8型AAV重组病毒介导的凝血因子的基因表达

8型AAV重组病毒介导的凝血因子的基因表达 * 曹佐武 1)**李观贵 1)梁郁强 1)何冬梅 2) (1)暨南大学生命科技学院，广州 510632；2)暨南大学血液病研究所，广州 510632) 摘要 8型AAV重组病毒载体是新型的基因转移载体，能高效转染肌肉细胞和肝细胞.AAV转染细胞的效果与注射病毒的 途径有很大关系.与门脉注射和肌肉注射相比，经腹腔注射的rAAV8病毒能经血液循环转运到全身其他组织器官，形成更加 广泛和持久的基因转导.通过腹腔途径把5×1010gc的8型重组病毒载体注射到小鼠体内，2周后，小鼠血浆中有明显的基因 表达，1个月至2个月期间多数小鼠表达量达到高峰，然后表达水平下降，直到4个月后血浆中尚维持明显的表达量.凝血 实验显示，表达的人凝血因子Ⅸ具有生物活性.免疫组化实验显示，病毒载体已进入体内多组织器官中表达.说明8型AAV 病毒载体经腹腔注射后已经血液循环运送到其他组织，并在肌肉、肝脏、肾脏和心脏等器官明显表达，表达产物具有凝血 活性. 关键词 腺相关病毒，腹腔注射，凝血因子 学科分类号 R394.8 腺相关病毒 (adeno-associatedvirus，AAV)是 单链DNA微小病毒，是一种复制缺陷性病毒.它 的复制需要辅助病毒如腺病毒的协助.AAV病毒仅 由三个核外壳蛋白和一条 DNA单链构成，不含 酶、酯类及碳水化合物. AAV基因组的两端为145个碱基的倒转末端 重复序列(ITR)，其间是2个开放性阅读框，分别 编码与AAV复制相关的Rep蛋白和病毒外壳蛋白 Cap蛋白.重组腺相关病毒(rAAV)去掉了野生型 AAV自身的基因，仅留下其基因组两端的反向重 复序列ITR，其间插入需要表达的目的基因. AAV病毒具有安全性高、免疫原性低、物理 性质稳定、感染细胞谱广等优点.此外，AAV病毒 能够感染多种宿主细胞,包括分裂期细胞和非分裂 期细胞，插入突变的危险性低，对宿主固有的免疫 系统影响小，不会引起严重的急性炎症反应.因此 被认为是最有前途的基因治疗载体之一. 根据病毒壳体蛋白的不同,现已经确定了不同 的AAV血清型.不同血清型AAV因外壳蛋白不同 在细胞表面存在不同的受体,决定它们对细胞不同 的亲嗜性和转导效率.AAV2是研究得最清楚的 AAV病毒.rAAV2病毒对神经组织和肌肉组织的 感染效率相对较高,而对于其他组织细胞的感染效 率相对较低.这限制了它在基因治疗中的应用. 8型AAV是从灵长类动物新分离出的腺相关 病毒血清型[1].8型重组 AAV病毒(rAAV8)载体能 更有效地转染肌肉和肝脏等组织器官，而且实验显 示，经腹腔注射能经血液循环转运到其他组织器 官[2]. 人凝血因子Ⅸ (hFⅨ)是肝脏合成的，前体蛋 白是461个氨基酸的单链血浆酶原，其基因位于X 染色体远端，1.383kb的编码区编码415个氨基酸 的肽链.凝血因子Ⅸ通过水解激活后形成FⅨa.凝 血因子Ⅸ的表达缺陷导致凝血障碍，临床上表现为 乙型血友病，这是一个利用AAV病毒广泛进行基 因治疗研究的疾病[3].乙型血友病基因治疗的靶细 胞多为肌细胞和肝细胞等.AAV病毒载体的注射途 径有多种，如肌肉注射，门脉注射和静脉注射等. 由于凝血因子主要在肝脏表达，因此，肝门静脉注 射曾是一个首选的，这样病毒能较集中地感染 *国家自然科学基金部分资助项目(30271370). **通讯联系人. Tel:020-31545871,E-mail:caozuowu@yahoo.com.cn 收稿日期：2006-06-13，接受日期：2006-08-31 生物化学与生物物理进展 ProgressinBiochemistryandBiophysics 2007,34(1):80~86 www.pibb.ac.cn 研究ResearchPapers 曹佐武等:8型AAV重组病毒介导的凝血因子的基因表达2007;34(1) 肝脏细胞.然而，实验显示，AAV8重组病毒载体 导入肝细胞后，载体DNA降解快[2].肌肉注射简单 易行，肌细胞表达的凝血因子也具有凝血活性.但 是，肌肉注射的病毒感染细胞范围比较局限，而且 往往需要两点或多点注射以增加病毒感染范围. 腹腔注射简便易行，经腹腔注射的rAAV8病 毒能经血液循环转运到全身其他组织器官，并能在 多种组织器官广泛而持久地表达绿色荧光蛋白[2]. 然而，作为一种较新型的血清型病毒，是否能够通 过腹腔注射rAAV8进行凝血因子基因的治疗性研 究尚不确定.本文通过腹腔注射8型AAV病毒载 体，探讨rAAV8病毒介导的凝血因子Ⅸ在体内表 达效果. 1 材料和方法 1.1 重组质粒的体外表达功能鉴定 8型AAV辅助质粒由美国Wilson教授实验室 构建.人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)的表达载体 pCAhF9由 美国Welsh博士赠送，它是一个约7.2kb的质粒. 其间有凝血因子Ⅸ的cDNA和剪接的第一内含子. 该基因的上游有一个CMV增强子和CBA启动子， 下游有牛生长激素的polyA序列.两侧翼各有一个 145bp的ITR序列. 人胚胎肾细胞(HEK293细胞)经胰蛋白酶消化 后接入6孔板，在细胞密度达60%～70%时换上含 10%去凝血因子Ⅸ小牛血清(Hyclone)的DMEM培 养基，2h后用磷酸钙沉淀法把该质粒转入293细 胞，2天后收集293对照细胞和转导重组质粒的细 胞，用PBS洗涤后用 M-PER细胞裂解液 (Pierce) 裂解细胞，加完全蛋白酶抑制剂(Roche).离心后取 上清，-20℃保存备用. 取对照的293细胞裂解液和转染的293细胞裂 解液电泳.采用10%的聚丙烯酰胺分离胶.用双色 预染蛋白质品(Bio-Rad)作对照.然后将 SDS-PAGE分离的蛋白质转移到 HybondPVDF膜 (AmershamBiosciences)上.用兔抗人 FⅨ单克隆抗 体(Sigma)和羊抗兔IgG-HRP进行蛋白质印迹以鉴 定凝血因子Ⅸ的表达. 1.2 8型AAV重组病毒的制备和小鼠试验 用DMEM培养293细胞，在细胞密度为60% ～70%时，参照3种质粒共感染方法[4]通过磷酸钙 沉淀法把腺病毒辅助质粒 PXX680、AAV辅助质 粒AAV8和pCAhF93种质粒同时导入 20皿 293 细胞，48h后收集感染细胞.用两轮CsCl密度梯度 离心[4]分离纯化重组的 AAV病毒.病毒样品先经 1.1U/!l的 DNase37℃消化 1h，再用蛋白酶 K 50℃消化1h，然后通过斑点杂交法[5]确定病毒在 梯度离心液中的分布.利用生物素标记的凝血因 子9的cDNA片段为探针，用Phototope检测试剂 盒(NewEnglandBiolabs)化学发光法显示病毒斑.取 出含 AAV病毒的悬液，透析过夜，更换 PBS 2次，用PEG浓缩病毒液，用斑点杂交法测定病 毒滴度.用pCAhF9质粒DNA梯度稀释液点样作标 准曲线.根据病毒斑的杂交信号强度估算出对应的 基因拷贝数. 凝血因子FⅨ基因剔除小鼠(F9K/OC57BL/6) 是美国Stafford博士实验室制备[6]，约15g，编号 标记后，通过吸入Forane麻醉，腹腔注射凝血因 子Ⅸ-AAV8病毒 (rAAV8-hF9)125"l(5×1010gc). 注射病毒前，用毛细管眼球取血约50#l.毛细玻管 先用3.8%的柠檬酸钠湿润以防凝血，13000r/min 离心 10min分离血浆，以后每隔 2周采血一次， 分离的血浆分小份-80℃保存. 1.3 ELISA测定 8型 AAV重组病毒感染小鼠后 的基因表达 把兔抗人凝血因子Ⅸ单克隆抗体铺在 ELISA 板上，每孔约400ng，参照美国High教授实验室 的双抗体夹心ELISA方法[7]进行ELISA.把1∶100 稀释的血浆样品或标准品100$l加入预设的孔里， 37℃孵育1h.再加入耦联HRP的人凝血因子Ⅸ抗 体(HRP-anti-hF9)，37℃孵育 1h.用 ABTS底物液 (Roche)显色后，405nm光波测定A值. 把用稀释液5倍稀释的通用凝血参考血浆标准 品 UCRP(PacificHemostasis)定为含 100%凝血因 子，用稀释液梯度稀释 UCRP配成 50%、25%、 12.5%、6.25%、3.12%、1.56%、0.78%的系列标准 品制作标准曲线，以计算样品血浆中的重组凝血因 子Ⅸ. 1.4 测定小鼠血浆中重组人凝血因子Ⅸ的活性 小鼠血浆中的人凝血因子Ⅸ (hFⅨ)的活性通 过测定活化部分凝血活酶时间(APTT)来评价[7].把5 倍稀释的通用凝血参考血浆标准品 UCRP定为 100%凝血因子，利用梯度稀释UCRP配制100%、 50%、25%、12.5%、6.25%、3.12%、1.56%系列标 准品，制作标准曲线.血浆1∶10稀释后测定凝血 时间.用注射病毒前的小鼠血浆作对照.取APTT试 剂Kontact(PacificHemostasis)75%l，加hFⅨ缺乏 血浆(TrintyBiotech)75&l、UCRP标准品(Pacific 81· · 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2007;34(1) Hemostatosis)或稀释的血浆样品 75!l，混匀，置 37℃保温 3min，加预热至 37℃的 0.025mol/L氯 化钙溶液(PacificHemotasis)75"l，记录凝血时间. 每个样品测试3次以计算平均值. 1.5 免疫组化检测重组病毒在小鼠体内的分布和 表达 2只小鼠在注射重组 8型 AAV病毒 6周后， 取感染小鼠的组织块(腹肌、后腿肌、肝脏、肾脏 和心脏)和未注射病毒的对照小鼠的卵巢组织，福 尔马林固定液固定，石蜡包埋，切片后用兔抗hF Ⅸ单克隆抗体(Sigma)(10mg/L)和羊抗兔IgG-HRP 进行免疫组化. 2 结 果 2.1 表达载体的体外表达功能 把人凝血因子Ⅸ的基因表达载体pCAhF9导入 293细胞后，收集细胞，用细胞裂解液电泳，把电 泳分离蛋白质转移到膜上进行蛋白质印迹分析.结 果见图1. 与对照的293细胞裂解液相比，重组病毒转染 的293细胞裂解液有一条杂交信号明显的带，其分 子质量大小与凝血因子Ⅸ的分子质量相当.而另一 条与抗体结合的带，分子质量在30ku上下，可能 是凝血因子Ⅸ的水解产物.说明凝血因子Ⅸ基因转 导入293细胞后表达出该基因产物，该表达载体具 有表达功能. 不过，转导后的293细胞与对照的293细胞都 有另一个相同的杂交信号蛋白.其分子质量约为 70ku，可能是293细胞本身染色体上的凝血因子 Ⅸ基因表达的前体蛋白. 2.2 8型 AAV重组病毒感染小鼠后体内表达的 检测 用稀释液梯度稀释 UCRP配成系列标准品， 用定量 ELISA测得相应的 A值，制作标准曲线 (图 2).UCRP系列标准品的浓度为 50%、25%、 12.5%、6.25%、3.12%、1.56%、0.78%，对应的A 值分别为 1.506、1.288、1.118、0.988、0.695、 0.464、0.257.凝血因子的含量百分比值y与相应的 光密度值x成指数关系.y=0.3179e3.2952x，相关系数 R2=0.9924. 根据该公式可算出小鼠血浆中的人凝血因子Ⅸ 的相对表达量.6只小鼠腹腔注射 8型 AAV病毒 后，血浆中出现人的凝血因子Ⅸ.其表达量随时间 变化的规律见图3.注射病毒前，血浆中的人凝血 因子Ⅸ的含量低于ELISA检测的范围，几乎为零. 2周后，人凝血因子的表达明显，1个月后至2个 月期间多数小鼠表达量达到高峰，然后凝血因子水 平下降.直到4个月后血浆中凝血因子Ⅸ尚维持明 显的表达水平，多数水平在200%～500%左右. 2.3 小鼠血浆中重组人凝血因子Ⅸ的活性 凝血因子Ⅸ的生物活性通过其促进人凝血因子 Ⅸ缺陷血浆凝血来确定.活化部分凝血活酶时间用 梯度稀释的通用凝血参考血浆作标准曲线(图4).系 列稀释的 UCRP标准品的浓度为 100%、50%、 25%、12.5%、6.25%、3.12%、1.56%，测得的凝 Fig.2 ELISA standard curve produced from the exponentiallydilutedUCRP AxisystandsforthepercentageamountofcoagulationfactorⅨ,axisx standsforA405value.y=0.3179e3.2952x,relationcoefficientR2=0.9924. 50 40 30 20 10 0 0.5 1.0 1.5 A405 F9 /% y=0.3179e3.2952x R2=0.9924 Fig.1Westernblottingoftheexpressionproductof recombinanthFⅨ genetransferredintoHEK293cells 1:LysateofthecellstransfectedwithrecombinanthFⅨ gene;2: Prestaineddualcolorproteinstandard(Bio-Rad);3:Lysateofthe controlHEK293cells. 1 2 3 75 50 37 25 ku 82· · 曹佐武等:8型AAV重组病毒介导的凝血因子的基因表达2007;34(1) Fig.4 Therelationbetweentheclottingtimeandthe coagulationactivityofthereferenceplasma AxisxstandsfortheAPTT(seconds),axisystandsfortherelative concentrationofreferenceplasma(%). 100 80 60 40 20 0 40 50 60 70 t/s F9 /% y=3416.8e-0.098x R2=0.998 血时间分别为 36.23、43.15、49.73、57.9、63.4、 71.78、75.97s.凝血因子的活性y与凝血时间x成 指数相关.y=3416.8e-0.098x.相关系数(R2)为0.998.根 据该公式可计算小鼠血浆中凝血因子的相对含量. 293细胞裂解液 1/5稀释液的凝血时间为 84.7s. 注射病毒前小鼠血浆的凝血时间大于 300s， 凝血因子Ⅸ相对含量小于5.8×10-10，相当于0. 5号小鼠注射重组病毒 4周后的 ELISA值为 1400，1/10血浆稀释液的凝血时间为 35s，凝血 因子相对含量为114%. 6号小鼠注射 2周后的 ELISA为 1440，1/10 血浆稀释液的凝血因子相对含量为123%. 1号小鼠注射病毒12周后的ELISA值为488， 1/10血浆稀释液的凝血时间为41.4s，凝血因子的 相对含量为59.1%. 2号小鼠注射14周后的1/10血浆稀释液的凝 血时间为55s，凝血因子Ⅸ的相对含量为 15.7%， 因此还有明显的凝血因子活性. 其中1号小鼠不同时间血浆样品的凝血活性及 其 ELISA检测的人凝血因子Ⅸ表达量的变化见 图5.横坐标代表不同的取血时间(注射前，注射后 2，4，6，8，10，12，14，16周)，纵坐标代表 hF9对应于标准品的相对百分含量. 可见，ELISA测得的凝血因子含量高的小鼠血 浆，其表现的凝血活性也强.重组病毒表达的凝血 因子Ⅸ是有活性的. 2.4人凝血因子Ⅸ在小鼠组织中的表达分布 感染小鼠和对照小鼠的组织切片用兔抗hFⅨ 单抗和羊抗兔 IgG-HRP进行免疫组化实验.在肝 脏、肾脏和心脏有明显的表达，在腹肌和后腿肌肉 中也有表达(图6).说明AAV病毒经腹腔注射后已 通过血液循环感染全身其他器官组织，包括后腿肌 肉和心脏.而在肝脏和肾脏，表达量较高，表达产 物较集中在肝小管和肾小管周围，可能是因为该基 因带分泌信号肽因而分泌到细胞外或肝小管和肾小 管管腔. Fig.5 Comparisonofrecombinanthumancoagulation factorⅨ intheplasmaofatransfectedmouseviaELISA andAPTTassays Axisxstandsforthesamplingtime(weeksafterinjection),axisystands fortherelativeconcentrationofhFⅨtothereferenceplasma(%).Blank barstandsforthevaluesfromELISA,graybarstandsforthevaluesfrom APTT. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 1200 1000 800 600 400 200 0 hF 9/ % Weeksafterinjection Fig. 3 Theexpressioncurveofrecombinanthuman coagulationFⅨgeneintheplasmaofmiceinjectedwith recombinantAAVvector Axisxstandsfortheweekspost-injection(beforeinjection,2,4,6,8, 10,12,14,16weeksafterinjection),axisystandsforthepercentageof coagulationfactorⅨ correspondingtotheUCRP.◆—◆:Mouse1; ■—■:Mouse2;▲—▲:Mouse3;×—×:Mouse4; — :Mouse5;●—●: Mouse6. ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ● ●● ● ● ● ● ● ● ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲▲ ▲ × × × × × × × × × × × × ×× × × × × × 1200 1000 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Weeksafterinjection hF 9/ % × 83· · 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2007;34(1) Fig.6ImmunohistochemicalanalysisofrecombinanthFⅨ indifferentorgansofmicetransfected withrAAV8virus Panel(a)isfromthehindlegmuscle,panel(b)isfromtheheartmuscle,panel(c)fromliver,panel(d)fromkidney, panel(e)fromabdominalmuscle,panel(f)fromtheovariantissueofacontrolmouse.(originalmagnification:×100). (a) (b) (c) (d) (e) (f) 3 讨 论 凝血因子Ⅸ是体内肝细胞产生的，凝血因子Ⅸ 的基因变异造成凝血障碍，临床上表现为乙型血友 病.乙型血友病已成为利用重组AAV病毒进行基 因治疗研究的一个典型的疾病模型.乙型血友病基 因治疗的靶细胞多为肌细胞和肝细胞等.AAV病毒 载体进行基因治疗的途径有多种，如肌肉注射，静 脉注射和门脉注射等. 随着 AAV病毒载体的不断发展，已有近 10 种不同血清型 AAV病毒载体用于基因治疗研究. AAV2是研究得最为清楚的一种腺相关病毒血清 型，但它转染细胞的能力较弱.如有实验报道，通 过静脉注射 AAV重组病毒产生的凝血因子Ⅸ仅 55～110!g/L，肝门静脉注射AAV病毒载体产生 的血浆凝血因子Ⅸ为 200～320"g/L[8].另有报道， 肝门静脉注射hFⅨ的AAV病毒载体到小鼠体内， 可产生正常血浆中的16%～25%的人凝血因子Ⅸ[3]， 相当于800～1250#g/L.肌肉注射AAV2病毒在小 鼠血浆中产生约300$g/L的hFIX[9].AAV1病毒对 肌肉的感染型很强，有研究报道，肌肉注射AAV1 重组病毒在小鼠体内表达的狗凝血因子Ⅸ高达 80mg/L,而AAV2介导的表达仅为90%g/L[10].可见 不同的血清型AAV感染细胞表达转基因的能力相 差很大. AAV8是从猴子组织中分离出来的新病毒.与 早先的AAV2相比，AAV8感染细胞的能力强，感 染的细胞种类多[11,12].AAV8感染肝脏细胞，比 AAV2的感染能力强10到100倍[11,13～15].一次肝门 静脉或尾静脉注射AAV8重组病毒即可有效感染 肝细胞[16].AAV8感染骨骼肌细胞的能力也很强， 与AAV1相当.而且，经腹腔注射的AAV8病毒能 经血液循环转运到其他组织器官，尤其是其感染心 脏和骨骼肌细胞的能力甚至比AAV1还强[2]. 本文探讨 AAV8病毒载体经腹腔注射后病毒 的分布和基因表达效果.结果显示，AAV8病毒载 体经腹腔注射后在小鼠体内有效地表达了人凝血因 子Ⅸ基因，通过特异的抗人凝血因子Ⅸ单克隆抗体 检测注射2周后血浆中有明显的表达产物.相比之 下，注射前的小鼠血浆中未能检测到人凝血因子 Ⅸ.这是因为所用的小鼠的凝血因子Ⅸ基因被剔除， 而且选用的抗体也只与人凝血因子Ⅸ反应. 测定小鼠血浆样品的活化部分凝血活酶时间 (APTT)显示，病毒在小鼠体内表达的人凝血因子 Ⅸ具有凝血活性.利用10倍稀释的血浆样品可以大 大缩短人凝血因子Ⅸ缺乏的血浆活化部分凝血活酶 时间，有的样品可以使活化部分凝血活酶的时间减 少至32s，相当于约1500%的凝血因子.而注射病 毒前的血浆促使人凝血因子Ⅸ缺乏的血浆凝血的活 性非常差，检测到的活化部分凝血活酶的时间超过 300s，意味着几乎没有人凝血因子Ⅸ活性. 通过免疫组化实验分析发现，病毒经腹腔注射 84· · 曹佐武等:8型AAV重组病毒介导的凝血因子的基因表达2007;34(1) 后，在肝脏、心脏、肾脏检测到明显的表达，而在 腹肌、后腿肌肉细胞中也有表达.说明病毒可通过 血液向全身扩散，有效感染其他器官组织. 与标准血浆相比，100%的凝血因子相当于正 常血浆 1/5的凝血因子，即为 1mg/L的凝血 因子Ⅸ.据此，本实验的表达量峰值达到10mg/L 左右的凝血因子Ⅸ，比以往大多数研究报道的值还 高.可见，腹腔注射重组AAV8病毒获得高表达的 凝血因子Ⅸ. AAV病毒介导转基因的表达效果与其血清型、 表达载体的结构和注射途径有很大关系.本实验中 通过腹腔注射AAV8重组病毒获得了高表达的凝 血因子Ⅸ，原因可能有：腹腔注射的 AAV8病毒 已经过血液循环进入身体多组织器官；AAV8病毒 能高效感染内脏和骨骼肌细胞；表达载体pCAhF9 中凝血因子Ⅸ的cDNA上游有一个CMV增强子和 CBA启动子，这些是很强的表达调控元件. 基因表达的量和维持的时间还与注射剂量有 关[14].本文中的小鼠注射5×1010gc病毒，注射2周 后有明显的基因表达，1个月后表达水平达到高峰. 高峰水平维持到2个月以后，然后表达量下降.由 于AAV8转移基因与病毒剂量有明显关系，可以 预想，增加病毒的剂量，如 2.5×1011gc[10]、5× 1011gc[14]，基因表达可望明显增强，表达维持时间 也可能明显延长. 另外，小鼠年龄对病毒的接受性也有影响.本 实验选用约4周龄的幼鼠，鼠龄过大对病毒的反应 差(未发表数据). 从免疫组化结果看，重组病毒表达的凝血 因子Ⅸ向肝脏和肾脏管腔分泌，这与表达载体的分 泌信号肽有关.但是，过量的凝血因子进入血液是 否会引起过度凝血尚需要进一步探讨以确定基因治 疗的最佳剂量.凝血是一系列的因子活化和相互作 用的复杂过程，单一因子的过量表达并不一定引起 过度凝血，正常血液中的凝血因子Ⅸ比实际需要的 量高许多，通常血浆中5%的凝血因子Ⅸ即可以防 止乙型血友病. 综上所述，本项研究利用新型的AAV8重组 病毒载体介导人凝血因子Ⅸ在小鼠体内的表达，在 血浆中产生了高表达量的功能活性凝血因子Ⅸ，腹 腔注射的AAV8病毒已经过血液循环进入身体多 组织器官，并高效感染肝脏、心脏、肾脏和肌肉细 胞，高效表达人凝血因子Ⅸ. 参 考 文 献 1 GaoGP,AlviraMR,WangL,etal.Noveladeno-associatedviruses fromrhesusmonkeysasvectorsforhumangenetherapy.ProcNati AcadSciUSA,2002,99(18):11854～11859 2 WangZ,ZhuT,QiaoCP,etal.Adeno-associatedvirusserotype8 efficiently delivers genes to muscle and heart. 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Adeno-associatedvirusvectorsserotypedwithAAV8capsidare moreefficientthanAAV1or-2serotypesforwidespreadgene deliverytotheneonatalmousebrain.Neuroscience,2006,138(2) 501～510 12KleinRL,DaytonRD,LeidenheimerNJ,etal.Efficientneuronal genetransferwithAAV8leadstoneurotoxiclevelsoftauorgreen fluorescentproteins.MolecularTherapy,2006,13(3):517～527 13BarbonCM,ZieglerRJ,LiC,etal.AAV8-Mediatedhepatic expressionofacidsphingomyelinasecorrectsthemetabolicdefectin thevisceralorgansofamousemodelofniemann-pickdisease. MolecularTherapy,2005,12(3):431～440 14DavidoffAM,GrayJT,NgCYC,etal.Comparisonoftheability ofadeno-associatedviralvectorspseudotypedwithserotype2,5, and8capsidproteinstomediateefficienttransductionoftheliverin murineandnonhumanprimatemodels.MolecularTherapy,2005, 11(6):875～888 15SarkarR,TetreaultR,GaoGP,etal.Totalcorrectionofhemophilia amicewithcanineFVⅢ usinganAAV8serotype.Blood,2004, 103(4):1253～1260 85· · 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2007;34(1) *ThisworkwassupportedbyagrantfromTheNationalNaturalScienceFoundationofChina(30271370). **Correspondingauthor.Tel:86-20-31545871,E-mail:caozuowu@yahoo.com.cn Received:June13,2006 Accepted:August31,2006 StudyonTheExpressionofCoagulationFactor MediatedbyRecombinantAAVSerotype8* CAOZuo-Wu1)**,LIGuan-Gui1),LIANGYu-Qiang1),HEDong-Mei2) (1)CollegeofLifeScienceandTechnology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China; 2)InstituteofHematology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China) Abstract RecombinantAAVserotype8(rAAV8)vectorisnewandpromisingforgenedelivery，which transducesmuscularandhepaticcellshighlyefficiently.Thetransductionvarieswiththeadministrationroutes.It wasobservedthattherAAV8virusinjectedintraperitoneallyhadbeendeliveredtomanydifferenttissuesthrough thebloodcirculationandresultedinextensiveandprolongedgeneexpression.Theinterestgene(human coagulationfactorⅨ)hasbeenhighlyexpressedviatherAAV8vectorinjectedintraperitoneallyintomiceatthe doseof5×1010gc/mouse.Considerableexpressionwasdetectedinmouseplasmaattwoweeksafterthe administration.Expressionpeakupto1000%levelcomparedtotheUCRPoccurredbetween1~2monthsafter administration,andthentheexpressiondeclinedgraduallybutobviousexpressionpersistedat4months postadministration.APTTtestprovedtheclottingactivityoftherecombinanthFⅨ inmouseplasma. Immunohistochemicalassayshowedthatthehumancoagulationfactorhasbeenexpressedsignificantlyinseveral organsincludingliver,kidney,heartandmuscles(abdominalandhindleg).ThesesuggestthattherAAV8virus injectedintraperitoneallyhasbeendeliveredviabloodcirculationandtransduceddifferentcellsofmulti-organs, andtheproductofthegenemediatedbytherAAV8vectorisbiologicallyactive. Keywords AAV,intraperitonealinjection,coagulationfactor 16 DingZ, GeorgievP, Th!nyB. Administration-routeand gender-independent long-term therapeutic correction of phenylketonuria(PKU) inamousemodelbyrecombinant adeno-associatedvirus8pseudotypedvector-mediatedgenetransfer. GeneTherapy,2006,13(7):587～593 86· ·