葡萄子原花青素对糖尿病大鼠主动脉载脂蛋白A_表达的影响

收稿日期 :2009201213 基金项目 :国家自然科学基金资助课题 (30873145) 。 作者简介 :翟茜 (1974 - ) ,女 ,博士研究生 ,主治医师 ,主要从事糖尿病大血管病变防治机制的研究。 通讯作者 :高海青 (1952 - ) ,男 ,教授 ,博导 ,研究方向为老年心血管疾病的发病机制和防治。E2mail :gaohaiqing @yahoo. com. cn 　文章编号 :1671 - 7554 (2009) 06 - 0001 - 04 ·基础医学· 葡萄子原花青素对糖尿病大鼠主动脉 载脂蛋白 A2Ⅰ达的影响 翟茜1 ,李保应2 ,高海青2 ,江蓓3 (山东大学齐鲁医院 1. ICU 科 , 2. 老年病科 , 3. 肾内科 , 济南 250012) 摘要 :目的 　观察葡萄子原花青素 ( GSPE) 对链脲佐菌素 (STZ) 诱导的糖尿病大鼠主动脉载脂蛋白 A2Ⅰ(apoA2Ⅰ) 的影响。方法 　雄性 Wistar 大鼠随机分成对照组 (C 组 , n = 10) 、糖尿病组 (DM 组 , n = 9) 和糖尿病 GSPE 治疗组 (DM + GSPE组 , n = 13) 。24 周后处死动物 ,留取主动脉标本 ,HE染色观察各组动物主动脉形态变化 ,并应用荧光 差异凝胶电泳技术观察 GSPE对糖尿病大鼠主动脉 apoA2Ⅰ表达的影响。结果 　糖尿病组大鼠主动脉内皮细胞肥 大 ,结构紊乱 ,平滑肌细胞增生 ,内弹力板破坏 ,管腔变小 ,经 GSPE治疗后 ,上述变化均未出现 ,血管结构接近对照 组。糖尿病组大鼠 apoA2Ⅰ表达较对照组明显下降 (DM 组ΠC 组 : - 1. 68) ,而应用 GSPE 治疗后 apoA2Ⅰ表达上调 (DM + GSPE组ΠDM组 :1. 77) 。结论 　GSPE 能够促进 STZ诱导的糖尿病大鼠主动脉 apoA2Ⅰ表达 ,该机制可能与 GSPE的血管保护作用相关。 关键词 :葡萄子原花青素 ;载脂蛋白 A2Ⅰ;大鼠 ,Wistar ;主动脉 ;荧光差异凝胶电泳 中图分类号 :R543. 1 ; R2332 　　　文献标志码 :A Effect of grape seed proanthocyanidin extracts on expression of aortic apolipoprotein A2Ⅰin diabetic rats ZHAI Qian1 , LI Bao2ying2 , GAO Hai2qing2 , J IANG Bei3 (1. Department of Intensive Care Unit ; 2. Department of Geriatrics ; 3. Department of Nephrology , Qilu Hospital , Shandong University , Jinan 250012 , China) Abstract : Objective 　To explore the effect of grape seed proanthocyanidin extracts ( GSPE) on expression of aortic apolipopro2 tein A2Ⅰ(apoA2Ⅰ) in streptozotocin(STZ) induced diabetic rats. Methods 　Male Wistar rats were randomly divided into the control group (group C , n = 10) , the diabetic group (group DM , n = 9) and the GSPE treatment diabetic group (group DM + GSPE , n = 13) . All animals were sacrificed after 24 weeks , and the aortas were excised about 1 cm from the end , fixed in 10 % formaldehyde , embedded in paraffin and cut into 4μm2thick sections for light microscopy. Then they were stained with hematoxy2 lin2eosin under a light microscope at a magnification of 200 ×. In addition , difference gel electrophoresis technique was used to analyze the effect of GSPE on expression of aortic apoA2Ⅰ. Results 　In diabetic rats , hypertrophy and disarray of endothelial cells occurred , and proliferation of smooth muscle cells were observed in the aortic wall , and the internal elastic laminae were im2 paired. The lumina of the aorta became smaller. After treatment of GSPE , light microscopic findings were similar to those of the control rats. Expression of aortic apoA2Ⅰwas the lowest in the diabetic group (DM groupΠC group : - 1. 68) , but after treatment with GSPE , it was up2regulated (DM + GSPE groupΠDM group :1. 77) . Conclusion 　GSPE can promote expression of aortic apoA2Ⅰin diabetic rats , which may play a role in the angio2protective function of GSPE. Key words : Grape seed proanthocyanidin extracts ; Apolipoprotein A2Ⅰ; Rats , Wistar ; aorta ; Difference gel electrophoresis 　第 47 卷 　第 6 期 　Vol. 47 　 No. 6 　 　 　 　 　 山 　东 　大 　学 　学 　报 　(医 　学 　版) JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY(HEALTH SCIENCES) 　 　 　 　 　 2009 年 6 月 　 Jun. 2009 　 　　载脂蛋白 A2Ⅰ(apolipoprotein A2Ⅰ,apoA2I) 是高 密度脂蛋白 ( high density lipoprotein , HDL) 最主要的 蛋白成分 ,血浆中 HDL 的含量与心血管疾病的发生 呈负相关性 , apoA2I 对心血管系统保护作用明 确[122 ] 。动物实验表明 ,葡萄子原花青素 (grape seed proanthocyanidin extracts , GSPE) 具有抗氧化、抗动脉 硬化及保护心血管等作用[3 ] 。本实验建立链脲佐菌 素 (streptozotocin ,STZ) 诱导的糖尿病大鼠模型 ,应用 荧光差异凝胶电泳技术 (difference gel electrophoresis , DIGE) 联合质谱分析初步探讨 GSPE 对主动脉组织 内 apoA2I表达的影响及其与主动脉病变的相关性 , 为进一步探讨糖尿病大血管病变发病机制、寻求药 物靶点提供线索。 1 　材料与方法 1. 1 　材料 　STZ购自美国 Sigma 公司。GSPE(天津 尖峰天然产物研究开发有限公司 ,注册商标 : Gra2 jnol ,批号 : G050412 ,高效液相法分析 GSPE 显示 :原 花青素含量 96. 63 %) 。Cy2 , Cy3 , Cy5 , IPG胶条、缓 冲剂购自通用电气公司医疗集团。硫脲购自 Fluka (Buchs , Switzerland) 。Urea、CHAPS、DTT、Bradford assay kit 来自于BioRad 公司 (Hercules) 。蛋白酶抑制 剂复合物购自 Roche (Mannheim , Germany) 。修饰后 的胰蛋白酶 (sequencing grade)来自 Promega (WI) 。其 余缓冲液 来自Milli2Qwater (Millipore , Bedford ,MA) 。 其余试剂为国产分析纯。 1. 2 　动物模型的建立 　雄性健康 Wistar 大鼠 30 只 ,鼠龄 12 周 ,体质量 180～220 g ,由山东大学实验 动物中心提供 ,合格证号 D20021024。喂养 7 d 后 , 实验前禁食 12 h ,一次性尾静脉注射 0. 1 %STZ柠檬 酸缓冲液 55 mgΠkg ,正常对照组注射同等剂量的柠 檬酸缓冲液。注射 72 h 后 ,取大鼠尾血测定血糖 (采用强生公司 One Touch Ⅱ血糖仪) ,血糖 ≥16. 7 mmoΠL 为糖尿病模型成功的标准。稳定 1 周后开始 实验。 1. 3 　实验分组 　实验前随机测定动物血糖、称重。 按空腹体质量编号 ,随机选出 15 只作为正常对照组 (C组 , n = 15) 。造模成功的 30 只大鼠随机分为糖 尿病组 (DM 组 , n = 15) ; GSPE 治疗组 (DM + GSPE 组 , n = 15) 。DM 组每天给予生理盐水灌胃 ,DM + GSPE组每天给予 GSPE(250 mgΠkg) 灌胃。持续观察 24 周。实验结束时剔除因感染等原因死亡大鼠 ,实 际纳入统计大鼠共 32 只 ,其中 C 组 10 只 ,DM 组 9 只 ,DM + GSPE组 13 只。不同荧光染料标记见表 1。 表 1 　各组样本荧光染料标记设计 凝胶 Cy2 Cy3 Cy5 1 内标 C3 DM2 2 内标 DM + GSPE1 C2 3 内标 DM + GSPE2 DM1 4 内标 C2 DM + GSPE3 5 内标 DM3 C1 1. 4 　标本采集与检测 1. 4. 1 　主动脉标本采集和形态学检测 　所有大鼠 均脊髓脱臼处死 ,迅速分离胸主动脉 ,并用冰磷酸盐 缓冲液彻底清洗去除血液成分后 ,立刻置于液氮中 冻存。胸主动脉自根部切成 1 cm 左右的小段 ,在 10 %的甲醛中固定 ,石蜡包埋 ,切成 4μm 厚的切片 , 行苏木素 - 曙红染色 ,在 200 倍的光镜下观察。 1. 4. 2 　荧光差异凝胶电泳 　将 - 80 ℃保存的组织 标本取出 ,放入匀浆管 ,加入裂解液 ,包含 7 molΠL 尿 素 ,2 mmolΠL 硫脲 ,4 %CHAPS ,0. 2 % 两性电解质载 体 ,pH3210NL ( IPG缓冲液) 以及蛋白酶抑制因子复 合物。25 000 ×g 离心 1 h ,取上清置于另一洁净的 EP 管中 ,以蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度 (Bradford assay kit 试剂盒) 。按照 Ettan DIGE 使用手册 (通用 电气公司医疗集团) 介绍的步骤 ,按照相同剂量 (50 mg裂解液Π400 pmol 标记物) 分别以 Cy2 , Cy3 和 Cy5 标记样品 (pH 8. 5) ,Cy2 作为内标 (冰上 ,避光) 。 标记结束后 ,经 10 mmolΠL 冰赖氨酸终止反应 10 min。 加入水化液及 IPG buffer ,混合均匀 ,过夜。 第一相 IEF 为 pH 3～10 ,13 cm 非线性胶条 ( Et2 tan IPGphor System) ,通用电气公司医疗集团产品。 电泳条件 :60 kV·h 20 ℃。之后依次经含有 6 molΠL 尿素 ,30 %甘油 ,2 % SDS ,50 mmolΠL Tris2Cl ,pH 8. 8 , 0. 5 % (wΠv) DTT 或 4. 5 % (wΠv) 碘乙酰胺的溶液平 衡 ,将胶条置于 12. 5 % 聚丙烯酰胺凝胶上 (16 cm × 16 cm) ,固定于一个低荧光的玻璃板上再次电泳。 电泳条件 :5 h ,30 mA ,Hofer SE 600 Series standard du2 al2cooled gel electrophoresis unit ( GEHealthcare) 。分别 于 488Π520 , 532Π580 , 633Π670 nm 处获取 Cy22 , Cy32 和 Cy52标记的影像 (Typhoon 9400 扫描仪 ,GE Health2 care) 。获得的 DIGE 图谱应用 DeCyder 软件 ( GE Healthcare)进行分析。注意避光。 1. 4. 3 　质谱鉴定 　染色的蛋白点从凝胶上切割下 来 ,脱色 ,然后用离心浓缩干燥仪进行干燥。加入 10μL 含有胰酶的 40 mmol/ L 碳酸氢铵溶液 ,淹没整 个胶块。密封试管 ,在 37 ℃孵浴 20 h。1 %甲酸终 止反应 ,分别用 50 %和 100 %的丙烯晴洗脱 ,上清转 移到新的试管中 ,剩下的凝胶 ,冻干浓缩 ,行 LTQ2 　 2　　　　 山 　东 　大 　学 　学 　报 　(医 　学 　版) 47 卷 6 期 　 ESI2MSΠMS 质谱分析。所获数据通过 MasslynxTM software (Micromass) 和 Mascot search software (http :ΠΠ www. matrixscience. com) 进行处理。通过与 NCBI 非 冗余哺乳动物数据库比较做蛋白鉴定。 2 　结　果 2. 1 　主动脉形态学改变 　镜下可见 ,糖尿病组大鼠 主动脉壁内皮细胞肥大 ,排列紊乱 ,平滑肌细胞增 生 ,内弹力板破坏。主动脉内壁不平滑 ,管腔缩小。 而经过 GSPE治疗后 ,上述变化均被抑制 ,光镜下所 见接近正常对照组。见图 1。 2. 2 　差异表达蛋白 　本实验应用 DIGE 测定正常 大鼠、糖尿病大鼠和经 GSPE 治疗的糖尿病大鼠主 动脉组织中的差异蛋白 ,发现明显的差异蛋白点 ,在 DM组表达下调 ,而经 GSPE治疗后表达回升 (DM 组ΠC组 :21. 68 ;DM + GSPE 组ΠDM 组 : 1. 77) 。经质谱 鉴定该差异蛋白为 apoA2I 。见图 2～图 5。 图 1 　各组大鼠主动脉显微结构 ( ×200) A :C组 ; B :DM组 ; C :DM + GSPE组 Fig. 1 　Aortic microstructure of each group ( ×200) A : C group ; B : DM group ; C : DM + GSPE group 图 2 　22DE图 (银染) ,数字所示为差异表达的蛋白 Fig. 2 　A representative 22D DIGE image (silver staining) of aortic lysates. Spot numbers correspond to the differential expres2 sion protein 　　　　图 3 　3 组差异蛋白点 1305 的折线图 A :C组 B :DM组 C:DM + GSPE组 　　　　Fig. 3 　The line chart of protein 1305 A : C group B : DM group C: DM + GSPE group 3 　讨　论 糖尿病大血管病变是糖尿病患者常见的慢性并 发症 , 也是糖尿病患者致死、致残的主要原因之 一[4 ] 。由于其发病机制尚未完全明了 ,目前缺乏有 效的防治措施。不少学者认为慢性高血糖状态所诱 发的氧化应激反应在其中发挥了重要作用[5 ] 。 GSPE是从葡萄子中提取的多酚类混合物 ,其原 花青素含量超过 95 % ,体内外实验均证实其抗氧化 的作用明显优于维生素 C、E 和β2胡萝卜素 ,对氧自 由基引起的氧化应激反应有很好的化学保护作 用[3 ] 。本实验结果表明 ,经过 GSPE 治疗后糖尿病 大鼠主动脉壁内皮细胞肥大、排列紊乱、平滑肌细胞 增生、内弹力板破坏等现象均有明显改善 ,光镜下所 见接近正常对照组。从而证实 ,GSPE除了可以有效 缓解糖尿病大鼠的神经病变[6 ] 和心脏病变[7 ] 外 ,尚 对糖尿病大血管病变具有保护作用。 DIGE可以在同一块凝胶上进行双向电泳 ,由于 每块凝胶中加入了内标 ,减少了普通双向凝胶电泳 中不同凝胶间的误差 ,是目前定量蛋白质组学研究 中可信度和准确性最高的技术之一。本实验应用 DIGE发现了三组动物的差异蛋白点 ,并经质谱分析 鉴定为 apoA2Ⅰ。在糖尿病大鼠主动脉组织中 , apoA2Ⅰ明显低于对照组 ,而经过 GSPE治疗后 apoA2 Ⅰ水平上调 ,从而提示 apoA2Ⅰ有可能参与到 GSPE 翟茜 ,等. 葡萄子原花青素对糖尿病大鼠主动脉载脂蛋白 A2Ⅰ表达的影响 3　　　　 　 对糖尿病大鼠的保护机制中。 图 4 　LTQ2ESI2MSΠMS鉴定蛋白点 1305 的质谱图 A :MS图谱 B :二级质谱图 Fig. 4 　The mass spectrum of protein 1305 identified by LTQ2ESI2 MSΠMS A : Peptide mass spectrum B : Secondary mass spectrum 　　　图 5 　3 组差异蛋白点 1305 的三维图 A :C组 B :DM组 C:DM + GSPE组 　　　Fig. 5 　The 3D simulation view of protein 1305 A : C group B : DM group C: DM + GSPE group 　　众所周知 ,apoA2Ⅰ是高密度脂蛋白的主要蛋白 成分 ,由肝和小肠合成 ,并在胆固醇自外周组织向肝 脏的逆向转运中发挥了重要作用。大量的临床试验 均已证实了 apoA2Ⅰ与冠状动脉粥样硬化之间的关 系[2 ] ,即 apoA2Ⅰ是冠状动脉的保护因子 ,其水平越 高 ,罹患冠状动脉粥样硬化的风险越低[8 ] 。不止如 此 ,有学者观察到应用 apoA2Ⅰ类似肽 D24F 治疗的 糖尿病大鼠循环中的氧自由基水平明显下降 ,动物 抗氧化和血管修复能力明显增强[9210 ] 。其作用机制 包括[11 ] : ①D24F 诱导血管血红素氧化酶21 和细胞外 超氧化物歧化酶高表达 ; ②D24F 可直接抑制氧化低 密度脂蛋白 (ox2LDL) 的产生 ; ③D24F 可以通过刺激 内皮细胞氮氧化合物酶和血红素氧化酶产生促进内 皮祖细胞自天然表型向防御型转换。因此 ,apoA2Ⅰ 也可能通过上述机制实现对血管的保护。 综上所述 ,GSPE对糖尿病大血管病变有一定的 治疗作用 ,促进 apoA2Ⅰ高表达可能是机制之一。是 否存在其他的作用途径尚需今后的实验进一步加以 验证。 参考文献 : [ 1 ] Zhao X Q , Brown B G. 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(下转第 19 页) 　 4　　　　 山 　东 　大 　学 　学 　报 　(医 　学 　版) 47 卷 6 期 　 的肽能够被内肽酶裂解分泌表达到细胞外[7 ] 。通过 感染外周细胞 ,作为加工厂分泌表达穿膜肽介导的 融合肽 ,实现体内持续表达的功能。加入的 TAT 是 一种具有蛋白转导功能的短肽 ,它能以非受体依赖和 非能量依赖的形式携带核酸 ,蛋白和肽自由的通过细 胞膜和核膜。因此加入的 TAT 能促进融合表达的 SAC2HA22TAT 凋亡肽向细胞和细胞核内的转导 ,使表 达分子无阻碍的进入残存的瘤细胞或转移的瘤细胞 起到持续性追杀肿瘤的目的[829] 。一次使用可以长期 表达 ,降低了实验费用 ,更接近临床特征。 本研究利用分子生物学技术 ,将编码致肿瘤细 胞特异凋亡的 SAC cDNA 插入到具有信号肽和穿膜 肽的序列中 ,构建了可分泌肿瘤细胞特异凋亡相关 肽的表达盒 ,为下一步将该表达盒插入腺伴病毒载体 并转染前列腺癌细胞 ,进行后续的动物实验以验证目 的基因 SAC对前列腺癌的治疗作用奠定了基础。 参考文献 : [1 ] Schayowitz A , Sabnis G, Vincent C O , et al. Synergistic effect of a novel antiandrogen , VN/ 12421 , and signal transduction inhibitors in prostate cancer progression to hormone indepen2 dence in vitro[J ] . Mol Cancer Ther , 2008 , 7 (1) :1212132. [2 ] Ntais C , Polyearpou A , Tsatsonlis A , et al. Molecular epide2 miology of prostate cancer : androgens and polymorphisma in androgen　related genes [J ] . Eur J Endocrinol , 2003 , 149 (6) :4692477. [3 ] El2Guendy N , Rangnekar V M. 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