平阳霉素三种成份对ＣＨＯ细胞染色体

遗传 HFRFDITAS (Beijing) 8 (2): 28-30 1986 平阳霉素三种成份对CHO细胞染色体 畸变和SCE的影响 王钦南 费云标1)沈光平 宋海燕 （中国科学院遗传研究所，北京） 本文是继证实抗肿瘤药物平阳霉素(PYM) 不仅能诱发高等植物染色体畸变［+j，而且也诱 发哺乳动物染色体畸变，并提高其姊妹染色单 体交换（SCE）频率f21的研究之后，再次通过染 色体畸变和SCE测试体系，进一步探讨了PYM 三种成份A?A，和人对CHO-K 1细胞染色体 畸变和SCE率的影响。 PYM和博莱霉素(Bleomycin, BLM）都来 源于轮枝链霉菌属，其主要成份是由十多种主 核相同、末端胺体各异的糖肤类化合物所组成 的混合物。PYM和BLM都含有A?A，和A6o 前者的主要成份是AS，约占60多；后者的主要 成份是Aa，约占50-70务。，‘，。 因此，PYM是 属于博莱霉素族化合物。 欲查明PYM诱发染 色体畸变的特性，必须对它的各成份诱发染色 体畸变特性和SCE的频率，做更深人的研究。 材 料 与 方 法 1．细胞培养 将对数生长的CHO-K 1 细胞以2 X 10，细胞／毫升接种在含10外小牛 血清的Eagle'：培养液中，于二氧化碳培养箱内 (37 0c;）培养24小时待用。 2．化学试剂 培养24小时的细胞分别 以含10[Ag/ml BrdU的0.2, 0:4和1.0,ug/ml A, A，和A6培养液处理12小时，以101zg/ml BrdU 处理组为对照。尔后各试验组再置含10/z g/ml BrdU的培养液中37℃下修复40小时。收获 前4小时加秋水仙胺，最终浓度为0.41A g/ml, 以期得到更多中期相。 3.制备标本 材料处理完毕，摇动培养 瓶，用滴管轻轻地移出悬浮细胞，500g离心10 分钟，沉降细胞以0.075MKC1于37℃低渗8 分钟。然后以3:1的甲醇冰醋酸固定两次，每 次10分钟，冷冻法点滴制片，空气干燥。 4．染色封片 将风千老化24小时以上 的标本置人1.0M NaH,PO4(pH8)的溶液中，在 89℃的恒温水浴中解离10分钟，双蒸水冲洗 后以Giemsa溶液（3毫升原液，97毫升双蒸水） 20℃ 下染色3分钟，千燥后用加拿大树胶封 固。 由于 BrdU参人DNA，使处理后第二周 期的子染色单体对 Giemsa染料着色较淡[167 于是将处理后第一次和第二次分裂中期相细胞 清楚地区分开。结果在同一个标本上，可以分 析两个周期的染色体畸变和SCE的图象［[2110 结 果 和 讨 论 实验结果表明PYM三种成份A,, A，和A6 皆可诱发哺乳动物染色体种种畸变 ［图版110 其诱变能力是A6>A,>A,。 当各成份处理 液浓度为0.2 pg/ ml时，所诱发的染色体畸变频 率分别是：Ay: 9 0%o，As: 12多，A6: 15%；对 照组为2%。在试验浓度范围内，各处理组的 细胞畸变频率则随处理液浓度的升高而增加 （表1),诱发SCE频率也随处理液浓度的升高 而增加（表2)0 Wang Qinnan “ al.：Influence on Chromosomal Aberration and SCEs in Cells by Three Compo- nents of Pingyangmycin 1)现在中国科学院发育生物学研究所工作。 本文于1984年9月28日收到0 28 染色体型畸变 处理后第一次分裂的细胞，高浓度A,的处 理组（(1.0 Ecg/ ml)染色体型畸变较低 (50 } ), 可能是大剂量处理使细胞周期延迟，甚至细胞 分裂受抑制以致于染色体型畸变没得以充分表 现。其余各处理组的畸变类型，以染色体型畸 变的比例最高，占70外以上（参见表1)。用同 位素标记已经证明这一现象发生的主要原因是 BLM A,和A，在代谢过程中大量参人处在G1 期细胞的DNA中，仅少量分布在处于S和G2 期的细胞中U,231’很明显，A：和A，主要对G：期 细胞发生作用。后来柳惠图等’31以人的食道癌 细胞为材料，通过放射自显影技术研究A，的作 用机制，结果也证实上述事实的可靠性。同时 许多研究表明BLM族化合物诱发畸变的特性 是属于非依赖S期类型的化合物[9,141，其机制是 DNA修复损伤的正常机能遭受破坏，或者修复 发生错误，称之为错误修复。处在G1期受害的 细胞分裂时常出现染色体型畸变；在S和G2期 受害的细胞分裂时常出现染色单体型畸变［[131O 另外，还发现在畸变的细胞中出现双微体 (Double minutes, DM)（图版1, a)。双微体存 在是细胞癌化的标志［[15,18,19,321，换言之PYM可 使哺乳动物细胞癌变，关于这一点;fi7将在另 文讨论。 染色体碎裂 供试化合物还诱发出大量的绝 体碎裂 (Disintegration)（参见表1)。这种三象是因染 色质高度破坏而解体，是其它诱变I所少见的 特性。 Ohama等￡241曾报道过碎裂K着Muller 等[231和Haidle等1101发现低浓度的～BM使DNA 链上胸腺v p}脱落，造成单链断裂在高浓度 时，DNA链上4种碱基都脱落，导双链多重 断裂。后来Kuo[171认为BLM可使小体连接 部解体，而这种连接部对染色质紧盘绕起重 要作用，随之复合状态的染色质瓦。有人证 明［[8]碎裂发生在GZ期的染色体。 也说明在 这个时期细胞对诱变因素更敏感[111碎裂本身 也表现出染色体各部位对外来因素二感性的差 异。我们的试验结果表明，无论是，、A，和A4 使碱基脱落，或者使核小体连接部钵，最终都 引起碎裂发生。 微核 在试I a}中，高浓度（(1.0u g/ml)'] A，和A’ 处理组细胞中出现大量微核，分别畸变细胞 的47外、42外。这说明它们对染色所诱发的 裹1 平阳舞素三种成份对CHO细胞染色体琦变的形响 处 理 中期细胞 染色体型畸变 染色单体型畸变 微核 (Pg/ml) 碎裂 5 7 断裂 2 4 3 双着 丝点 2 1 1 环 3 1 2 2 1 断裂 2 4 2 2 4 3 3 易位 1 1 4 1 缺失 1 1 1 间隙 A, BrdU 0.2 10 0.4 10 1.0 10 100 100 100 1 9 14 17 人， 0.2 10 0.4 10 1.0 10 100 100 3 3 4 2 6 6 5 2 8 14 17 人 0.2 10 0.4 10 1.0 10 100 100 100 3 2 3 ： 1 162 18 8 19 CK 10 100 1 3 1)处理后第一次分裂的畸变细胞数。 29 断裂，最终形成微核。较低浓度的供试化合物 诱发微核的频率很低（参见表1)，可能是DNA 轻微的损伤易被修复，使微核数减少。这一结 果和它们诱发植物微核的试验结果相一致〔410 SCE 在处理后第二周期中，三种成份诱发SCE 的频率也随处理液浓度升高而增加（表2)。其 ，值：A2分别为0.07, 3.75和6.15; A，分别为 4.30, 8.11; A6为2.85, 7.26和8.760除0.2 Fag/ ml A：处理组外，其余各处理与对照相比较差异 都十分显著。 比较染色体畸变频率的提高和 SCE频率的增加，两者没有相关性，因为SCE的 形成并不意味着DNA损伤的消除，反之损伤也 未必促成SCE的形成[12,20,25,267 参 考 文 献 ［1］ 王钦南等：1981。环境科学学报，1(3): 265-269, 〔2] 王钦南等：1983。同上，3(1): 78-840 ［3]张 瑞等：19800微生物学报，20(1); 76-810． [4］ 沈光平等：1984。遗传学报，11(2): 109-1130 〔5] 柳惠图等：1979。生物化学与生物物理学报，11(2): 139-1430’ 〔6] 甄永苏等：19790药学学报，14(2): 83--89, C7〕 田中信男等：1972a抗菌素作用的分子生物学，东京大 学出版社，28-320 ［8］ Barranco, S. C. et al.: 1975. Cancer Res., 35- 1194-1204. ［9］ Evans, H. J. et al.: 1969. Proc. R. Soc. (London), Ser., B173, 491-512. [10] Haidle, C. W. et al.: 1972. Mot. Pharmacology, 8: 531--537. [11] Hittleman, W. M.: 1974. Cancer Res., 34: 3433- 3439. [12] Ishii, Y. et al.: 1980. Mut. Res., 79: 19-32. [131 Kihlman, B. A.: 1982. In: Environmental Mu- tagens and Carcinogens (ed.场 T. Sugimura et al., University of Tokyo Press, 483-493. [14] Kih:man, B. A. et al.: 1977.从ut. Res., 46: 130- 131. [15] Kopnin, B. P. et al.: 1985. Chromosoma阴erl.), 92: 25-36. [16] Korcnberg, J. R. et al.: 1974.Chromosoma (Bert.), 48: 355-360. [171 Kuo, M. T. et al.: 1978. ibid, 68: 229-240. [18] Levan, A. et al.: 1980. Hereditas, 92: 259-265. [19] Lin C. C. et al.: 1985. Chromosoma (Bert.), 92: 11-15. [20] Lindenhahn, M. et al.: 1983. Mut. Res.?108: 301-刁16. [21] Majone, F. et al.: 1979. ibid,, 67: 231-238. [22] Marinello, M. J. et al.: 1982. Hereditas, 96: 39‘一 48 [23] Muller, \X1. E. G.: 1972. Eur. J. Biochem., 31- 518-525. [24] Ohama, K. et al.: 1970. J即．J. H“二 Genet, 14: 293-297. [25] Schvartzman, J. B. et al.: 1985. Chromosoma f SFr!.), 92: 7-10 [26] Shaffer, D. A.: 1977. Human Genet., 39: 177- 190 表2 平阳霉素三种成份对CHO细胞染色体畸变和SCE的影响 处 理 中期细胞。 畸变细胞 染色体了细胞 姊妹染色单体交换 t 值z) 每个中期细胞 每条染色体(6cg/m1) A, BrdU 0.2 10 0.4 10 1.0 10 99 100 100 3 6 4 19.32士0.58 19.25土0.71 19.28土0.79 4.97+0.25 5.98+ 0.21 6.84十0.24 0.26+0.13 0.31土0.11 0.36士0.12 0.07P>0.01 3.75P<0.01 6.15P<0.01 A5 0.2 10 0.4 10 1.0 10 100 100 4 9 一 19.08士0.95 ｝19.56+0.57 6.17士0.21 7.59+0.23 0.32土0.11 0.39十0.12 4.30P<0.01 8．11P<0.01 A6 0.2 10 0.4 10 1.0 10 99 100 100 8 斗 7 19.40土0.73 19.48士0.63 19.34土0.56 5.67+ 0.19 7.27+0.22 7.86+ 0.25 0.29士0.09 0.37+0.12 0.40十0.13 2.85P<0.01 7.26P<0.01 S.76P<0.01 CK 10 100 2 19.29士0.73 4.75士0.16 0.25士0.08 1)处理后第二次分裂细胞；2) t值运算以每个中期细胞含SCE数为基数。 30 王伙南等：平ro捧素三种成分对- 0细胞染色体畸变和E(:E的影响 处理 后细 抱第 一次分且中创T色Y晚史： 二2色N多正断目以及双浓体奋b．牵色单体映失；‘．自色体发拈使有趁分别困功 处理后纽胞第二次分裂中用的 里 ‘和来色体简变； d．姊妹员 色单化交且： 已．级色体环 篇 ‘ 象色体易位形成兰附你。 图版‘