ICs 11.020
C50
中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准
Ws/T341- 2ˉ011
血红蛋白测定参考方法
Reference Ⅱnethod for haemoglobinometry in human blood
2011-09-3o发布
一
中华人民共和国卫生部 发 布
2012-04-015安 方毡
Ws/T341- 2ˉ011
目刂 舀
本
按照 GB/T1.1-⒛ 09给出的规则起草。
本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出。
本标准主要起草单位 :卫生部临床检验中心。
本标准主要起草人 :彭 明婷、谷小林、李臣宾、施丽飞、陆红、申子瑜。
????? www.bzfxw.com ????
www.bzfxw.com
Ws/T341- 2ˉ011
血红蛋白测定参考方法
1 范围
本标准规定了血红蛋白测定参考方法的技术要求。
本标准适用于建立并运行血红蛋白测定参考方法的实验室。
2 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2.1
血红蛋白 hemog1oun,HGB/Hb
存在于血液中所有的血红蛋白衍生物 ,包括脱氧血红蛋白、氧合血红蛋白、硫化血红蛋白、碳氧血红
蛋白和高铁血红蛋白。
2.2
仅化商铁血红蛋白 haemigⅡobincyanide,HiCN
血红蛋白(除硫化血红蛋白外 )中 的亚铁离子被氧化成高铁离子 ,再与氰离子结合形成的血红蛋 白
衍生物 ,即 氰化高铁血红蛋白。
2.3
参考方法 reference method
一种可清楚和准确描述的用于特定检测的技术 ,该技术要有依据 ,可提供足够准确和精密的实验数
据以评价其他实验方法检测结果的有效性。若有决定性方法 ,参考方法的准确性必须与决定性方法进
行比较 ,并且应标示不准确度和不精密度。
3 总则
为了保证参考方法检测结果的准确性 ,建立参考方法的实验室应与其他参考实验室进行结果 比对。
4 原理
血红蛋白分子中的亚铁离子 (Fe2+)在溶液中被高铁氰化钾氧化成高铁离子 (Fe3+)形成高铁血红
蛋白(Hi),其后又与氰离子(CNˉ )反应生成氰化高铁血红蛋白(HCN),HCN在 波长 540nm处有最
大吸收峰 ,HCN吸光度严格遵循朗伯-比尔定律 ,即 HCN在 波长 540nm的吸光度值与 HCN浓 度成
正比,血红蛋白浓度可由分光光度计所测定的吸光度值计算得出。
5 -般技术要求
5.1 设备
5.1.1 玻璃器具
试验所用的玻璃器具应为 A级 。
www.bzfxw.com
Ws/T341ˉˉ 2011
规格要求 :正 向置换式微量加样器或吸量管 100uL±0.5uL、0.5mL±0.005mL,容量瓶 25mL±
o,03mL、100mL±0.08mL、250mL±0.12mL、1000mL±0.3mL。
5.1.2 薄膜过滤器 :由 低蛋白结合和低释放材料制成 ,过滤器半径为 25mm,薄膜孔径为 0,⒛ um~
o,25um。
5.1.3 分光光度计 :所用的分光光度计应经计量部门检定合格 ,仪 器的狭缝宽度≤2nm,配对 比色杯
的内径为 1.000cm±0。 002cm。
5.2 试剂 (文 -齐 氏液 ,van KampeⅡ and z刂Istra reagent)
5.2.1 文-齐 氏液的组成
KCN O。 o5og
K3Fe(CN)6 0.20og
KH2P04(无水) 0.140g
非离子
面活性剂 0.5mL~1.0mL
临床实验室试剂用水 ,I级 1000。 O mL
临床实验室 I级试剂用水应满足以下指标 :细菌数(10αV/mL;25℃条件下电阻抗)10mΩ·cm;
硅含量 (Sio2)(0.05mg/L。
所用化学试剂应为不含结晶水的分析纯。
非离子表面活性剂可使用 Nonidet R40或THton Ⅺ 1oo。
试剂中的氰化钾为剧毒物质 ,应规定相应的生物安全防护和处理要求。
5.2.2 试剂 为清亮 的淡 黄色溶液 ,不 吸收波长 大 于 480nm的光。pH为7.0~7.4,渗透压 为
6mOsm/(kg·H20)~7mOsm/(kg·H2O)。 试剂应可使血红蛋 白在 5min内完全转化成氰化高铁
血红蛋白。
5.2.3 试剂应保存于较大且密封的棕色硼硅酸盐玻璃瓶内 ,室 温避光保存 ,不 能冷冻。如有浑浊物生
成 ,应重新配制。至少每月重新配制一次。
5.3 血标本的采集
5.3.1 用真空采血系统采集新鲜静脉血。采血时要避免皮肤消毒物质的污染。标本中不得有 肉眼可
见的小凝块或溶血。
5.3.2 采集标本时使用 EDTA为抗凝剂 ,要求加人血液后抗凝剂的终浓度为 3.7umol/mL~5.4umol/
mL,可以使用以下几种抗凝剂 :
——EDTA· K2(相对分子质量 368.4),浓 度为 1.4m酽mL~2。Om酽mL;
——EDTA· K2· 2H20(相对分子质量 404.5),浓 度为 1.5mg/mL~2.2mg/mL;
——EDTA· K3· 2H20(相对分子质量 442.5),浓 度为 1.6m酽mL~2.4mg/mL;
——EDTA· N助 ·2H20(相对分子质量 372.23),浓 度为 1.4mg/mL~2.0m酽mL。
5.3.3 血液加人抗凝管后 ,管 内剩余空间至少占试管体积的 ⒛ %,以利于血标本的混匀。
5.3.4 标本采集后应在当天完成测定。
6 测定步骤
6.1 标本稀释
6.1.1 取文-齐氏液加至容量为 25mL的A级容量瓶中 ,将试剂液面调至刻度线。
6.1.2 用正向置换移液器吸取 100uL混匀全血 ,使用蘸有盐水的纱布小心快速地擦掉毛细管外壁残
2
????? www.bzfxw.com ????
www.bzfxw.com
Ws/T341- 2ˉ011
留的血液 (该过程应避免因虹吸作用带走毛细管内的血液),将毛细管中的血液加至装有试剂的容量瓶
中 ,吹 吸至少 5次 ,以保证血液全部从毛细管中洗出。同一份标本分次稀释后 ,检测结果的变异系数应
<0.5%。
6.1.3 盖上容量瓶盖子 ,充分颠倒混匀 ,直至红细胞完全溶解。
6.1.4 避光放置 5min以上 ,以保证血红蛋白完全转化成氰化高铁血红蛋白。
6.1.5 用滤器过滤稀释后的标本 。
6.1.5.1 使用注射器和特定的滤器 (5.1.2)过滤。
6.1.5.2 滤液至少放置 1min,以使气泡溢出。
6.2 血红蛋白浓度检测
6.2.1 使用分光光度计测定 HCN溶 液的吸光度值。
6.2.2 以试剂作空白 ,分别在 504nm、540nm和750nm波长条件下 ,读取 HCN溶 液的吸光度值。
6.2.3 HCN溶 液纯度与浊度的要求
纯度检查 1.59≤ 镳 ≤ 1.63
浊度检查 A鸵N≤ 0.003
6.3 血红蛋白浓度计箅
6.3.1 血红蛋白浓度计算公式见式 (1):
c=
式中 :
c ——血红蛋白浓度 ,单位为克每升 (g/L);
A髁N ——HCN溶 液在 540nm时的吸光度 ;
16114.5——血红蛋白单体的相对分子质量(4个单体组成的血红蛋白的相对分子质量为 64娟 8);
F ——血液的稀释倍数 ;
11.0 ——HCN溶 液在 540nm时的 1/4毫摩尔消光系数 ;
d ——光径 ,为 1.000cm;
1000 ——将毫克转换为克的倍数。
6.3.2 当稀释倍数为 1g251,光径为 1。 000cm时,式 (1)可表达为
c=A髁N× 367.7 ⋯¨⋯⋯⋯⋯⋯⋯¨⋯(2)
7 血红蛋白结果的表达方式
血红蛋白浓度以 g/L形式表示 。
www.bzfxw.com
Ⅵ` s/T341ˉ2ˉ011
佥 考 文 献
[1彐 ICsH:Recommendatons for haem°glohn°metry in human blood。Br J Haematol。1967;13:
71-5
E2彐 ICsH:Re∞mmendations for reference method for haemoglo⒍nometry in human blood
(ICsH standard EP6/2:1977)and specifications for international haeⅡ⒒iglobincyanide reference prepa-
ration(ICsH standard EP6/3:1977)。J CⅡn Pathol。1978Feb;31(2):139-43
E3彐 ICsH:Expert Panel on Haemoglobinometry。Recommendations for reference method for
haemoglobinometry in human b1ood(ICsH standard1986) and specifications for international haemi-
globincyanide reference preparatio⒒(3rd edition)。Clin Lab Haematol。1987;9(1):73-9
E4彐 ICsH:Recommendatons for reference method for haemoglohnometry in human blood
(ICsH standard 1995) and specifications for international haemiglobinocyanide standard (4th
edition)。J Chn Pathol。1996Apr;49(4):271-4
E5彐 NCCLs:H15-A3Reference and sdected Procedures for the Quandtative Determination of
Hemoglobin in Blood。Approved standard。3rd ed。Wayne,Pa。:NCCLs;2000
????? www.bzfxw.com ????