壳聚糖对肉仔鸡外周血T淋巴细胞亚群的影响

壳聚糖对肉仔鸡外周血T淋巴细胞亚群的影响 金 晓 史彬林 李慧英 方丽惠 张彩芬 郭晓宇 陈志刚 金晓,内蒙古农业大学动物科学与医学学院,010018,呼 和浩特市赛罕区昭乌达路 306号。 史彬林(通讯作者)、李慧英、方丽惠、张彩芬、郭晓宇,单 位及通讯地址同第一作者。 陈志刚,内蒙古自治区赤峰市松山区家畜改良站。 收稿日期:2007-11-27 ★ 国家自然科学基金项目(30660130) 壳聚糖学名为(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D葡萄糖, 是甲壳素脱乙酰基的产物,属于天然来源的碱性多糖。 已有研究明,壳聚糖及其衍生物作为饲料添加剂能 改善动物生产性能,增强机体免疫能力,且具有无残留、 不易产生耐药性等优点,是近年来动物营养学研究的热 点之一。尽管壳聚糖不能为动物消化吸收(Gallaher等, 2000)[1],但一些研究结果表明[2-4],口服壳聚糖可增强机 体的细胞免疫功能和体液免疫功能。石明建等(1999)[5] 和陈海燕等(2007)[6]报道,壳聚糖可活化T淋巴细胞,加 速T细胞的成熟和分化,促进T淋巴细胞释放免疫因 子,激发机体细胞免疫应答,从而提高机体全身免疫应 答水平。朱立贤等(2003)[7]和史彬林等(2005)[8]研究了日 粮中添加不同水平壳聚糖对肉仔鸡免疫指标的影响, 结果发现,壳聚糖能增强肉仔鸡的免疫机能,并且存在 剂量依赖关系。目前关于壳聚糖对家禽免疫功能影响 的研究虽有一些报道,但在机理研究方面不够深入,尤 其在壳聚糖对肉仔鸡外周血T淋巴细胞亚群的影响方 面尚未见报道。本试验在前人研究的基础上,探讨了壳 聚糖对肉仔鸡外周血T淋巴细胞亚群的影响,旨在为 揭示壳聚糖对肉仔鸡的免疫作用机理提供参考。 1 材料与方法 1.1 试验动物及试验设计 选取 1日龄 AA健康雄性肉仔鸡 240只,采用完 全随机设计方法分为 6个日粮处理,每个处理5个重 复,每个重复8只鸡,进行为期6周的饲养试验。6种 试验日粮是分别在基础日粮中添加 0、50、200、500、 1000和2000mg/kg的壳聚糖配制而成,试验所用壳 聚糖购于山东济南海德贝海洋生物工程有限公司,脱 乙酰度为90.52%。 1.2 基础日粮及饲养管理 试验日粮为玉米—豆粕型日粮,基础日粮组成及 营养水平见表1。 表 1 基础日粮组成及营养水平(风干基础) 组成(%) 玉米 豆粕 豆油 石粉 磷酸氢钙 食盐 蛋氨酸 赖氨酸 微量元素预混剂 维生素预混剂 合计 营养水平 代谢能(MJ/kg) 粗蛋白(%) 钙(%) 总磷(%) 赖氨酸(%) 蛋氨酸(%) 1～21d 52.69 40.00 3.00 1.10 1.90 0.37 0.19 0.05 0.50 0.20 100.00 12.71 21.37 1.08 0.62 1.25 0.54 21～42d 58.98 33.80 3.00 1.80 1.25 0.37 0.07 0.03 0.50 0.20 100.00 12.78 18.99 1.03 0.55 1.10 0.39 生长阶段 项目 注:每千克基础日粮中添加Fe80mg、Zn80mg、Mn80mg、Cu8mg、I 0.35mg、Se0.15mg、VA3000IU、VD1250IU、VE15IU、VK 2.2mg、VB11.5mg、VB28.0mg、VB62.5mg、VB120.011mg、烟酸 44mg、泛酸11mg、叶酸0.9mg、生物素0.11mg、胆碱550mg。 试验前对鸡舍、用具进行消毒处理。试验鸡采用 肉鸡笼单层笼养,每一处理的 5个重复组在鸡舍内分 开布局,以减少环境因素的影响。鸡笼均采用红外线 加热装置自动控温,在前3d舍内温度保持 33℃,之 后每周降低3℃,直至降到21℃后保持恒定不变。试 验前期保持 23h/d、后期 14h/d光照,并采用机械通 风方式进行通风换气,每天人工清粪1次。试验鸡自 由采食、自由饮水,按常规免疫程序进行免疫。 1.3 测定指标及方法 分别在28、42日龄时,于各处理的每重复组随机 抽取1只鸡,从翅静脉采集抗凝血。取 1ml血样于试 管中,加入磷酸缓冲液(PBS)1ml,充分混匀,在盛有2ml 淋巴细胞分离液的试管中沿管壁缓缓加入上述混合 液,然后以 2000r/min离心 25min,用一次性吸管吸 取乳白色淋巴细胞层到预冷的离心管中,置于冰浴盒 中,加适量 PBS(1~2ml),混匀,4℃下以 2000r/min 离心 15min,倾弃上清液,再加适量 PBS,重复上述步 骤。倾弃上清液后,加入PBS500μl,混匀,分装200μl 混悬液2份,分别加入适量 CD4+、CD8+及 CD3+单抗, 混匀,在 4℃下避光孵育 30min后,加适量 PBS混 匀,4℃下以 1500r/min离心 5min,弃掉上清液,再 加适量 PBS后,用流式细胞仪测定 CD3+、CD4+、CD8+ 《 饲料工业》·2008年第 29卷第 6期 饲 养 试 验 41 值,并计算CD4+/CD8+比值。 1.4 数据处理 试验数据利用 SAS统计软件的回归分析程序进 行统计分析。 2 结果与分析(见表2) 从表 2可见,28和 42日龄时各壳聚糖添加组肉 仔鸡血液中 CD3+、CD4+及 CD8+含量测定值大多数高 于对照组,其中添加量为1000mg/kg时 3种 T淋巴 细胞亚群的含量均表现出较高水平。但从回归分析结 果看,在 28日龄时,仅有 CD8+含量随壳聚糖添加量 的增加呈显著的二次曲线上升变化(P=0.036),而CD3+ 和 CD4+则未出现明显的剂量依赖关系;在 42日龄 时,CD3+呈现较明显的一次线性(P=0.051)或二次曲 线(P=0.074)上升趋势,CD4+也呈显著的一次线性(P= 0.010)或二次曲线(P=0.038)升高,而 CD8+则未出现明 显的剂量依赖关系。 表2 壳聚糖对肉仔鸡外周血 CD3+、CD4+、CD8+及 CD4+/CD8+的影响 一次线性 0.873 0.051 0.968 0.010 0.544 0.939 0.126 0.010 二次曲线 0.986 0.074 0.589 0.038 0.036 0.195 0.069 0.008 0 28.22 25.37 16.07 17.04 17.31 15.19 0.93 1.19 500 22.80 32.46 17.78 21.46 19.71 18.60 0.93 1.24 1000 31.98 37.05 23.16 23.14 23.51 20.58 0.96 1.14 50 31.05 32.32 21.07 21.22 16.22 17.48 1.34 1.29 200 28.72 27.02 18.07 18.16 17.26 17.10 1.09 1.08 2000 27.47 35.28 17.23 26.68 13.14 15.80 1.55 1.78 28 42 28 42 28 42 28 42 日龄(d) CD3+(%) CD4+(%) CD8+(%) CD4+/CD8+ 项目 4.46 3.54 3.71 1.66 2.80 2.30 0.20 0.16 SEM 壳聚糖水平(mg/kg) P值 此外,CD4+/CD8+比值不论在 28或 42日龄时均以 2000mg/kg处理组最高。从回归分析结果看,CD4+/CD8+ 比值在 28日龄时呈现一定的一次线性(P=0.126)或二 次曲线(P=0.069)升高趋势,而在 42日龄时则呈极显 著的一次线性(P=0.010)或二次曲线(P=0.008)剂量依 赖关系。 3 讨论 T淋巴细胞亚群的稳定是维持机体正常免疫调 节功能所必需的,是评估机体细胞免疫功能的重要指 标。CD3+抗体检测T淋巴细胞总数;CD4+是辅助/诱导 细胞(Th/Ti)的标志,具有辅助 T细胞转变为效应 T细 胞、B细胞生成抗体和巨噬细胞活化等功能;CD8+是 抑制性 T细胞(Ts)的标志,维持机体内环境的稳定。 CD4+和 CD8+细胞是机体免疫调节的枢纽,CD4+/CD8+ 值较高时,表明机体处于较好的免疫状态,而当CD4+/ CD8+失调或缺陷时,可导致各种免疫疾病发生[9]。 目前,关于壳聚糖对肉仔鸡外周血T淋巴细胞亚 群影响的研究尚未见报道,然而在其它动物上的研究 已有少量报道。应自忠(2000)[10]对小鼠的研究发现,壳 聚糖能使小鼠外周血液中淋巴细胞总数和 T淋巴细 胞阳性率明显增高。本试验也得到了相似的研究结 果,添加壳聚糖使肉仔鸡血液中 CD3+、CD4+、CD8+及 CD4+/CD8+值有所增加,并随添加剂量增加呈一次线 性或二次曲线上升趋势,而且在42日龄表现出了更 为明显的剂量依赖关系。这说明日粮中添加一定剂量 的壳聚糖能提高肉仔鸡的细胞免疫水平,并且随着饲 喂时间的延续,这种免疫促进作用逐步增强。 4 结论 试验结果表明,日粮中添加一定剂量的壳聚糖可使 肉仔鸡T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+及 CD4+/CD8+ 有所增加,从而提高肉仔鸡的细胞免疫功能。 参考文献 [1] GallaherCM,MunionJ,HesslinkR,etal.Cholesterolreduction byglucomannanandchitosanismediatedbychangesincholes- terolabsorptionandbileacidandfatexcretioninrats[J].J.Nutr. Sci.,2000,130:2753-2759. [2] LimBO,YamadaK,NonakaM,etal.Dietaryfibersmodulatein- dicesofintestinalimmunefunctioninrats[J].J.Nutr.Sci.,1997, 127(5):663-667. [3] PelusoG,PetilloO,RanieriM,etal.Chitosan-mediatedstimula- tionofmacrophagefunction.Biomaterials[J].Biomaterials,1994,15 (15):1215-1220. [4]TokuraS,TamuraH,AzumaI.Immunologicalaspectsofchitinand chitinderivativesadministeredtoanimals[J].EXS,1999,87:279-292. [5] 石明建,刘惟莞,王红英,等.壳多糖免疫调节作用的实验观察[J]. 上海免疫学杂志,1999,19(2):116-118. [6] 陈海燕,张彬,何勇松.壳寡糖的制备及其生理功能[J].中国饲 料,2007(4):19-21. [7] 朱立贤,宋志刚,林海,等.壳聚糖对肉仔鸡生长与免疫功能的影 响研究[J].中国饲料,2003(4):15-17. [8] 史彬林,李德发,朴香淑,等.壳聚糖对肉仔鸡生长性能和免疫功 能的影响[J].中国畜牧杂志,2005,41(1):9-11. [9] 胡友军,林映才,周桂莲,等.补益类中草药提取物对黄羽肉鸡生 产性能和 T淋巴细胞亚群的影响 [J].中国畜牧杂志,2004,40 (9):23-25. [10] 应自忠.壳聚糖对荷瘤小鼠红细胞免疫的影响[J].中国公共卫 生,2000,16(9):831-833. (编辑:高 雁,snowyan78@tom.com) 饲 养 试 验 金晓等:壳聚糖对肉仔鸡外周血T淋巴细胞亚群的影响 42