线粒体的功能及检测方法

有高特异性和很强的亲和性。至于细胞靶向肽能否 达到希望的运输目的还有待于进一步的研究。 随着蛋白载体 CPPs 和细胞靶向肽的出现, 药物 结构的范围扩大了。虽然 CPPs 穿膜机制尚未完全 确定, 但不可否认 CPPs 在基因治疗、分子生物学及 临床治疗方面都具有良好的应用前景。在 CPPs 全 景被揭示之前, 其治疗潜力让人充满期待。 参考文献 [ 1 ] Green M, Loewenstein PM. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunode ciency virus tat trans-ac- tivator protein[ J] . Cell, 1988 , 55( 6) : 1179-1188. [ 2 ] Vives E. Present and future of cell-penetrating peptide mediated delivery systems: " is the Trojan horse too wild to go only to Troy? " [ J] . J Control Release, 2005, 109( 1 ) : 77-85. [ 3 ] Derossi D, Joliot AH, Chassaing G, et al. The third helix of the An- tennapedia homeodomain translocates through biological mem- branes[ J] . J Biol Chem, 1994 , 269( 14) : 10444-10450 . [ 4 ] Théodore L, Derossi D, Chassaing G, et al. Intraneuronal delivery of protein kinase C pseudosubstrate leads to growth cone collapse [ J] . J Neurosci, 1995, 15( 11) : 7158 -7167 . [ 5 ] Fawell S, Seery J, Daikh Y, et al. 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Biochim Biophys Acta, 2008, 1786 ( 2) : 126-138. 收稿日期 : 2010 -08 -12 修回日期 : 2010-12-06 线粒体的功能及检测方法 王 新1△ ( 综述 ) , 陈凤玲2※ ( 审校 ) ( 1. 蚌埠医学院 , 安徽 蚌埠 233030 ; 2 . 上海交通大学医学院附属第三人民医院内分泌科 , 上海 201900) 中图分类号 : R34 文献标识码 : A 文章编号 : 1006-2084( 2011) 01-0012-04 基金项目 : 国家自然科学基金 ( 30870954) 摘要 : 对线粒体进行检测有助于线粒体疾病的诊断。目前对线粒体功能检测的方法有呼吸控制 率、线粒体 ATP 生成率、离子通道开放状态、线粒体膜电位变化、前臂有氧运动实验等。通过电镜可 直接观察线粒体的形态变化。每种方法均有各自的原理和优缺点 , 临床需根据实际选择合适的方 法 , 且尚需探索更为理想、简单、经济的检测手段。 关键词 : 线粒体 ; 呼吸链 ; 功能 ; 检测 Mitochondrial Function and Detection Methods WANG Xin1 , CHEN Feng-ling2 . ( 1 . Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China; 2. Department of Endocrinology, NO. 3 People′s Hospital Affiliated to Shang- hai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 201900, China) Abstract: Detection of mitochondria contributes to the diagnosis of mitochondrial disease. Current detec- tion methods consist of mitochondrial respiratory control ratio, ATP production rate, ion channel openness, variation in mitochondrial membrane potential, and forearm aerobic exercise test. Mitochondrial morphology can be directly observed by using an electron microscopy. Each method has its own underlying rationality, merits, and drawbacks. An ideal, simple and economical method should be in place for clinical practice. Key words: Mitochondria; Respiratory chain; Function; Detection 线粒体位于细胞核外, 既能产生能量又携带遗传信 息, 其结构的特殊性决定其 损伤 及 修 复 的 方 式 与 核 DNA 有所不同。检测线粒 体呼吸链功能对于诊断线粒 体疾病是必要的。近年来, 发现了许多检测线粒体呼吸 链功能的方法, 但是各具其 局限性。现主要就线粒体的 功能及检测进行概述, 临床 可根据目的选择 从功能上或形 态学上来 检测线 粒体。 ·21· 医学综述 2011 年 1 月第 17 卷第 1 期 Medical Recapitulate, Jan 2011 , Vol. 17 , No. 1 1 线粒体的结构与功能特点 线粒体具有自我复制、转录和编码功能。被称 为“能量工厂”的线粒体, 人体至少有 90% 的能量由 其产生 [ 1] 。在人体各个细胞都存有线粒体, 单个细 胞包含 200 ～2000 个线粒体, 但是不同组织的细胞内 线粒体的数量是不同的, 而在相同组织的细胞内线 粒体数量是接近的 [ 2] 。 2 线粒体基因的特点 在人类, 线粒体 DNA( mtDNA) 是长 16 569 bp 的 闭合双链环状分子, 每个 mtDNA 分子编码 13 个氧化 磷酸化蛋白亚单位, 2 个与这些基因翻译有关的 rRNA( 12S rRNA 和 16S rRNA) 和 22 个转录 RNA, 其 中这 13 个亚单位与核 DNA 编码的其他亚单位共同 组成呼吸链。此外, 还含有一段与 mtDNA 复制、转录 有关的非编码区( D 环区 ) 。由于缺少组蛋白的保护 与有效的校读系统, mtDNA 极易受到氧化磷酸化过 程中产生的活性氧簇 ( reactive oxygen species, ROS) 的损害而突变, 其突变率较 DNA 高 10 ～100 倍 [ 3] 。 由于线粒体 DNA 的修复机制不完善, 效率低下, 线 粒体 DNA 的突变可导致线粒体功能缺陷, 线粒体 DNA 只有过度复制产生数量惊人的拷贝才能补偿此 缺陷 [ 4] 。因此在一些线粒体相关疾病中, 线粒体功 能受损可导致能量生成减少而引起一系列临床症 状。线粒体及线粒体 DNA 由卵母细胞传给子女 [ 5] , 呈母系遗传, 不符合孟德尔遗传规律。在 mtDNA 缺 陷疾病患者的细胞中可同时存在突变型和野生型 2 种 mtDNA, 称作杂胞质性。 3 线粒体基因的损伤与修复 3. 1 线粒体基因损伤发生的主要原因及机制 造 成核 DNA 损伤的因素均可引起线粒体 DNA 损伤, 如 紫外线、电离辐射、烷化剂、碱基类似物、修饰剂引起 碱基对的突变等, 此外线粒体 DNA 也会产生自发性 损伤, 如复制时产生碱基错配、碱基自发改变导致 DNA 损伤。线粒体 DNA 损伤可分为 DNA 单链断 裂、双链断裂、碱基修饰、DNA 链间交联等。线粒体 DNA 直接暴露于氧化磷酸化过程所产生的 ROS 和 自由基中, 无组蛋白保护, 几乎完全由编码区组成, 缺乏有效的修复系统等, 因此突变频率较高 [ 3] 。线 粒体 DNA 突变[ 如 tRNALeu( UUR) 3243A→G] 可影 响线粒体复合酶Ⅰ的活性 [ 6] 。线粒体呼吸链功能障 碍使 ROS过量产生而又不能被及时清除, 导致线粒 体内脂质和 mtDNA 的氧化加强 [ 7] 。线粒体是 ROS 的主要来源, 也是氧化攻击的主要目标, 长期暴露在 高游离脂肪酸环境中, 可使 ROS 生成增多, 从而激活 氧化应激, 产生过多的氧自由基, 使细胞及线粒体膜脂 质过氧化, 导致线粒体功能障碍, ATP 生成减少, 钙泵 失活使细胞内钙增多, 激活磷脂酶活性, 使膜磷脂分 解 [ 8] 。有研究表明, 线粒体突变与年龄及呼吸链功能 下降密切相关 [ 9] 。 3.2 线粒体损伤修复 3.2. 1 碱基切除修复 碱基切除修复是通过一种 DNA 糖基酶, 这种酶可以识别损伤的碱基, 裂解其糖 苷键。该修复系由一些列包括尿?? DNA 糖基化 酶、8-氧鸟?呤 DNA 糖基化酶、胸腺??乙二醇糖基 化酶、3-甲基腺?呤 DNA 糖基化酶、AP核酸内切酶、 DNA 聚 合酶、DNA 连 接酶等 参与的 酶促反 应完 成的。 3.2. 2 重组修复 田鼠的 mtDNA 可以通过重组修 复去除顺铂 ( 含重金属化合物 ) 引起的链内交联。 Thyagrajan 等 [ 10] 在体外用人体线粒体蛋白质抽提物 可以在质粒间建立重组, 此实验有力地支持了这一 假设: 哺乳动物线粒体可以利用同质性碱基重组修 复损伤的 DNA。 4 线粒体氧化呼吸链功能、结构的检测 线粒体氧化呼吸链的功能可以从多方面检测的 结果来, 如呼吸控制率( respiratory control ratio, RCR) 的检测、线粒体 ATP生成率( mitochondrial ATP production rate, MAPR) 的改变、线粒体膜离子通道的 开放状态、线粒体膜电位的变化等。线粒体结构变 化的检测形态学变化如电子显微镜下直接观察线粒 体形态。从整体水平可以通过有氧前臂运动试验来 检测线粒体呼吸链功能。 4.1 RCR 检测 测定 RCR 既可以反映线粒体的完 整程度, 又可以反映线粒体氧化呼吸链的功能。线 粒体氧化呼吸链系由一系列的递氢体和递电子体按 一定的顺序排列组成的连续反应体系, 代表着线粒 体的最基本功能, 可以通过 RCR 来测定其线粒体外 膜及功能完整性和氧化磷酸化效率, RCR 为加入 ADP时 ( Stage 3) 的呼吸速率与 ADP 耗竭后 ( Stage 4) 的呼吸速率之比。线粒体的呼吸耗氧耦联着 ADP 与 Pi 合成三磷酸腺苷的磷酸化反应, ADP/ O 值是指 线粒体每消耗 1 mol 氧原子的同时, 生成 ATP 的摩 尔数。RCR 通常与 ADP/ O 比值一起, 成为衡量线粒 体结构完整与否及氧化磷酸化耦联程度的灵敏指 标, 在线粒体氧化呼吸链功能受损的情况下, S3 值、 RCR、ADP/ O 比值下降, S4 值则显著升高。一般使 用氧电极法检测, 该方法要求待测定的线粒体是新 鲜的, 否则所得数据会发生很大误差 [ 11] 。 4.2 MAPR MAPR 的测定也可以作为评价线粒体 呼吸链功能的一项指标。该法是建立在 ATP与重组 荧光素酶及底物荧光素反应的基础之上, 但是敏感 度较低, 而且每次检测需要 0. 5 ～1. 0 g 的骨骼肌作 ·31·医学综述 2011 年 1 月第 17 卷第 1 期 Medical Recapitulate, Jan 2011 , Vol. 17 , No. 1 为标 本, 这样 导致 临 床取 样 时损 伤 较 大。之后 Wibom等 [ 12 ] 采用一种改良的发光技术检测 MAPR, 该法比最初的方法敏感度要高 50%～220% , 而且每 次检测只需 25 mg 的骨骼肌标本。采集的样本迅速 用差速离心法将线粒体分离出后, 用生物发光技术 对最终的部分线粒体悬液进行 MAPR 检测。反应混 合物包括荧光素-荧光素酶 ATP 检测试剂等。检测 MAPR 时通常选取骨骼肌作为样本, 随着技术的不断 改良, 现在已经广泛应用于医学、生理学、毒理学等 领域的研究 [ 13-15] 。 4. 3 离子通道的检测 线粒体渗透转换孔是横跨 在线粒体内外膜之间非选择性高导电性通道, 通常 保持关闭状态, 是线粒体渗透转换功能的基础。线 粒体渗透转换孔对环孢素有较高的敏感性, 对细胞 内外多种离子浓度变化非常敏感, 特别是对在细胞 内信号转导系统有重要作用的钙离子浓度的变化非 常敏感, 可因钙超载或 ROS 生成而被诱发开启。线 粒体渗透转换孔转换孔大量开启能引起膜电位崩解 并导致细胞凋亡。线粒体渗透转换孔的检测方法有 活性物质标记法、膜片钳法、分光光度法等, 其中分 光光度法较为简单易用。 4. 4 膜电位的检测 Chu 等 [ 16] 曾用激光共聚焦检 测大鼠肠黏膜细胞线粒体跨膜电位变化, 该法采用 线粒体跨膜电位检测试剂盒( JC-1) 。JC-1 是一种广 泛用于检测线粒体膜电位 ΔΨm 的理想荧光探针。 可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线 粒体膜电位较高时, JC-1 聚集在线粒体的基质中, 形 成聚合物, 可以产生红色荧光; 在线粒体膜电位较低 时, JC-1 不能聚集在线粒体的基质中, 此时 JC-1 为单 体, 可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通 过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常 用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比 例。Lim 等 [ 17] 用四苯膦等脂溶性阳离子渗透入线粒 体膜基质, 然后通过检测四苯膦的浓度来确定膜电 位, 需要注意的是此法在检测过程中对溶液 pH 值的 稳定性要求较高, 否则将影响实测值。膜片钳技术 是一种以记录通过细胞膜上的各种离子通道的离子 电流来反映细胞膜上单一或多个离子通道活动的技 术, 其反映的电流特征可以用来评价线粒体功能。 全自动膜片钳技术效率高, 是传统膜片钳技术的 20 ～300 倍, 操作技术简单; 缺点是仅适用于悬浮细胞的 检测 [ 18] 。线粒体膜是线粒体与周围环境联系、反应 的桥梁, 膜磷脂含量与流动性的改变与疾病的发生、 发展密切相关。脂质过氧化作用可以导致膜磷脂的 减少, 线粒体膜磷脂的检测对判断线粒体功能具有 重要意义 [ 19] 。 4.5 线粒体形态学检测 20 世纪 60 年代初, Engel 等 [ 20 ] 首先用 MGT 染色发现线粒体肌病患者肌膜和 肌纤维之间呈不规则的红染颗粒改变, 称为粗糙红 纤维, 为线粒体肌病具有特征性的形态学改变。宋 东林等 [ 21 ] 曾用电镜观察线粒体肌病时发现在骨骼肌 肌膜下线粒体异常增多, 并有巨大畸形线粒体出现, 线粒体嵴型异常, 可呈同心漩涡状、迷宫状或矩形结 晶状结构。姚英民等 [ 22 ] 曾用电镜观察轮状病毒感染 时线粒体形态变化时发现线粒体外形肿胀, 电子密 度增高, 基质中在大量具有紊乱的峭和晶状物, 峭模 糊不清, 基质凝集。 4.6 有氧前臂运动试验 线粒体肌病患者因骨骼 肌线粒体氧化磷酸化受损, 致使无氧代谢增加, 引起 血浆乳酸水平增高。Taivassalo 等 [ 23 ] 在 2002 年发 现, 有氧前臂运动试验是一种新的、敏感的检测骨骼 肌氧化代谢能力的方法, 并观察到与健康人群比较, 运动前线粒体肌病患者的血氧饱和度 ( SO2 ) 和血氧 分压( PO2 ) 明显降低。陈健华等 [ 24 ] 对 42 例线粒体 肌病诊断明确患者行此试验。试验前, 所有受试者 需在运动侧肘正中静脉置管, 受试者需在运动前、运 动结束前 30 s、运动后 10 min取血, 分别检测其 PO2、 SO2、pH、血液乳酸等, 发现在运动中, PO2 和 SO2 的 变化与细胞氧化代谢能力损伤的程度呈正相关, PO2 下降越少, SO2 下降幅度不明显反而升高, 说明病情 越重。运动前( 或运动中) pH 较低、运动前血乳酸水 平高于正常亦提示线粒体有异常的可能, 而且研究 表明该方法较肌肉活检更敏感。 4.7 磁共振诊断与波谱 Morava 等 [ 25 ] 曾建立 一个线粒体疾病综合评分系统, 用于诊断疑是线粒 体疾病患者。该系统是对包括临床症状、体征, 代 谢、影像学、病理学改变等多方面因素进行综合评 价, 其中磁共振诊断与波谱分析起着重要的作用, 因 为属于非侵入性检查, 特别对于儿童, 有良好的依从 性。后二者的结果将决定是否进行下一步检查, 如 分子分析、病理活检等。黄文才等 [ 2 6] 曾观察 7 例线 粒体脑肌病伴高乳酸血症与卒中样发作事件脑内卒 中样病灶的磁共振成像表现, 发现在超急性期 ( 3 d 内) 以细胞毒性水肿为特征, 呈边界清楚的高信号 灶。1H 磁共振波谱进行分析时发现脑卒中样病变在 早期以高耸的双乳酸峰为特征。故认为磁共振成像 和磁共振波谱对评价卒中样发作具有重要价值。 5 与展望 在真核细胞内线粒体除了产生能量之外, 在调 节细胞正常功能如细胞分裂、分化、凋亡、维持内环 境稳态及肿瘤的发生中也起着重要的作用。在疾病 早期, 线粒体功能的改变往往先于临床症状出现。 ·41· 医学综述 2011 年 1 月第 17 卷第 1 期 Medical Recapitulate, Jan 2011 , Vol. 17 , No. 1 因此, 对于线粒体结构及功能的检测可以及时察觉 其功能的改变并做相应的处理, 可以阻止或延缓疾 病的进一步发生、发展。虽然现在有多种方法用来 可以检测线粒体的功能, 但是由于工作人员的操作 技能、所涉及仪器的运行环境、成本、效率等多方面 的限制, 目前绝大多数方法仅局限于科研, 距离真正 的临床实际应用仍然有很长的路要走。 参考文献 [ 1 ] Chance B, Sies H, Boveris A, et al. 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[ 26] 黄文才 , 汤群峰 , 李国雄 , 等 . 线粒体脑卒中样病灶的磁共振诊 断及波谱分析 [ J] . 实用放射学杂志 , 2010, 26( 4) : 457 -461. 收稿日期 : 2010 -08 -12 修回日期 : 2010-11-26 神经递质与睡眠觉醒及学习记忆的关系研究 王雅丽1△ ( 综述 ) , 黄俊山2※ ( 审校 ) ( 1 . 福建医科大学附属协和临床医学院中医科 , 福州 350004; 2. 福建省中医药研究院 , 福州 350003 ) 中图分类号 : R741; R277. 7 文献标识码 : A 文章编号 : 1006-2084( 2011) 01-0015-04 基金项目 : 福建省医学创新课 ( 2009-CX-11) 摘要 : 睡眠是一个主动的神经调节的过程 , 与神经系统内部的结构和神经递质的作用密切相关。 目前关于睡眠与觉醒的机制尚未完全明确 , 许多神经递质参与睡眠与觉醒周期的调节 , 神经递质对 学习记忆能力也有不同的影响。现对乙酰胆碱、去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、一氧化氮及组胺 等几种神经递质对睡眠与觉醒的调节及对学习记忆的影响予以综述。 关键词 : 神经递质 ; 睡眠 ; 觉醒 ; 学习 ; 记忆 Study on the Relationship of Neurotransmitters with Sleep, Awakeness, Learning and Memory WANG Ya-li1 , HUANG Jun-shan2 . ( 1. Department of Traditional Chinese Medicine, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350004 , China; 2. Fujian Institute of Chinese Medicine, Fuzhou 350003, China) Abstract: Sleep is an active neural regulation process, which is closely associated with the internal structure of nervous system and the role of neurotransmitters. At present, the mechanisms of sleep and awake- ness remain unclear. It is discovered that many neurotransmitters are involved in the regulation of sleep- awakeness cycle. Neurotransmitters also have various effects on learning and memory. This paper will review neurotransmitters, such as acetylcholine, norepinephrine, dopamine, serotonin, nitric oxide, and histamine re- garding the adjustation of sleep and awakeness and effects on learning and memory. Key words: Neurotransmitter; Sleep; Awakeness; Learning; Memory 人的一生约有 1 /3 的时 间是在睡眠中度过的, 睡眠 作为维持生命所必需的过 程, 是机体复原、整合和巩固 记忆的重要环节, 是健康不 可缺少的组成部分。神经递 质是神经末梢分泌的化学组 分, 许多神经递质通过突触 传递的方式参与体内各种活 动, 如睡眠与觉醒、学习与记 忆等。对睡眠的各种研究近 些年越来越受到关注, 现从神经递质与睡眠觉醒和 学习记忆的关系方面出发, 阐述神经递质对睡眠觉 ·51·医学综述 2011 年 1 月第 17 卷第 1 期 Medical Recapitulate, Jan 2011 , Vol. 17 , No. 1 3-12 3-13 3-14 3-15