原花青素对局灶性脑缺血后凋亡基因Fas表达的影响

　基金项目 : 锦州市科学技术局计划项目 , 编号 : 05A1E31。 　作者简介 : 刘畅 (1975) , 女 , 辽宁省锦州市人 , 主治医师 , 硕士学位 , 主要研究方向为脑血管病的基础和临床研究。 原花青素对局灶性脑缺血后凋亡基因 Fas达的影响 刘畅 , 张萍 2 , 闵连秋 1 , 贾玉洁 1 , 刘学文 1 (11辽宁医学院附属第一医院神经内科 , 辽宁 锦州 121000; 21兴城中医医院 , 辽宁 兴城 125100) 　　摘要 : 目的 　探讨原花青素 ( Procyanidins, PC) 对局灶性脑缺血大鼠脑组织中凋亡基因 Fas表达的影响。方法 　随机 将 30只大鼠均分为假手术组、模型组、PC - 1组 (50 mg/kg)、PC - 2组 (100 mg/kg) 和 PC - 3组 (200 mg/kg )。各组 术前 2周及 1 h灌胃给予相应药物后以线栓法制备持续性局灶性脑缺血模型 , 24 h后断头取脑观察脑组织形态 , 并用免疫 组化 SABC法染色 , 统计大鼠海马 CA1区每高倍镜视野 Fas阳性表达率 [阳性细胞数 / (阳性细胞数 +阴性细胞数 ) × 100% ]。结果 　①脑组织病理变化 : PC各剂量组与模型组相比 , 海马 CA1区神经细胞存活数明显增多 [ (7513 ±411) / HP、 (7613 ±510) /HP、 (8215 ±711) /HP, (6218 ±618) /HP, P < 0101 ]。②免疫组化结果显示 PC组可以下调 Fas阳性 表达率 , 与模型组比较有显著性差异 ( P < 0101)。结论 　PC对局灶缺血性脑损伤具有保护作用 , 其保护作用机制可能与 抑制 Fas活性 , 从而减少细胞凋亡有关。 关键词 : 原花青素 ; 脑缺血 ; Fas 中图分类号 : R9152　　　文献标志码 : A　　　文章编号 : 1674 - 0424 (2009) 03 - 0207 - 03 Effects of Procyan id in s on Expression of Fa s in Foca l Cerebra l Ischem ia L IU Chang1 , ZHANG Ping2 , M IN L ianqiu1 , J IA Yujie1 , L IU Xuewen1 (1. The Neurological Department of the First Affiliated Hosp ital of L iaoningMedical University, J inzhou 121001 China; 2. Traditional Chinese Medical Hosp ital of Xingcheng, Xingcheng 125100 China) Abstract: O bjective　To study the effects of p rocyanidins on exp ression of Fas in focal cerebral ischem ia. M ethods　Random ly and equally , thirty rats were divided into the sham2operative group, focal cerebral ischem ic group and p rocyanidins group s of 50 mg/ kg, 100 mg/kg and 200 mg/kg. Embolization thread was inserted into all the rats excep t those in the sham2operative group for the es2 tablishment of model of m iddle cerebral artery occlusion. After the rats in PC2treatment group s were p rovided with corresponding doses of p rocyanidins. 2 weeks and 1 hour before MCAO by means of immunohistochem ical SABC under high power lens, histopathological changes were observed, as well as the immunohistochem istry changes of Fas. Results　①H istopathological changes: compared with ischem ia group, the number of survival neurons in the CA1 sector of the hippocampus of PC2treatment group s increased evidently [ (7513 ±411) /HP, (7613 ±510) / HP, (8215 ±711) / HP, (6218 ±618) /HP, P < 0101 ] . ② Immunohistochem istry of Fas showed that the positive rates of PC treatment group s were substancially less than that of model group ( P < 0101). Conclusion s　 Procyanidins p lays a neurop rotective role in the focal cerebral ischem ia which may be achieved by decreasing the positive exp ression of Fas. Key words: p rocyanidins; cerebral ischem ia; Fas 　　细胞凋亡 ( apop tosis) , 又称程序化细胞死亡 (p rogrammed cell death, PCD) , 是由外来因素触发 细胞内预存程序 , 启动级联式信息传导和基因表达 机制而引起的细胞自杀过程 [ 1 ]。既然凋亡是由基 因控制的细胞主动死亡过程 , 人们有可能在细胞凋 亡过程中 , 发现 “哨卡点 ”而抑制凋亡的发生。 原花青素 (p rocyanidins, PC) 属于缩合单宁 , 广泛分布于植物界 , 具有清除自由基、抗癌、抗炎 等作用 [ 2 ]。我们在以前的研究中观察到 PC对脑缺 血再灌注损伤具有神经保护作用 , 但其具体作用机 制还未完全明确 [ 3 ]。本实验利用大鼠大脑中动脉 阻塞 ( permanent m iddle cerebral artery occlusion, MCAO ) 模型 , 通过观察 PC对急性脑缺血大鼠的 脑组织病理改变及凋亡相关基因蛋白 Fas表达等的 影响 , 旨在对 PC的脑保护作用机制做进一步探 讨。 702 辽宁医学院学报 J L iaoning Medical University2009 Jun130 (3) 1　材料与方法 111　材料 11111　动物 健康雄性 SD大鼠 , 辽宁医学院动物实验中心 提供。许可证号 : SCXK (辽 ) 2003 - 0007。实验 动物级别 : 普通级。 11112　药品及试剂 PC粉剂 (由天津尖峰天然产物研究开发有限 公司提供 , 批号 : 20040719) 用双蒸水制成混悬 液。Fas试剂盒均购自武汉博士德生物试剂公司。 112　方 　法 11211　动物分组 将健康 SD 大鼠 60 只 , 随机平均分为 5 组 : 分别为假手术组、模型组和 PC1组、2组、3组。 PC1组、2组、3组分别于术前 2 周及术前 1 h灌 胃 PC混悬液 50、100、200 mg/ ( kg·d)。假手术 组和模型组 : 于术前 2周及术前 1 h灌胃等量的生 理盐水。 11212　大鼠局灶性脑缺血模型的制备 以线栓法 [ 4 ]制作大鼠 MCAO 模型。10%的水 合氯醛 ( 013 mL /100 mg) 腹腔注射麻醉大鼠后 , 分离右颈总动脉并剪一小口 , 将头端烧成光滑杵状 的国产尼龙线 (直径 01235 mm , 长 6 cm ) 插入 , 以颈总动脉分叉处计算进线深度为 ( 18 ±015 ) mm , 至大脑中动脉起始部以完全阻断血供。模型 成功的标志是大鼠即刻出现右侧 Horner征。假手 术组除不插入线栓外 , 其他操作步骤同上。 11213　HE染色 每组随机取 6只大鼠 , 经对侧颈动脉先后用冰 生理盐水 50 mL及质量浓度 40 g/L多聚甲醛 50 mL 行局部灌流内固定后 , 迅速断头取脑 , 放入质量浓 度为 40 g/L多聚甲醛固定液中继续固定 24 h。自 额叶至枕叶分为 A、B、C、D、E 5等份 , 取 C脑 片 [ 5 ]常规酒精脱水 , 石蜡包埋 , 制成 5μm厚的切 片 , 行苏木素 - 伊红 (HE) 染色。每张切片在结 扎侧海马 CA1区取 3个不同视野 ( ×400) , 计数 每视野的存活神经细胞数。 11214　计算大鼠脑组织海马 CA1区 Fas蛋白阳性 表达的细胞率 术后 24 h大鼠脑组织用 4%多聚甲醛局部灌流 内固定 , 然后迅速取脑。自额叶至枕叶分为 A、B、 C、D、E 5等份 , 取 C脑片 [ 5 ]17 - 19常规酒精脱水 , 石蜡包埋 , 制成 5μm厚的切片。将其进行免疫组 化 SABC法染色 , 严格参照武汉博士德生物试剂公 司说明书操作。 细胞胞质含有棕色颗粒的细胞为阳性细胞。每 个大鼠脑取 1张切片 , 于每张切片缺血侧海马 CA1 区取 3个高倍镜视野 (10 ×40) 共 18个视野 , 胞 浆有棕色颗粒者为阳性细胞 , 用 C IAS - 1000型高 清晰度彩色病理图文分析系统分析计算每个高倍镜 视野阳性细胞表达率 (阳性细胞数 /阳性细胞数 + 阴性细胞数 ) ×100%。 11215　统计学处理 数据均用 珋x ±s表示。多组间比较采用单因素 方差分析检验 , 两组间比较采用 LSD - t检验。 P < 0105认为差异有显著性 ; P < 0101认为差异非 常显著。 2　结 　　果 211　不同剂量 PC对局灶性脑缺血大鼠脑组织形 态学的影响 本实验结果显示 : ①假手术组 : CA1区神经细 胞计数为 (10512 ±412) /高倍视野 (HP)。②模 型对照组 : 大鼠脑组织发生明显的病理性改变 , 神 经细胞数减少 , (6218 ±618) /高倍视野 , 与假手 术组比较差异有显著性 ( P < 0101)。退变的神经 细胞多数显示出凋亡的形态学特征 : 胞浆浓缩 , 核 质凝集、分离包裹成多个圆形、规则的蓝紫色染色 质块 , 形成凋亡小体。③PC低、中、高 3个剂量 组结构完整的神经细胞数则明显增多 , 分别是 (7513 ±411) /高倍视野、 ( 7613 ±510) /高倍视 野、 (8215 ±711) /高倍视野。此 3个剂量组神经 细胞死亡率均较模型组明显减低 , 差异显著 ( P < 0101)。且呈剂量依赖关系。 表 1　不同剂量 PC对 M CAO大鼠海马 CA1区神经细胞 存活个数的影响 (珔x ±s, n = 18) 组　别 给药剂量 (mg/kg) 神经细胞存个数 ( /HP) 假手术组 NS 10512 ±4123 3 模型组 NS 6218 ±618 PC - 1 50 7513 ±4113 3 PC - 2 100 7613 ±5103 3 PC - 3 200 8215 ±7113 3 　注 : 3 3 与模型组比较 , P < 0101; NS: 019%生理盐水 212　不同剂量 PC对局灶性脑缺血大鼠 Fas蛋白表 达的影响 本实验结果显示 (如图 1) : ①假手术组 (见 图 1 a ) Fas阳性细胞散在分布于大鼠脑组织。 ②模型组 (见图 1 b) 大鼠海马 CA1区 Fas阳性细 胞率为 ( 52102 ±4169 ) % 显著高于假手术组 [ (7147 ±3150) % , ( P < 0101) ] , 其阳性免疫反应 802 辽宁医学院学报 　2009年 6月 , 30 (3) 呈棕褐色 , 位于神经元胞质及部分突起。③PC低、 中、高剂量组 (见图 1 c、图 1 d、图 1 e) 大鼠脑 组织 Fas 阳性细胞表达率分别为 ( 27150 ± 5120) %、 (26148 ±7121) %、 (22161 ±4150) % , 显著低于模型组 ( P < 0101) , 但各剂量组之间无 显著性差异 ( P > 0105)。 表 2　不同剂量 PC对 M CAO大鼠海马 CA1区 Fa s蛋白表达的影响 (珔x ±s, n = 18) 组别 给药剂量 (mg/kg) 表达率 ( % ) 假手术组 NS 7147 ±31503 3 模型组 NS 52102 ±4169 PC - 1 50 26148 ±71213 3 PC - 2 100 27150 ±51203 3 PC - 3 200 22161 ±41503 3 　注 : 3 3 与模型组比较 , P < 0101; NS: 019%生理盐水 3　讨 　　论 311　PC对 MCAO后脑组织病理形态的影响 从病理形态学来看 , 大鼠持续性脑缺血 24 h 后海马 CA1 区神经细胞的存活数仅为 ( 6218 ± 618) /高倍视野 , 而 PC组可显著增加缺血海马 CA1区细胞存活率 , 从而显示出神经保护作用。 312　PC对 MCAO后凋亡相关基因的影响 Fas基因属于肿瘤坏死因子受体和神经生长因 子受体家族的细胞表面分子 , 是主要的凋亡促进基 因 [ 6 ] , 其内含有一段约 80个氨基酸组成的肽链 , 在细胞凋亡过程中起传递细胞凋亡信号的作用 , 称 之为死亡区域 [ 7 ]。Fas促凋亡的机制有 : (1) 当细 胞表达 Fas时 , Fas与天然配体 FasL或 Fas抗体结 合后可向细胞内传递死亡信号 , Fas死亡区发生交 联 , 诱导神经鞘磷脂酶 Smase的活化 , 分解鞘磷脂 ( sphingomyelin, SM ) 生成神经酰胺 ( CM ) , CM 通过膜结合性的丝 /苏氨酸蛋白激酶等激活第二信 使途径 , 激活内源性核酸内切酶 , 使细胞核 DNA 断裂 , 引起表达 Fas 的靶细胞在数小时内凋 亡 [ 8 - 10 ]。 (2) Fas与 Fas - L结合后可诱导 caspase 家族级联反应促进细胞凋亡 [ 11 ]。 本实验发现 : 局灶性脑缺血 24 h后出现 Fas 阳性表达 , 其阳性细胞主要分布在梗死灶周边区 , 缺血中心区可见少量表达 , 缺血区以外和对侧皮层 少见阳性表达。高倍镜下观察 (见图 2 b) , Fas阳 性细胞主要位于海马神经元胞质及部分突起 , 但也 出现了神经胶质细胞的表达。说明 Fas介导的细胞 凋亡既与神经元的凋亡相关 , 又参与了胶质细胞的 凋亡。模型组大鼠脑组织 Fas阳性细胞率显著高于 假手术组 , PC低、中、高剂量组大鼠脑组织 Fas 阳性细胞表达率显著低于模型组。提示 : Fas是诱 导细胞凋亡的重要细胞膜受体 , 而 PC可以显著降 低 Fas的表达 , 有效地降低了 Fas和 FasL结合 , 抑 制凋亡信号的传递 , 可能是其神经细胞保护作用的 重要机制之一。本实验显示 : PC低、中、高剂量 组均可以使 Fas基因表达下调 , 与模型组比较有显 著性差异 ( P < 0105) , 提示 PC可能通过下调 Fas, 从而起到抗凋亡的作用 , 避免神经后遗症的发生 , 发挥神经保护作用。但是在 Fas的阳性表达上 , 各 剂量组之间比较无显著性差异 , 说明 PC抑制神经 细胞凋亡的作用在一定范围内与剂量无关 , 机制尚 不清楚 , 推测可能与凋亡受多种因素调控有关。 (此文图 1见附页 2) 参考文献 : [ 1 ] 　D irnagl U, Iadecola C, Moskowitz MA1 Pathobiology of ischae2 m ic stroke: an integrated view [ J ]. 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