脑组织冰冻切片

1.做脑组织的冰冻切片在前期的处理过程中很重要，因为脑组织非常软。不但要做前固定，最好是做全身灌注固定后，如果不做全身灌注固定，很难取出一个完整的大脑组织。再段头取脑置4度4％多聚甲醛中后固定24小时，然后依次置入剃度PB蔗糖溶液脱水，剃度可以设为15%，20%，30%分别过夜沉底即可。设剃度脱水是为了避免组织块冰晶的产生。冰晶在组织片上表现为圆形或椭圆行的空洞，影响实验结果。在做切片时可以做简单的HE染色即可分辨出是否有冰晶。防止冰晶的另一实验注意点是在做切片前的包埋过程，速冻，一般放-20度下15分钟即可，温度高如室温或者4度是达不到速洞效果的，温度太低如放在液氮罐中又导致组织块的碎裂。而且产生冰晶。 2.如果想要作出满意的漂亮的实验结果，特别是免疫双标共聚焦，那就要求更高，实验的每一步都要很严格，不是我说法夸张，是因为 做共聚焦要避免自发荧光的问题，而实验的每一步都可能产生自发荧光，比如 4％多聚甲醛灌注液，PB蔗糖等都可以产生让我们头痛的自发荧光问题，根据我的实验经验，国产的多聚甲醛作实验很容易产生自发荧光，难以避免，不过据我导师讲，他在国外做共聚焦不存在这些问题，所以我个人认为你不妨先做单标试试看，能避免自发荧光，那最大的难题就解决了。 3.是否做漂片还是贴片的问题，脑组织两种方法都可以，唯独共聚焦例外，做共聚焦要求片子一般为30-50um，厚片才能达到三维重建的效果。一般的贴片文献上提到的是20-30um用漂片，此法要求抗体用量较大，最好买国外原装的浓缩液。不过我做的脑片切过4um的做一般的普通免疫荧光可以。  楼上的几位同仁说得不错。就我们实验室的操作方法以及个人的体会说上几点： 1.如果灌注固定较好的话，完全可以省去后固定这个步骤。神经组织常规的固定液为4%的多聚甲醛，如果在其中再加入0.25-0.5%的戊二醛增加其固定时的交联作用，那么固定的效果就会更好些，脑或脊髓标本就会更硬些；我们一般用1000ml多聚甲醛固定至少2小时。 2.冰冻时的温度我们一般设置在－18摄氏度，效果较好。 3.脱水也是重要的一步：首先在多聚甲醛固定后用20%的PB蔗糖液400ml灌注脱水，取材后再用30%PB蔗糖液浸泡脱水过夜或更长些时间即可。   做脑组织冰冻切片,一般切片前需要固定,经过固定的脑组织切片冰晶少,细胞挤压变形小,切片完整,染色清晰,未固定的组织冰晶多,会影响观察结果.切完后, 看你是做漂片还是贴片,一般脑组织贴片难度较大,多用漂片,切完需马上漂洗后,按常规染色步骤进行. 最后,以中性树脂封片,若是HE染色或DAB染色,切片可以放置很久,甚至数年时间.  脑的冰冻切片最好是4％多聚甲醛灌注，再后固定24h，30%PB蔗糖浸至沉底。切片效果不错，可以贴片，不过技术要求高一些。BrdU,Nestin双标有一些窍门， BrdU博士德有进口分装,Nestin很多公司都有进口分装 灌注固定的效果之所以好，就是因为这种方法可以通过血管走行把固定液输送到动物全身各处，从而达到最佳的固定效果；同样，用该方法进行脱水也可得到较好的脱水效果，因为这种方法可在组织深部进行脱水，再结合取材后30%的PB蔗糖液浸泡脱水，会得到更好的脱水效果。而浸泡脱水只能从组织的外部通过渗透压逐步把组织深部的水脱出。 其实，条条大路通罗马，只要你习惯了一种可靠方法即可。