何首乌多糖和枸杞多糖的协同抗衰老作用机制的实验研究

　　收稿日期 :20052042151 基金项目 :甘肃省中医药科研课题项目 (20032GZK251)1 何首乌多糖和枸杞多糖的协同抗衰老 作用机制的实验研究 许爱霞 ,王彩琴 ,杨社华 ,葛　斌 ,张振明 (甘肃省人民医院药剂科 ,甘肃 兰州 　730000) 摘要 :目的 　研究何首乌多糖和枸杞多糖的协同抗衰老作用及其机制。方法 　用两因素两水平正交法设计实验 , 用 D2半乳糖制备衰老小鼠模型 ,试药组衰老小鼠分别灌胃 50 ∶50 ,50 ∶200 ,200 ∶50 ,200 ∶200 mg ·(kg ·d) - 1何 首乌多糖 ∶枸杞多糖 ,观察其对衰老模型小鼠免疫器官及抗氧化系统的影响。结果 　试药组衰老小鼠分别灌胃不 同浓度比的何首乌多糖和枸杞多糖能使衰老模型小鼠胸腺指数和脾脏指数不同程度升高 ;肝、肾组织中 MDA 不同 程度下降 ,SOD 及 GSH2PX活力不同程度提高 ;脑组织中 L F 不同程度下降。统计学明 ,何首乌多糖和枸杞 多糖对各实验指标有显著或极显著的协同作用。结论 　何首乌多糖和枸杞多糖联用有显著的协同抗衰老作用 ,两 药最佳组合为 200 mg ∶50 mg。其机制可能与提高免疫功能 ,清除氧自由基 ,活性氧及抗脂质过氧化有关。 关键词 :何首乌多糖 ;枸杞多糖 ;抗衰老 ;抗氧化 The synergistic effect on antisenil ity and its mechanism of PFR and PBWF X U A i2x i a , W A N G Cai2qi n , YA N G S he2hua , GE B i n , Z H A N G Zhen2mi ng (Department of Pharmaceutics , The People’s Hospital of Gansu Province ,Lanzhou ,730000 ,China) 【Abstract】　Objective 　To st udy t he synergistic effect and it s mechanism of a polysaccharide f rom fleeceflower root ( PFR) and a polysaccharide f rom barbary wolf berry f ruit ( PBWF) on anti2 senility1 Methods 　50 PFR :50 PBWF and 50 ∶200 and 200 ∶50 and 200 ∶200 mg ·(kg ·d) - 1 t hat were designed using orthogonal met hod were administered by gavage respectively and t heir effect s were observed on immune organ and antioxidation system of mouse wit h senile model caused by D2galatose (D2gal) 1 Results 　Thymus index and spleen index differently rose , MDA differently dropped ,activities of SOD and GSH2PX differently ascended in liver and kidney ,L F differently descended in brain of senile model mouse which administered 50 PFR ∶50 PBWF ,50 ∶200 ,200 ∶ 50 and 200 ∶200 mg ·(kg ·d) - 1 respectively once a day for 7 weeks1 The statistical analysis indi2 cated t hat t he using of combination PFR wit h PBWF could yield t he notable or ext remely notable recip rocal effect on experimental index to antisenility1 Conclusion 　The using of combination PFR wit h PBWF exert s t he notable synergistic effect on antisenility , t he optimal combination of bot h drugs is 200 mg PFR ∶50 mg PBWF ,it s mechanism probably connect with rising immunity ,elimi2 nating oxyen f ree radicals and active oxyen and antilipoperoxidation1 Key words : 　PFR ; PBWF ; antisenility ; mechanism ;antilipoperoxidation 　　何首乌 (fleeceflower root)为蓼科植物 ,具有滋 肝补肾 ,益精乌发功效。枸杞 ( barbary wolf berry f ruit) 为茄科植物 ,具有养肝补肾 ,益精明目功效。 何首乌多糖 ( a polysaccharide f rom fleeceflower root ,PFR)为何首乌有效成分 ,枸杞多糖 (a poly2 saccharide f rom barbary wolf berry f ruit ,PBWF)系 枸杞有效成分。本文依两因素两水平正交法设计 实验 ,用 D2半乳糖 (D2gal)制备衰老小鼠模型 ,观察 　第 31 卷第 2 期 　　　　　　　　　　　　兰 州 大 学 学 报 ( 医 学 版 ) 　　　　　　　　　　　Vol131 No12 　 　2005 年 6 月 　　　　　　　　　　　Journal of Lanzhou University (Medical Sciences) 　　　　　　　　 　J une 2005 　 何首乌多糖和枸杞多糖联用对衰老模型小鼠胸腺 指数及脾脏指数的影响 ;对肝、肾组织中丙二醛 (MDA)及超氧化物歧化酶 ( SOD) 和谷胱甘肽过氧 化物酶 ( GSH2PX)活力的影响 ;对脑组织中脂褐质 (L F)的影响 ;旨在探讨何首乌多糖和枸杞多糖的协 同抗衰老作用及其机制。 1 　材料与方法 111 　试剂及动物 丙二醛测试盒 ,超氧化物歧化酶测试盒及谷胱 甘肽过氧化物酶测试盒为南京建成生物工程研究 所产品 ,其它试剂均为进口或国产分析纯级产品 1 实验用昆明种清洁级小鼠 , ♀,7～8 周龄 ,体重 (21 ±2) g ,由兰州生物制品研究所提供。何首乌多糖 和枸杞多糖由本院药理基地药物实验室制备。 112 　何首乌多糖和枸杞多糖的制备[1 ] 河南产秋季采挖的何首乌干燥块根 ,宁夏产秋 季采摘的枸杞成熟果实 ,用蒸馏水浸泡 ,加热提取 , 静置离心 ,浓缩至原体积 30 % ,浓缩液加入 4 倍体 积的 95 %乙醇沉淀 ,沉淀物依次用无水乙醇 ,丙酮 及乙醚洗涤 ,用蒸馏水复溶 ,透析 , Sevage 法除蛋 白 ,D EA E2纤维素柱层析 ,收集洗脱液 ,常规干燥即 得。 113 　动物分组及给药[ 2 ] 实验用昆明种清洁级小鼠 70 只 ,随机分为 7 组 ,即对照组 ,模型组 ,阳性对照组及试药组。采用 灌胃法灌胃给药 ,试药 1 组、2 组、3 组及 4 组小鼠 分别灌胃何首乌多糖 :枸杞多糖 50 ∶50、50 ∶200、 200 ∶50 及 200 ∶200 mg ·( kg ·d) - 1 。阳性对照 组灌胃维生素 E 200 mg ·(kg ·d) - 1 ,模型组与对 照组灌胃相当量的对照液 (只含防腐剂) 。给药同 时 ,模型组 ,阳性对照组和试药组小鼠每天颈背部 sc D2半乳糖 (D2gal) 1 mg ·g - 1 ,对照组 sc 等量注 射用水 ,造模及给药 7 周后进行各项指标测定。 114 　小鼠肝、肾组织中过氧化脂质降解产物 MDA 的测定 用 TBA 比色法[3 ] ,肝、肾组织用 Tris 缓冲液 (p H 714 , 10 mmol ·L - 1 Tris2HCl , 011 mmol · L - 1 ED TA22Na ,10 mmol ·L - 1 蔗糖 ,018 %NaCl) 制备 10 %组织匀浆 ,取肝匀浆、肾匀浆 011 mL ,按 测试盒操作法加入试剂 ,反应终体积为 412 mL1 反 应管振荡混匀 ,水浴中煮沸 40 min ,3 500 r ·min - 1 离心 10 min ,上清液于 532 nm 处测吸光度 ( A)值。 115 　小鼠肝、肾组织中 SOD 活力的测定 用亚硝酸盐法[4 ] ,肝、肾组织用 Tris 缓冲液制 备 1 %组织匀浆 ,取肝或肾匀浆 50μL ,按测试盒操 作法加入试剂 ,反应体积为 118 mL 。反应管振荡 混匀 ,37 ℃恒温水浴中温育 40 min ,加入显色剂 10 min 后 ,于 550 nm 处测 A 值。 116 　小鼠肝、肾组织中 GSH2PX活力的测定 用 D TNB 法[5 ] ,取 1 %肝或肾匀浆及 1 mmol ·L - 1 GSH 各 012 mL (对照管不含 GSH) ,37 ℃水 浴中预温 5 min ,按测试盒操作法加入试剂 ,37 ℃水 浴中反应 5 min ,3 500 r ·min - 1离心 10 min ,取上 清液加入显色剂 ,室温静置 15 min ,于 412 nm 处测 A 值。 117 　小鼠脑组织中 L F 的测定 用 Sohal 法[ 6 ] ,取小鼠大脑 100 mg ,加入 2 ∶1 氯仿 - 甲醇提取液 2 mL ,充分匀浆 ,滤纸过滤 ,滤 渣用提取液洗涤 ,加提取液至 5 mL ,测定荧光强度 (发射波长 435 nm ,激发波长 365 nm) 。 118 　统计分析 组间数据显著性差异用 t 检验分析 ,协同药效 显著性差异用多因素多水平资料 F检验分析。 2 　结果 211 　PFR和 PBWF对 D2gal 致衰老模型小鼠胸腺 指数和脾脏指数的影响 小鼠连续皮下注射 D2gal 7 周后 ,模型组小鼠 胸腺指数和脾脏指数与对照组比较明显下降 ,试药 组衰老小鼠分别灌胃何首乌多糖、枸杞多糖 50 ∶ 50、50 ∶200、200 ∶50 及 200 ∶200 mg ·( kg · d) - 1 ,能使衰老模型小鼠胸腺指数和脾脏指数不同 程度升高 ,而同时灌胃维生素 E 200 mg ·( kg · d) - 1对衰老模型小鼠胸腺指数和脾脏指数无影响 (表 1) 。 表 1 　PFR和 PBWF对 D2gal 致衰老模型小鼠 胸腺指数和脾脏指数及脑 LF的影响 组　别 剂　量 / mg ·(kg ·d) - 1 胸腺指数 / mg ·g - 1 脾脏指数 / mg ·g - 1 L F 对　照 2112 ±01 35 4112 ±01 25 171 4 ±11 1 模　型 11 87 ±0124a 31 93 ±0112a 2212 ±213b 维生素 E 200 1193 ±01 12 3199 ±01 19 1918 ±119c PFR : PBWF 50 :50 21 32 ±0133d 41 36 ±0135d 1614 ±215d 50 :200 21 67 ±0119d 41 76 ±0131d 1413 ±214d 200 :50 21 76 ±0124d 41 86 ±0128d 1314 ±117d 200 :200 21 65 ±0136d 41 84 ±0137d 1412 ±117d 　a P < 01 05 ,b P < 0101 ,与对照组比较 ;c P < 0105 ,d P < 01 01 ,与模 型组比较。 41 　　　　　兰 州 大 学 学 报 ( 医 学 版 ) 　　　　　　　　　　　　　　第 31 卷 　 212 　PFR和 PBWF对 D2gal 致衰老模型小鼠脑组 织中 LF及肝、肾组织中 MDA的影响 D2gal 致衰老模型小鼠与对照组比较脑组织中 L F 及肝、肾组织中 MDA 明显升高 ,衰老小鼠分别 灌胃何首乌多糖 :枸杞多糖 50 ∶50、50 :200、200 ∶ 50 及 200 ∶200 mg ·(kg ·d) - 1 ,可不同程度地对 抗脑组织中L F 升高 (表 1)及肝、肾组织中 MDA 升 高 (表 2) 。 213 　PFR和 PBWF 对 D2gal 致衰老模型小鼠肝、 肾组织中 SOD 及 GSH2PX活力的影响 D2gal 致衰老模型小鼠与对照组比较肝、肾组 织中 SOD 及 GSH2PX 活力均明显下降 ,试药组小 鼠分别灌胃何首乌多糖 :枸杞多糖 50 ∶50、50 ∶ 200、200 ∶50 及 200 ∶200 mg ·(kg ·d) - 1 ,可不同 程度地对抗肝、肾组织中 SOD 及 GSH2PX 活力下 降 (表 2) 。 表 2 　PFR和 PBWF对 D2gal 致衰老模型小鼠肝、肾组织、蛋白中 MDA,SOD 及 GSH2PX活力的影响 组 　别 肝 MDA /μmol ·g - 1 SOD / U ·g - 1 GSH / mmol ·g - 1 肾 MDA /μmol ·g - 1 SOD / U ·g - 1 GSH / mmol ·g - 1 对 　照 6138 ±0168 5317 ±119 6615 ±519 8170 ±1108 6118 ±310 9112 ±415 模 　型 1017 ±019b 6212 ±715b 5817 ±419b 1418 ±111b 4014 ±411b 8411 ±718b 维生素 E 919 ±112c 7012 ±714c 6515 ±814c 1316 ±112c 4412 ±414c 9216 ±1218c PFR : PBWF 4199 ±0179d 5512 ±417d 6714 ±512d 7197 ±1133d 5610 ±218d 9415 ±719d 4127 ±0176d 5811 ±310d 7312 ±317d 6140 ±1142d 6015 ±318d 10113 ±712d 3170 ±0157d 5916 ±310d 7410 ±410d 6107 ±0196d 6310 ±318d 10519 ±712d 4119 ±0186d 5812 ±211d 7311 ±312d 6143 ±1129d 6014 ±417d 10114 ±614d 　a P < 0105 ,b P < 0101 ,与对照组比较 ;c P < 0105 ,d P < 0101 ,与模型组比较。 214 　PFR 和 PBWF 对各实验指标单独及协同药 效的统计学分析 PFR 和 PBWF 对 D2gal 致衰老模型小鼠胸腺 指数和脾脏指数的药效 :统计分析结果表明 , PFR 大剂量效果较小剂量好 ,抑制胸腺指数及脾脏指数 下降作用显著。PBWF 量效关系不明显 ,但两药间 有显著协同作用 ,最佳组合为 200 mg PFR ∶50 mg PBWF。对脑组织中 L F 及肝、肾组织中 MDA 的 药效 :统计分析表明 ,PFR 大剂量效果较小剂量好 , 对抗脑 L F 升高及肾 MDA 升高作用显著 ,对抗肝 MDA 升高作用极显著。PBWF 量效关系不明显 , 但两药有显著协同作用 ,最佳组合为 200 mg PFR ∶50 mg PBWF。对肝、肾组织中 SOD 的药效 :统 计分析表明 ,PFR 大剂量效果较小剂量好 ,抑制肝 SOD 活力下降作用显著 ,抑制肾 SOD 活力下降作 用极显著。PBWF 量效关系不明显 ,但两药对抑制 肝 SOD 活力下降有显著协同作用 ,对抑制肾 SOD 下降有极显著协同作用 ,最佳组合为 200 mg PFR ∶50 mg PBWF。对肝、肾组织中 GSH2PX 的药 效 :统计分析表明 ,PFR 大剂量效果较小剂量好 ,对 抑制肝 GSH2PX 及肾 GSH2PX 活力下降作用显 著。PBWF 量效关系不明显 , 但两药对抑制肝 GSH2PX 及肾 GSH2PX 活力下降有显著协同作 用 ,最佳组合为 200 mg PFR ∶50 mgPBWF) 。215 　PFR 和 PBWF 对各实验指标的交互作用分析PFR 和 PBWF 对各实验指标的交互作用表明PFR 量效变化和 PBWF 量效变化间的相互影响程度 ,用两药大小剂量的药效之差反映 (表 3) 。3 　讨论祖国传统中药有防治百病的悠久历史 ,从滋肝补肾中药提取有效成分及探索其延缓衰老作用是现代发展抗衰老新药的重要途径 ,联合用药是提高疗效的方法之一。中药何首乌和枸杞传统功效相近 ,近年国内研究表明 ,枸杞多糖有显著免疫增强作用及抑瘤作用[7 ] ,何首乌总苷有较强的抗肿瘤作用[8 ] 。本文探讨了何首乌多糖和枸杞多糖联用的抗衰老作用及其机制。本实验结果表明 ,D2半乳糖致衰老模型组小鼠与正常对照组比较胸腺指数和脾脏指数明显下降 ,脑组织中 L F 明显升高 ,肝、肾组织中 MDA 明显升高及 SOD 活力和 GSH2PX 活力明显下降。而受试药组衰老小鼠分别灌胃 50 ∶50 mg、50 ∶200 mg、200 ∶50 mg 及 200 ∶200 mg·(kg ·d) - 1何首乌多糖 :枸杞多糖 ,能不同程度抑 制胸腺指数和脾脏指数下降 ;能不同程度对抗肝、 51　第 2 期 　　　　　　　　许爱霞等 :何首乌多糖和枸杞多糖的协同抗衰老作用机制的实验研究 肾组织中 MDA 升高及脑组织中 L F 升高 ;能不同 程度抑制肝、肾组织中 SOD 活力及 GSH2PX 活力 下降 ;这提示不同正交配比剂量的何首乌多糖和枸 杞多糖能不同程度对抗免疫器官退化及提高免疫 功能 ;能不同程度地清除 O H 和抗脂质过氧化 ;能 不同程度地清除 O2 2 , H2 O2 及活性氧。参比实验 表明 ,维生素 E 清除自由基及抗脂质过氧化作用较 何首乌多糖和枸杞多糖弱 ,且对免疫系统无影响。 实验结果的统计分析表明 : 200 ∶50 mg 何首 乌多糖∶枸杞多糖对 D2半乳糖致衰老模型小鼠脾 脏指数及胸腺指数有显著升高作用 ,两药间有显著 协同作用。对脑 L F 及肾 MDA 有显著降低作用 , 对肝 MDA 有极显著降低作用 ,两药间有显著协同 作用。对肝 SOD 活力有显著升高作用 ,对肾 SOD 活力有极显著升高作用 ,两药对肝 SOD 活力有显 著协同作用 ,对肾 SOD 活力有极显著协同作用。 对肝 GSH2PX 活力及肾 GSH2PX 活力有显著升高 作用 ,两药对肝 GSH2PX 及肾 GSH2PX 有显著协 同作用。可见 ,何首乌多糖和枸杞多糖有显著的协 同抗衰老作用 ,抗衰机制可能与提高免疫功能 ,清 除自由基及抗脂质过氧化有关。 表 3 　PFR和 PBWF对各实验指标的交互作用分析 交互作用 A 小剂量 A 大剂量 交互作用 A 小剂量 A 大剂量 交互作用 A 小剂量 A 大剂量 胸腺指数 B 小剂量 B 大剂量 药效差 23117 47519 3511 27516 48117 11 肝 MDA A 小剂量 B 大剂量 药效差 4919 4217 712 3710 4119 419 肾 MDA B 小剂量 B 大剂量 药效差 7917 6410 1517 6017 6413 316 脾脏指数B 小剂量 B 大剂量 药效差43612 47519 391748516 48117 319肝 SODB 小剂量 B 大剂量 药效差55215 58114 291259612 58117 1415肾 SODB 小剂明 B 大剂量 药效差55916 60419 451363010 63019 019 脑脂褐质B 小剂量 B 大剂量 药效差16414 14314 2113414 14210 716肝 GSH2PXB 小剂量 B 大剂量 药效差67413 73210 571773210 73114 016肾 GSH2PXB 小剂量 B 大剂量 药效差94515 101310 6715105912 101413 4419 　A 表示何首乌多糖 ,B 表示枸杞多糖。 参 　考 　文　献 [1 ] 　陈群 ,杨桂文 ,安利国. 银杏白果多糖的提取、纯化和 分析[J ] .中国药学杂志 ,2002 ,3 (5) :33123331 [2 ] 　孙瑞元 ,黄正良. 中药方剂的正交设计极其统计方法 [ A ] . 陈奇. 中药药理研究方法学 [ C ] . 北京 :人民卫生 出版社 ,2000. 50253. 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