大肠癌患者T细胞亚群和NK细胞活性检测的意义

大肠癌患者 T细胞亚群和 NK细胞活性检测的意义 姬清华, 李国胜, 张汝一, 颜登国 (贵阳医学院附院肛肠外科, 贵州贵阳 � 550004) [摘 � 要 ] 目的: 通过检测大肠癌患者外周血 T淋巴细胞亚群及 NK细胞活性的表达, 研究大肠癌患者免疫状 况与肿瘤分期的关系, 以预测术后恢复情况。方法: 采用流式细胞分析法检测 60例大肠癌患者和 30例对照者 外周血中 T淋巴细胞亚群及 NK细胞活性。结果: 大肠癌患者 CD 4 +细胞值、CDM 4 + /CD 8 +比值下降且 NK细胞 活性显著降低, CD8 +细胞值显著高于对照组, 这种变化随临床分期的增高更加显著 (P < 0. 05) ;化疗后 CD4 +细 胞值、CD4 + /CD8 +比值的下降和 NK细胞活性的降低及 CD8 +细胞值的增高更为突出 (P < 0. 01); 术后发生转移 的患者 CD4+细胞值、CD4 + /CD8 +比值下降及 NK细胞活性下降, CD8 +细胞值再回升。结论: 大肠癌患者细胞免 疫功能明显紊乱, 并随病情进展及肿瘤转移而加重, 切除肿瘤有助于改善患者细胞免疫功能。 [关键词 ] 肠肿瘤; 淋巴细胞亚群; 杀伤细胞,天然; 流式细胞术 [中图分类号 ] R735. 34� � [文献标识码 ] A� � [文章编号 ] 1000-2707( 2010) 01-0047-03 Determ ination of T Cell Subgroups and NK Cells in Peripheral B lood of Colon Cancer Patients and Its C linica l Significance JIQ inghua, L IGuosheng, ZHANG Ruy,i YAN D engguo (Co lop ro cto logical D epar tm ent, The A ff iliated H osp ital of GuiyangM edical College, Guiyang 550004, Guizhou, China ) [Abstract] Objective: To detect lymphocyte T subsets and NK ce lls in peripheral b lood of patients w ith co lon cancer ( CC ), and to investigate the relationsh ip betw een the immune function and Dukes stage of the d isease. So as to prov ide information fo r prognosis of the pat ients after operation. Meth- ods: Lymphocy te T subsets and NK ce lls in peripheral blood of 60 CC patients and 30 hea lthy people ( contro l g roup) w ere detected w ith flow cytometry. Result: The amoun ts of T cell CD4 + and the ra- t ions o f CD4 + /CD8 + , and NK cyto tox ic ity w ere sign ificantly higher, and the amounts o fT cell CD8 + were sign ificantly low er in CC pat ients than those in control group; These changes became more obv-i ous a long w ith the decrease of Dukes stages of the disease ( P < 0. 05). A fter the chemo therapy, the increase of T cells CD4 + , CD4 + /CD8 + ratio, and NK cyto tox icity and the increase o f T ce ll CD8 + were gettingmore remarkable (P < 0. 01). The same occurred in cases w ithmetastasis after operat ion. Conc lusions: Cell immune function disorder occurs in CC patients, and becomes mo re severe along w ith the development of disease and m etastasis. Excision of tumor m ight benefit the improvement of cell immune function o f the patients. [Keywords] intestina l neop lasms; lymphocy te subsets; k iller ce lls, natura;l flow cytom etry � � 大肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一, 在我国大肠癌的发病率有逐年增高的趋势。现代 研究证实,肿瘤的发生发展与肿瘤宿主的免疫状态 密切相关,而机体抗肿瘤免疫效应中以细胞免疫为 主, T淋巴细胞亚群及 NK细胞在肿瘤免疫监视中 起中心调控作用,是机体抗肿瘤免疫的重要效应细 胞。对 60例大肠癌患者的外周血 T淋巴细胞亚群 和 NK细胞活性进行了测定, 并与 30例健康体检 自愿者进行对照,以探讨其临床应用价值。 1� 与方法 1. 1� 检测对象 大肠癌组共 60例, 均来自贵阳医学院附属医 47 第 35卷 � 第 1期 2010年 2月 � � � 贵 阳 医 学 院 学 报 JOURNAL OF GUIYANG MEDICAL COLLEGE � � � Vo.l 35� No. 1 2010�2 院肛肠科,术前未经化疗, 术后经病理证实,其中男 35例,女 25例,年龄 22~ 74岁,平均 52岁。Dukes 分期: B期 14例, C期 33例, D期 13例。对根治术 后完整随访的 31例患者动态观察 2年, 其中 8例 发生转移。对照组来自健康体检自愿者, 共 30例, 其中男 16例, 女 14例, 年龄 19 ~ 58岁, 平均 39 岁。 1. 2� 标本采集、处理及检测方法 用 EDTA-二钾抗凝真空采血管取外周静脉血 2 m ,l标本在 4 h内作染色处理。 60例大肠癌患者 术前和 30例健康体检者采血 1次; 28例患者根治 术前及术后完整随访 2周各采血 1次; 22例完整 随访患者化疗前及化疗后 2周分别采血 1次; 31 例患者根治术后, 23例无转移, 8例有转移,各采血 1次。 1. 3� 处理及检测方法 设阴性对照管和试验管, 分别加入荧光抗体 IgG1 / IgG2a、CD3 /CD4、CD3 /CD 8、CD3 /CD19、CD3 / CD16 + CD56、CD3 /Ant-iHLA-DR ( FITC /PE )、CD8 / Ant-i hla-D r( FITC /PE ) 20�,l在每管内加入抗凝全 血 100 � ,l立即充分混均, 室温避光孵育 30 m in,然 后加入 1倍稀释的溶血素 ( FACS溶解液 ) 2 m l裂 解红细胞,迅速混均置室温避光 8~ 12 m in后, 以 1 000 r/m in离心 5 m in, 弃上清液, 加入 2 m l PBS 洗涤 2次,弃上清液, 加入 1 m l PBS混匀将细胞悬 浮后立即流式细胞仪检测。采用美国 BD公司提 供的流式细胞仪 FACSC alibur, 以三色荧光微 球,启动 FACSCom 软件, 利用 Cellquest软件进行 标本检测及分析。 1. 4� 统计学处理 所有变量均以 x � s表示,以配对设计 t检测及 成组设计 t检验进行数据分析, P < 0. 05为差异有 显著性。 2� 结果 2. 1� 大肠癌患者 T淋巴细胞亚群及 NK细胞活性 与正常对照组相比较, 大肠癌患者 CD4 +细胞 值、CD4 + /CD8 +比值及 NK细胞活性均显著降低 (P < 0. 01) , CD8 +细胞值则显著升高 (P < 0. 01) , 见表 1。 2. 2� 大肠癌临床分期与 T细胞亚群及 NK细胞活 性的关系 大肠癌患者 T淋巴细胞功能和 NK细胞活性 与临床分期密切相关,随着肿瘤分期的进展和肿瘤 负荷的增大, 随着 CD4 + 细胞值、CD4 + /CD8 +比值 的减小及 NK 细胞活性逐渐减弱 ( P < 0. 05 ) , CD8 +细胞值逐渐增大。见表 1。 2. 3� 手术治疗、化疗对大肠癌患者 T细胞亚群及 NK细胞活性的影响 大肠癌患者根治术后 2周, CD4 + 细胞值、 CD4 + /CD8 +比值显著增大, NK细胞活性明显增 强,而 CD8 +细胞值下降, 手术前后差异有显著性 (P < 0. 05)。化疗后 2周, 患者外周血 CD4 +细胞 值、CD4 + /CD8 +比值下降, NK细胞活性显著减弱, 而 CD8 +细胞值增高 (P < 0. 01)。表明化疗使患者 T细胞及 NK细胞功能受到明显抑制, 见表 1。 2. 4� 术后 2年患者 T细胞亚群及 NK细胞活性 动态观察 31例随访资料完整的患者,其中有 8例大肠癌出现远处转移。有转移患者的 CD4 +细 胞值、CD 4 + /CD8 +比值下降, NK细胞活性降低,而 CD8 +细胞值又见回升, 与未转移者相比差异显著 (P < 0�01) ,见表 1。 表 1� 不同组别 T细胞亚群及 NK细胞活性 Tab. 1� A ctiv ities of d ifferent T ce ll subsets andNK cells in d ifferent groups before and after operation 例数 CD4 + CD8 + CD4+ /CD8 + NKA P 正常对照组 30 43. 95 � 3. 83 25. 43 � 2. 97 1. 66 � 0. 26 31. 36 � 20. 75 < 0. 01大肠癌组 60 31. 39 � 5. 02 31. 29 � 4. 00 1. 04 � 0. 28 20. 46 � 6. 72 Dukes分期 B期 14 37. 70 � 3. 93 27. 97 � 4. 02 1. 41 � 0. 15 32. 53 � 7. 97 � � � � � C期 33 35. 15 � 3. 00 29. 22 � 4. 43 1. 24 � 0. 11 24. 83 � 5. 60 < 0. 05 � � � � D期 13 30. 41 � 5. 13 35. 30 � 4. 55 0. 80 � 0. 24 14. 45 � 7. 49 手术前 22 32. 61 � 5. 39 31. 75 � 3. 51 1. 08 � 0. 19 21. 02 � 5. 42 < 0. 01手术后 2周 22 38. 53 � 5. 25 28. 80 � 3. 80 1. 33 � 0. 18 24. 27 � 4. 83 化疗前 28 35. 07 � 5. 61 26. 18 � 2. 70 1. 43 � 0. 32 23. 32 � 9. 00 < 0. 01化疗后 2周 28 28. 69 � 4. 58 33. 41 � 6. 00 0. 73 � 0. 15 19. 14 � 5. 77 无转移 23 39. 78 � 2. 80 26. 65 � 2. 69 1. 52 � 0. 13 27. 43 � 3. 15 < 0. 01有转移 8 28. 00 � 2. 71 38. 29 � 3. 35 0. 75 � 0. 17 14. 43 � 3. 51 48 贵 阳 医 学 院 学 报 � 35卷 � 3� 讨论 T细胞及 NK细胞是肿瘤免疫的重要效应细 胞, 是宿主抵抗肿瘤细胞生长的第一道防线 [ 1]。 机体正常的免疫机制有赖于辅助性 T细胞与抑制 性 T细胞比值的协调,故 NK细胞及 T淋巴细胞及 其亚群能够直接反映机体细胞免疫的状态。本研 究发现, 大肠癌患者 CD4 +细胞值、CD4 + /CD 8 +比 值及 NK细胞活性明显低于正常人,而 CD8 +细胞 值显著增高,表明细胞免疫功能严重受损,这与文 献报道的相一致 [ 2] ;且随 Dukes分期的进展而更趋 明显, 反映直肠癌患者机体的细胞免疫功能低下, 随着肿瘤的进展,机体抗肿瘤作用不断削弱,致使 肿瘤在体内长成繁殖并迅速扩散。多数学者研究 认为在肿瘤的发展过程中,肿瘤细胞分泌多种免疫 抑制因子,诱导和激发产生抑制性 T淋巴细胞, 使 CD4 + /CD8 +比值下降 [ 3 ]。大肠癌根治术后 2周患 者外周血 CD4 + T辅助细胞表达增加, CD4 + /CD8 + 比值增大, NK细胞活性显著增强, 抑制性 T淋巴 细胞减少, 这与文献报道的基本一致 [ 4, 5]。术后 2 年动态观察发现, 无复发及转移患者的 T淋巴细 胞及 NK细胞功能得到进一步改善,表明切除肿瘤 有助于改善患者的细胞免疫状态。大肠癌患者的 免疫抑制是肿瘤源性的,即与肿瘤分泌的可溶性免 疫抑制因子有关。切除肿瘤可使抑制因子减少,机 体的免疫监视功能得到恢复,宿主抗肿瘤免疫逐渐 增强,通过 MHC II类抗原 HLADR诱导出强烈的 T 细胞免疫应答, 导致 CD4 + T细胞的活化和产生各 种细胞因子, 从而使 NK细胞的活性增强,同时诱 导 CD8 +或 CD4 +细胞介导的 ADCC效应增强 [ 5~ 7]。 因此, 对大肠癌患者应尽可能施行根治手术,最大 限度地减轻肿瘤负荷及减少免疫抑制因子,以利于 患者免疫功能的重建及后续治疗 [ 8~ 10]。术后转移 患者 CD4 +细胞值、CD4 + /CD8 +比值再度减小, NK 细胞活性再度下降, CD8 +细胞值又见增大,与无瘤 生存患者相比差异有显著性。因此, 动态监测患者 T细胞亚群及 NK细胞活性对判断术后肿瘤复发 或转移有一定的参考意义。大肠癌患者化疗期间 细胞免疫功能抑制加重,不利于 T淋巴细胞和 NK 细胞的免疫监视作用,并导致各种感染的发生。因 此,对大肠癌患者化疗同时辅以免疫治疗以减轻化 疗对全身的免疫抑制作用是非常必要的。综上所 述,大肠癌患者的 T细胞亚群及 NK细胞活性水平 的检测,虽然不能直接反映患者免疫细胞对肿瘤的 攻击能力, 但对分析肿瘤的发展情况、判断疗效有 一定参考价值。 4� 参考文献 [ 1] 汤钊猷.现代肿瘤学 [M ]. 上海:上海医科大学出版社, 1993: 129- 132. 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