进学,袁盛榕, 詹元红,等.棕褐沙林蚁水提物对小鼠迟发性 超敏反应的影响.中国药学杂志, 1996, 31( 11) : 658. [ 7] � 严宣左,赵 � 琳, 杨燕玲.小鼠刚果红吞噬实验方法的研究. 北 京中医学院学报, 1982, ( 1) : 40. [8] � 黄文玉,李 � 萍.小鼠刚果红吞噬试验观察. 山东中医学院学 报, 1986, 10(专辑) : 78. [9] � 毛 � 良,顾文聪,范钰芬. 针灸对家兔网状内皮系统吞噬机能 的影响.上海中医药杂志, 1965, ( 4) : 33 [ 10] � Marchal G, M ilon G, Hurt rel B. et al . Tit ration and Circulat ion of C ells Mediat ing Delayed T ype Hypersensit ivity in Normal and Cyclophosphamide Treated Mice During Response to S heep Red Blood Cells. Immunoiogy, 1978, 35( 4) : 981. [11] � 李仪奎.中药药理实验方法学.上海: 上海科学技术出版社, 1991. 159. [12] � 徐叔云,魏 � 伟,梁君山.中药抗炎免疫药理研究现状.药学 进展, 1992, 12( 2) : 65. [ 13] � 龙振洲.医学免疫学.第二版.北京:人民卫生出版社, 1998, 5. [ 14] � 吴敏毓,刘恭植.医学免疫学.第三版.合肥:中国科学技术大 学出版社, 1999. 6. [15] � 徐叔云,丁长海. 抗炎免疫药物的临床研究进展.中国临床药 理学杂志, 1997, 13 ( 4) : 238. �543� 第 27卷第 7期 2002年 7月 � � � � � � � � � � � � 中 国 中 药 杂 志China Journal of Chinese Materia Medica � � � � � � � � � Vol. 27, No. 7 July, 2002 Studies on Immunoregulating Effect of Monkshood Root and Peony Root Used Singly and in Combination QIN Lin, ZhANG Shao-hua, L I X iao-li ( Shandong Univ ersity of TCM , Jinan 250014, Shandong, China) [Abstract] � Objective: To investigate the abir ritation and antiinflammation effects of Monkshood Root and Peony Root used sing ly and in combination, and to find the enhanced effects of the two drugs used in combination; To obser ve the effect of Monkshood Roo t and Peony Root used singly and in combination by studing the immunoregulation funct ion in experimental animals. Method: T he response of delayed type hypersensitivity in mice, the phagocytosis of abdominal macrophages in mice, and the production of spe- cial ant ibodies in mice were obser ved. Result: The two drugs used in combination could increase phagocytosic function of mononuclear macrophagocyte in hypoimmuitic model mice, and inhibit the responses of delayed type hypersensitivity in the hyper immunitic model mice and the nonimmunosuppressiv e tr eated mice, w ith nosignificant effect on the production of special antibodies in mice. Conclu- sion: In accordance w ith the mechanism of the disorder between t he ant-i inflammation effect and the induce- inflammation effect on art hritis in the immune system, these data show the bidirectional effect o f the two drugs used in combination on the immune respons- es, which may be one of the main mechanisms of treating arthralg ia due to wind-dampness. [Key words] � compatibility; monkshood root, peony roo t; immunoregulat ion [责任编辑 � 古云霞] (上接第 518 页) 达到对样品内在质量的控制,笔者经过近几年的方 法学研究, 在原标准[ 3] (未建立含量测定方法)基础 上采用 T LCS 法测定其中的芝麻素含量, 展开系统 以环己烷-乙醚-乙酸乙酯( 20�5. 5�2. 5)进行两次展 开,也能得到较满意结果(未报道) ,并顺利通过国家 新药评审。为进一步提高含量测定分离度, 本文改 为采用分步展开技术, 使混合油中各种成分与被测 的芝麻素得以良好分离。 3. 3 � 供试品中绝大部分为油脂, 因而在展开过程 中,油脂在前沿高度集中并扩散至整个前沿, 造成供 试品轨道薄层色谱扫描图谱的前沿处出现油脂峰, 而单纯用对照品点样, 例如在线性范围试验中的色 谱扫描图谱则没有前沿油脂峰。 3. 4 � 结果表明,采取多次展开比刮板洗脱分离斑点 准确度高, TLC 板间误差小, 测定精密度高,回收率 稳定,重现性好,为提高该新药的质量控制提供了定 量依据。 [参考文献] [1] � 孙毓庆,王延宗,林乐明,等.现代色谱法及其在医药中的应用. 北京:人民卫生出版社, 1998. 252. [2] � 中华人民共和国卫生部,中国药品生物制品检定所. 中国药品 检验标准操作.北京:中国医药科学技术出版社, 1996. 113. [3] � 李泳雪.新药通便通胶囊的质量标准研究.中药新药与临床药 理, 1996, 7( 1) : 34. [责任编辑 � 李 � 禾] �544� 第 27卷第 7期 2002年 7月 � � � � � � � � � � � � 中 国 中 药 杂 志China Journal of Chinese Materia Medica � � � � � � � � � Vol. 27, No. 7 July, 2002