SNT 2849-2011 进出境牛传染性胸膜肺炎检疫规程

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业 犛犖／犜２８４９—２０１１ 进出境牛传染性胸膜肺炎检疫规程 犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾狅犳犮狅狀狋犪犵犻狅狌狊犫狅狏犻狀犲狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪 犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犫狅狏犻狀犲 ２０１１０２２５发布 ２０１１０７０１实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 前　　言 　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：简中友、李叶、马贵平、史喜菊、贾赟、胡传伟、苏永生、孙颖杰。 Ⅰ 犛犖／犜２８４９—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 进出境牛传染性胸膜肺炎检疫规程 １　范围 本标准了牛传染性胸膜肺炎（ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓｂｏｖｉｎｅｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ，ＣＢＰＰ）诊断技术要求。 本标准适用于进出境牛传染性胸膜肺炎检疫、诊断及流行病学调查。 ２　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 ２．１　 牛传染性胸膜肺炎　犮狅狀狋犪犵犻狅狌狊犫狅狏犻狀犲狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪；犆犅犘犘 牛传染性胸膜肺炎（ＣＢＰＰ）也称牛肺疫，是由丝状支原体引起牛的一种接触性传染病，主要侵害牛 的肺和胸膜，其病理特征为纤维素性或浆液纤维素性肺炎、胸膜炎。 ３　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ＣＢＰＰ（ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓｂｏｖｉｎｅｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）：牛传染性胸膜肺炎 ＣＥＬＩＳＡ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）：竞争酶联免疫吸附测定法 ＣＦＴ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｆｉｘａｔｉｏｎｔｅｓｔ）：补体结合试验 ４　流行病学、临床及病理诊断 ４．１　流行病学 在自然条件下，本病主要感染牛等反刍动物，如黄牛、牦牛、水牛、犏牛、奶牛，其中３岁～７岁的牛 多发，犊牛少见。 ４．２　临床症状 急性型：呈急性胸膜肺炎症状，体温升高，热型为稽留热。呼吸困难，气喘，呈腹式呼吸，频发咳嗽， 流浆液性或脓性鼻液。胸部叩诊呈浊音或水平浊音，听诊肺泡音弱或消失，出现罗音、支气管呼吸音和 胸膜摩擦音。后期可见胸前皮下和肉垂水肿。病牛迅速消痩，常窒息死亡。 慢性型：病牛消痩，偶发干性咳嗽，胸部听诊和叩诊无明显变化。 ４．３　病理特点 本病的特征病变主要在肺和胸腔。发病初期，多见炎性浸润，以小叶性支气管炎为特征，小叶呈灰 红色局灶性充血或炎性水肿。随病程发展，多数呈典型的浆液性纤维素性胸膜肺炎、胸膜炎，一侧的膈 叶和中间叶高度肿大，质度坚实如肝脏，肺肝变，常见互相镶嵌的暗红色、灰红色乃至灰黄色的肝变同时 存在，外观呈大理石花纹。病程较长者，病变部的肺组织发生肉变和坏死，坏死灶被结缔组织包围，进一 步形成空洞或瘢痕。 １ 犛犖／犜２８４９—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 有些病例的胸腔积液呈淡黄色透明或纤维素絮状物（或絮片），严重病例发生肺与胸膜黏连。纵隔 淋巴结和支气管淋巴结显著肿大，切面多汁，呈黄白色，并有坏死灶。 ５　病原分离与鉴定 本试验应在生物安全Ⅲ级及以上实验室进行。 ５．１　材料准备 ５．１．１　器材：组织匀浆器、培养皿、小试管、玻片、染色缸、接种环、二氧化碳培养箱、普通显微镜。 ５．１．２　培养基和试剂：１０％马血清马丁肉汤、普通１０％马血清马丁琼脂、葡萄糖生化培养基、精氨酸生 化培养基、四氮唑盐生化培养基、５％铬酸水溶液、姬姆萨氏染液，配制方法见Ａ．１～Ａ．７。 ５．２　样品采集和送检 无菌采取病牛鼻腔分泌物或胸腔积液、血液和关节滑液，或剖检时采取肺脏病变组织、肺门淋巴结 和胸腔渗出液，置于含运输培养基的灭菌容器中，以冷藏状态立即送实验室检疫。不能立即送检的，应 置－２０℃低温保存。 ５．３　样品处理 胸腔液、血液和关节滑液可直接用作接种材料。组织样品匀浆后，用含５００ＩＵ／ｍＬ青霉素及 １∶７０００乙酸铊的肉汤１０倍稀释，置于４℃过夜，即为接种样品液。 ５．４　样品接种 ５．４．１　用灭菌吸管吸取０．１ｍＬ～０．３ｍＬ样品液，无菌接种于５管１０％马血清肉汤培养基中，３７℃培 养１０ｄ。 ５．４．２　用无菌接种环钓取样品液在１０％马血清肉汤琼脂平板上划线接种，每个样品接种５个平板。 平板用胶布封口，倒置于５％二氧化碳培养箱中３７℃培养１０ｄ。 ５．５　观察 ５．５．１　从接种后第３ｄ开始直至第１０ｄ，每天观察接种管及平板生长情况。 ５．５．２　在１０％马血清肉汤试管中，牛传染性胸膜肺炎病原的生长现为：初期呈轻微浑浊或白色点状 或丝状，后逐渐均匀浑浊，呈半透明稍带乳光，无菌膜或沉淀，也无颗粒悬浮。 ５．５．３　在１０％马血清肉汤琼脂培养基上，牛传染性胸膜肺炎病原的生长表现为：生长缓慢，为水滴状 圆形略带灰色的微小菌落，中央有乳头状突起，呈“煎蛋”样外观，菌落直径约为０．２ｍｍ～０．５ｍｍ，小 的不易看见，需用放大镜或低倍显微镜观察。 ５．５．４　将可疑菌落或可疑肉汤培养物接种于１０％马血清肉汤琼脂培养基上，３７℃培养３ｄ～４ｄ，连传 三代进行纯化，供病原鉴定用。 ５．６　病原鉴定 ５．６．１　培养特性 ５．６．１．１　挑取菌落接种于１０％马血清肉汤培养基中，３７℃培养３ｄ～４ｄ，牛传染性胸膜肺炎病原的生 长表现如５．５．２所述。 ２ 犛犖／犜２８４９—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ５．６．１．２　挑取菌落接种在普通１０％马血清肉汤琼脂培养基上，３７℃培养３ｄ～４ｄ，牛传染性胸膜肺炎 病原的生长表现如５．５．３所述。 ５．６．２　染色镜检 挑取典型菌落，涂于玻片上，自然干燥，用５％铬酸水溶液固定２ｍｉｎ，水洗，浸入用蒸馏水稀释的 １∶３０的姬姆萨氏染液中染色，４℃过夜，取出用蒸馏水清洗，自然干燥后用８００倍～１０００倍显微镜观 察。牛传染性胸膜肺炎病原在显微镜下表现为多形态，以球形最常见，也可见杆状、丝状、环状、星状者， 长度为１２５ｎｍ～２５０ｎｍ。 ５．６．３　生化试验 挑取纯化菌落分别接种于葡萄糖生化培养基、精氨酸生化培养基和四氮唑盐生化培养基，３７℃培 养３ｄ～５ｄ后观察结果。牛传染性胸膜肺炎病原能分解葡萄糖产酸变色但不产气；不能分解精氨酸， 试管不变色；能还原四氮唑盐，培养基由无色变为红色。 ５．７　结果判定 符合５．６．１、５．６．２和５．６．３所述条件的，判为牛传染性胸膜肺炎病原体分离鉴定阳性。 ６　微量凝集试验 ６．１　设备及器材 微量移动液器，酶标反应板或微量滴定板（微量板）等。 ６．２　试剂 稀释液为常规方法配制的０．８５％生理盐水；抗原、标准阳性血清、阴性血清按说明书使用。 ６．３　操作方法 ６．３．１　被检血清、标准阳性血清、阴性血清用灭菌生理盐水作１∶４稀释，５６℃～５８℃灭活３０ｍｉｎ。 ６．３．２　用灭菌生理盐水将抗原稀释至工作浓度。 ６．３．３　吸取被检血清２５μＬ，加入微量板的一个孔中。 ６．３．４　加工作量抗原２５μＬ于同一孔内，即每头份被检血清用一个孔。 ６．３．５　每板设阴、阳性血清和生理盐水对照。 ６．３．６　轻轻摇动反应板混匀，放室温暗处或４℃～８℃冰箱内５ｈ～２０ｈ左右。 ６．４　结果判定 ６．４．１　凝集程度：“＋＋＋＋”为１００％凝集，“＋＋＋”为７５％凝集，“＋＋”为５０％凝集，“＋”为２５％凝 集，“－”为不凝集。 ６．４．２　判定方法：判定前轻轻振动反应板，静置３ｍｉｎ～５ｍｉｎ即行判定。判定时用８Ｗ 日光灯照明， 手持反应板，借助侧光在黑色背景上判定或用凝集反应箱观察。受检血清出现阳性反应的需重复试验 一次，如两次结果不一致时，应再复试一次，以两次以上试验结果一致时为准。 ６．４．３　判定标准：在阴、阳性血清和生理盐水对照成立的情况下，被检血清出现“＋＋”及以上凝集反应 的判为阳性；“＋”和“－”为阴性反应。 ３ 犛犖／犜２８４９—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ７　补体结合试验（犆犉犜） ７．１　材料准备 ７．１．１　器材 玻璃试管、试管架、９６孔血凝板、可调式移液器、９６孔板离心机、水浴锅、微量振荡器。 ７．１．２　试剂 ７．１．２．１　巴比妥缓冲液（ＶＢＳ），配制见Ａ．８。 ７．１．２．２　牛传染性胸膜肺炎补体结合试验抗原：由世界动物卫生组织（ＯＩＥ）牛传染性胸膜肺炎参考实 验室提供，使用时按说明书操作。 ７．１．２．３　牛传染性胸膜肺炎补体结合试验标准阴性血清、标准阳性血清：由ＯＩＥ牛传染性胸膜肺炎参 考实验室提供，使用前做１∶１０倍稀释，５６℃水浴灭活３０ｍｉｎ。 ７．１．２．４　溶血素：兔抗绵羊红细胞（ＳＲＢＣ）的异源血清，冻干品，使用前进行效价滴定。 ７．１．２．５　补体：来自豚鼠正常血清，冻干品，使用前进行效价滴定。 ７．１．２．６　阿氏液：配制方法见Ａ．９。 ７．１．２．７　６％红细胞悬液：配制方法见Ａ．１０。 ７．１．２．８　被检血清：无菌采集被检牛血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小 瓶内，编号备用，４℃立即送检或－２０℃冰箱保存。试验前做１∶１０倍稀释，５６℃水浴灭活３０ｍｉｎ。 ７．２　操作方法 ７．２．１　预备试验 ７．２．１．１　溶血素效价的测定 ７．２．１．１．１　１∶２０补体的配制：０．５ｍＬ补体加入９．５ｍＬＶＢＳ稀释成１∶２０补体，置冰浴中待用。 ７．２．１．１．２　６％溶血液的配制：取６％红细胞悬液１０ｍＬ，加入到１５ｍＬ的刻度离心管中，１０００ｒ／ｍｉｎ 离心５ｍｉｎ，弃上清液，加９．４ｍＬ蒸馏水，混匀，使红细胞完全溶解后，再加入０．５ｍＬ１７％的氯化钠 液，混匀。 ７．２．１．１．３　标准溶血管的配制：按表１配制标准比色管。 表１　标准溶血管的配制 单位为毫升 成分 溶血度 ０ １０ ２０ ３０ ４０ ５０ ６０ ７０ ８０ ９０ １００ ＶＢＳ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ６％溶血液 ０．０００ ０．０２５ ０．０５０ ０．０７５ ０．１００ ０．１２５ ０．１５０ ０．１７５ ０．２００ ０．２２５ ０．２５０ ６％红细胞悬液 ０．２５０ ０．２２５ ０．２００ ０．１７５ ０．１５０ ０．１２５ ０．１００ ０．０７５ ０．０５０ ０．０２５ ０．０００ ７．２．１．１．４　１∶１００溶血素的配制：取溶血素原液（等量甘油保存）０．２ｍＬ，加入ＶＢＳ９．８ｍＬ混匀制成 １∶１００倍稀释的溶血素。 ７．２．１．１．５　不同稀释度溶血素溶液的配制：按表２用ＶＢＳ稀释１∶１００的溶血素，混匀配制不同稀释 度的溶血素溶液。 ４ 犛犖／犜２８４９—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 表２　溶血素稀释表 单位为毫升 试管号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ 稀释度 １∶１０００ １∶２０００ １∶３０００ １∶４０００ １∶５０００ １∶６０００ １∶７０００ １∶８０００ １∶９０００ １∶１００溶血素 ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ＶＢＳ ０．９ １．９ ２．９ ３．９ ４．９ ５．９ ６．９ ７．９ ８．９ ７．２．１．１．６　溶血素效价确定：按表３建立试验，振荡混匀，置于３７℃水浴作用３０ｍｉｎ，将上述各试管 ２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，观察结果。 表３　溶血素效价测定 单位为毫升 试管号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ 溶血素 对照 补体 对照 红细胞 对照 溶血素 稀释度 １∶１０００１∶２０００１∶３０００１∶４０００１∶５０００１∶６０００１∶７０００１∶８０００１∶９０００１∶１００ 溶血素 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０ １∶２０ 补体 ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０ ６％红 细胞 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ＶＢＳ ０．５ ０．５ ０．５ ０．５ ０．５ ０．５ ０．５ ０．５ ０．５ ０．５ ０．７ ０．８ 结果 － － － － － － － ＋＋ ＋＋＋ － ＋＋＋＋＋＋＋＋ 　　注：“－”表示１００％溶血，“＋”表示７５％溶血，“＋＋”表示５０％溶血，“＋＋＋”表示２５％溶血，“＋＋＋＋”表示不 溶血。 　　溶血素对照组全部溶血，补体对照组、红细胞对照组不溶血，否则试验不成立，需重做。以５０％溶 血的溶血素的最高稀释倍数为一个单位的溶血素，使用时用１２个单位溶血素。如表３溶血素效价为 １∶８０００，使用时应将溶血素稀释至１∶６６６．６。 ７．２．１．２　补体效价的测定 ７．２．１．２．１　致敏红细胞的配制：将等量６％的绵羊红细胞与１２个单位的溶血素混匀，３７℃水浴 ３０ｍｉｎ后，置于４℃冰箱，备用。 ７．２．１．２．２　按表４在冰浴中用ＶＢＳ稀释补体。 表４　补体稀释表 单位为微升 试管号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ 稀释度 １∶３０ １∶３５ １∶４０ １∶４５ １∶５０ １∶５５ １∶６０ １∶７０ １∶８０ １∶９０ １∶１００ 补体 ２０ ２０ ２０ ２０ ２０ ２０ １０ １０ １０ １０ １０ ＶＢＳ ５８０ ６８０ ７８０ ８８０ ９８０ １０８０ ５９０ ６９０ ７９０ ８９０ ９９０ ５ 犛犖／犜２８４９—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ７．２．１．２．３　按表５、表６、表７、表８建立试验，观察结果。 表５　补体效价测定（阳性血清加抗原表） 单位为毫升 试管号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ 补体稀释度 １∶３０ １∶３５ １∶４０ １∶４５ １∶５０ １∶５５ １∶６０ １∶７０ １∶８０ １∶９０ １∶１００ 补体 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ １∶１０阳性血清 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ 抗原（工作量） ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ 振荡混匀后置３７℃水浴作用３０ｍｉｎ 致敏红细胞 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ 振荡混匀后置３７℃水浴作用３０ｍｉｎ，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ 结果 ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ 表６　补体效价测定（阳性血清未加抗原表） 单位为毫升 试管号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ 补体 对照 致敏红 细胞对 照 补体稀释度 １∶３０１∶３５１∶４０１∶４５１∶５０１∶５５１∶６０１∶７０ １∶８０ １∶９０ １∶１００ 补体 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ １∶１０阳性血清 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ＶＢＳ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ 振荡混匀后置３７℃水浴作用３０ｍｉｎ 致敏红细胞 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ 振荡混匀后置３７℃水浴作用３０ｍｉｎ，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ 结果 － － － － － － ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ － ＋＋＋＋ 表７　补体效价测定（阴性血清加抗原表） 单位为毫升 试管号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ 补体稀释度 １∶３０ １∶３５ １∶４０ １∶４５ １∶５０ １∶５５ １∶６０ １∶７０ １∶８０ １∶９０ 补体 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ １∶１０阴性血清 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ 抗原 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ 振荡混匀后置３７℃水浴作用３０ｍｉｎ 致敏红细胞 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ 振荡混匀后置３７℃水浴作用３０ｍｉｎ，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ 结果 － － － － － － ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ ６ 犛犖／犜２８４９—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 表８　补体效价测定（阴性血清未加抗原表） 单位为毫升 试管号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ 补体稀释度 １∶３０ １∶３５ １∶４０ １∶４５ １∶５０ １∶５５ １∶６０ １∶７０ １∶８０ １∶９０ 补体 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ １∶１０阴性血清 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ＶＢＳ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ 振荡混匀后置３７℃水浴作用３０ｍｉｎ 致敏红细胞 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ 振荡混匀后置３７℃水浴作用３０ｍｉｎ，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ 结果 － － － － － － ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ ７．２．１．２．４　补体效价的确定：在阳性血清加抗原管中完全不溶血，而阳性血清未加抗原管、阴性血清未 加抗原管及阴性血清加抗原管中发生完全溶血的所需最小量补体即为一个单位补体。如表中一个补体 单位为１∶５５稀释度的补体，在正式实验中使用２．５单位的补体。 ７．２．１．３　抗原效价的测定 ７．２．１．３．１　用ＶＢＳ将抗原做依次２１～２７ 稀释。 ７．２．１．３．２　用ＶＢＳ将阳性血清做依次２１～２７ 稀释。 ７．２．１．３．３　用ＶＢＳ将阴性血清做１∶２稀释。 ７．２．１．３．４　按表９建立试验。 表９　抗原效价测定 单位为毫升 成分 管号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ 抗原 稀释度 １∶２ 抗原 稀释度 １∶４ 抗原 稀释度 １∶８ 抗原 稀释度 １∶１６ 抗原 稀释度 １∶３２ 抗原 稀释度 １∶６４ 抗原 稀释度 １∶１２８ 血 清 对 照 抗 原 对 照 补 体 对 照 红 细 胞 对 照 抗原 ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ — ０．１ — — 阳 性 血 清 稀 释 度 １∶２ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ — — — １∶４ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ — — — １∶８ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ — — — １∶１６ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ — — — １∶３２ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ — — — １∶６４ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ — — — １∶１２８ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ — — — １∶２阴性血清 ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ ０．１ — — — ２．５单位补体 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ — ＶＢＳ缓冲液 — — — — — — — — ０．２ ０．２ ０．２ ３７℃水浴作用７５ｍｉｎ 致敏红细胞 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ３７℃水浴作用３０ｍｉｎ ７ 犛犖／犜２８４９—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ７．２．１．３．５　以阳性血清各稀释度发生抑制溶血最高稀释度为抗原效价，０．１ｍＬ该稀释度的抗原为一 个抗原单位，本试验使用２个单位。 ７．２．２　正式试验 ７．２．２．１　对照设定：每个９６孔板均需设标准阴性血清、标准阳性血清、０．５单位补体、１单位补体、２．５ 单位补体、致敏红细胞、抗原对照。 ７．２．２．２　按表１０建立试验，观察结果。 表１０　正式试验操作程序表 单位为微升 孔 号 样品 对照 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ 致敏红 细胞对 照 抗原 对照 血清 被检血清 阳性血清 阴性血清 补体对照 试验孔 对照孔 试验孔 对照孔 试验孔 对照孔 ０．５单位 １单位 ２．５单位 ２５ ２５ ２５ ２５ ２５ ２５ — — — — — 抗原 ２５ ０ ２５ ０ ２５ ０ — — — — ２５ 补体 ２５ ２５ ２５ ２５ ２５ ２５ ２５ ２５ ２５ — ２５ ＶＢＳ ０ ２５ ０ ２５ ０ ２５ ５０ ５０ ５０ ７５ ２５ 振荡混匀后置３７℃水浴作用３０ｍｉｎ 致敏红细胞 ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ 振荡混匀后置３７℃水浴作用３０ｍｉｎ，２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ 结果 － － ＋＋＋＋ － － － ＋＋＋＋ ＋＋ － ＋＋＋＋ － ７．３　结果判定 ７．３．１　试验成立条件 阳性血清加抗原对照孔、致敏红细胞对照孔、０．５单位补体对照孔完全不溶血；１单位补体对照孔出 现部分溶血；阴性血清、阳性血清对照管完全溶血，证明试验操作无误。 ７．３．２　被检血清判定 ７．３．２．１　被检血清的试验孔和对照孔均１００％溶血，被检血清判为阴性。 ７．３．２．２　被检血清未加抗原孔１００％溶血，被检血清加抗原孔１００％抑制溶血，被检血清判为阳性。 ７．３．２．３　被检血清未加抗原孔１００％溶血，被检血清加抗原孔出现２５％、５０％或７５％抑制溶血时，被 检血清判为可疑，应重新检验一次。重做时，被检血清只有出现１００％抑制溶血才能判为阳性。 ７．３．２．４　被检血清对照管发生不完全溶血或完全抑制溶血时，为血清抗补体反应，此份血清应重采或 用其他方法测试。 ８ 犛犖／犜２８４９—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ８　竞争酶联免疫吸附试验（犮犈犔犐犛犃） ８．１　材料准备 ８．１．１　器材 移液器、酶标仪、温箱、９６孔ＥＬＩＳＡ板、低温冷冻冰箱。 ８．１．２　试剂 ８．１．２．１　贮存抗原、单克隆抗体、标准阴性血清和标准阳性血清：由 ＯＩＥ热带地区动物病诊断和控制 合作中心提供。单克隆抗体在使用前按说明书用稀释液配制成工作浓度。贮存抗原在－２０℃条件下 保存。 ８．１．２．２　酶结合物：ＤＡＫＯＰ２６０，由ＯＩＥ热带地区动物病诊断和控制合作中心提供，按说明书使用。 ８．１．２．３　包被液、稀释液、洗涤液、底物液、终止液，配制方法分别见Ａ．１１、Ａ．１２、Ａ．１３、Ａ．１４和Ａ．１５。 ８．１．３　被检血清 采集被检牛血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，编号备用，４℃ 立即送检或－２０℃冰箱保存。试验前用稀释液作１∶１０倍稀释。 ８．２　操作方法 ８．２．１　按使用说明书用包被液稀释贮存抗原，包被ＥＬＩＳＡ板，１００μＬ／孔，４℃过夜。 ８．２．２　用洗涤液（ＷＢ）洗板１次，３００μＬ／孔。 ８．２．３　每孔分别加入１∶１０倍稀释的被检血清和工作浓度单抗各５０μＬ，同时设标准阴性血清、标准 阳性血清、标准弱阳性血清以及结合物对照孔、单抗对照孔，将ＥＬＩＳＡ反应板放置于３７℃温育１ｈ。 ８．２．４　用洗涤液洗板２次，３００μＬ／孔。 ８．２．５　每孔加入１００μＬ酶结合物，３７℃反应３０ｍｉｎ。 ８．２．６　用洗涤液洗板３次，３００μＬ／孔。 ８．２．７　每孔加入１００μＬ底物液，３７℃反应３０ｍｉｎ。 ８．２．８　每孔加入１００μＬ终止液，用酶标仪在４０５ｎｍ波长下读取ＯＤ值。 ８．３　结果判定 ８．３．１　样品抑制率（％）计算 按式（１）计算样品抑制率： 样品抑制率（％）＝１００×（犗犇ＣＭ－犗犇样品）／（犗犇ＣＭ－犗犇ＣＣ） …………（１） 式中： 犗犇ＣＭ ———单抗对照孔ＯＤ值； 犗犇样品———被检样品孔ＯＤ值； 犗犇ＣＣ ———酶结合物对照孔ＯＤ值。 ８．３．２　试验成立的条件 犗犇ＣＭ在０．８～１．６之间，犗犇ＣＣ小于０．３，标准阴性血清抑制率小于３５％，标准弱阳性血清抑制率在 ５０％～８０％，标准强阳性血清抑制率在６０％～９０％。试验不能同时满足上述条件，应重做。 ９ 犛犖／犜２８４９—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ８．３．３　判定 当被检样品抑制率等于或大于５０％时，判为阳性；被检样品抑制率等于或低于４０％为阴性；被检样 品抑制率介于４０％～５０％为可疑。可疑样品应重新试验，重新试验如样品抑制率等于或大于５０％，判 为阳性；抑制率小于５０％时，为阴性。 ０１ 犛犖／犜２８４９—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犃 （规范性附录） 培养基和试剂的配制 犃．１　运输培养基 牛心浸液　　　　　　１０００ｍＬ 酵母浸膏 １００ｇ 琼脂 ３ｇ 青霉素 ５０００００ＩＵ 乙酸铊 ０．１４ｇ 马血清 ２００ｍＬ 先将乙酸铊溶于１５ｍＬ的无菌蒸馏水中；牛心浸液中加入琼脂、酵母浸膏，煮沸溶解后，１２１℃灭菌 １５ｍｉｎ。待培养基温度降至３７℃以下时，将乙酸铊、青霉素及经５６℃灭活３０ｍｉｎ的马血清加入其中， 混匀、分装至无菌的容器中。经无菌检验后置４℃保存备用。 犃．２　１０％马血清肉汤培养基 牛心浸液　　　　　　１０００ｍＬ 酵母浸膏 １００ｇ 马血清 １００ｍＬ 葡萄糖 ５ｇ 青霉素 ５０００００ＩＵ 乙酸铊 ０．１４ｇ 先将乙酸铊溶于１５ｍＬ的无菌蒸馏水中；牛心浸液中加入葡萄糖、酵母浸膏，煮沸溶解后，１５磅灭 菌１５ｍｉｎ。待培养基温度降至３７℃以下时，将乙酸铊、青霉素及经５６℃灭活３０ｍｉｎ的马血清加入其 中，混匀、分装至无菌的容器中。经无菌检验后置４℃保存备用。 犃．３　１０％马血清肉汤琼脂培养基 牛心浸液　　　　　　　１０００ｍＬ 酵母浸膏 １００ｇ 马血清 １００ｍＬ 葡萄糖 ５ｇ 琼脂 １２ｇ ＤＮＡ ２ｇ 青霉素 ５０００００ＩＵ 乙酸铊 ０．１４ｇ 先将乙酸铊溶于１５ｍＬ的无菌蒸馏水中；牛心浸液中加入琼脂、葡萄糖、酵母浸膏，煮沸溶解后， １５磅灭菌１５ｍｉｎ。待培养基温度降至３７℃以下时，将乙酸铊、青霉素及经５６℃灭活３０ｍｉｎ的马血清 加入其中，混匀、分装至无菌的容器中。经无菌检验后置４℃保存备用。 １１ 犛犖／犜２８４９—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 犃．４　葡萄糖生化培养基 牛心浸液　　　　　　１０００ｍＬ 酵母浸膏 ２５０ｇ 马血清 １００ｍＬ １％酚红 ５ｍＬ ５０％葡萄糖溶液 １０ｍＬ 牛心浸液中加入酚红和酵母浸膏，煮沸溶解，１５磅灭菌１５ｍｉｎ，无菌加入葡萄糖溶液和经５６℃灭 活３０ｍｉｎ的马血清，混匀、分装至无菌的生化试管中。经无菌检验后置４℃保存备用。 犃．５　精氨酸生化培养基 牛心浸液　　　　　　１０００ｍＬ 酵母浸膏 ２５０ｇ 马血清 １００ｍＬ １％酚红 ５ｍＬ ＤＮＡ ２ｇ ３８％精氨酸盐溶液 ４０ｍＬ 牛心浸液中加入酚红和酵母浸膏，煮沸溶解，１５磅灭菌１５ｍｉｎ，无菌加ＤＮＡ２ｇ、无菌的精氨酸盐 溶液和经５６℃灭活３０ｍｉｎ的马血清，混匀、分装至无菌的生化试管中。经无菌检验后置４℃保存 备用。 犃．６　四氮唑盐生化培养基 牛心浸液　　　　　　１０００ｍＬ 酵母浸膏 ２５０ｇ 马血清 １００ｍＬ １％酚红 ５ｍＬ ＤＮＡ ２ｇ ２％四氮唑盐溶液 １０ｍＬ 牛心浸液中加入酚红和酵母浸膏，煮沸溶解，１５磅灭菌１５ｍｉｎ，无菌加ＤＮＡ、四氮唑盐溶液和经 ５６℃灭活３０ｍｉｎ的马血清，混匀、分装至无菌的生化试管中。经无菌检验后置４℃保存备用。 犃．７　姬姆萨氏染液 取０．６ｇ姬姆萨氏染料，加到５０ｍＬ甘油中，５５℃～６０℃水浴１．５ｈ～２ｈ，再加入５０ｍＬ甲醇，静 止２４ｈ以上，过滤后即成姬姆萨氏染液。 犃．８　巴比妥缓冲液（犞犅犛） 氯化钠（ＮａＣｌ）　　　　　　８５．００ｇ 氯化镁（ＭｇＣｌ） １．６８ｇ ２１ 犛犖／犜２８４９—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 氯化钙 ０．２８ｇ 巴比妥 ５．７５ｇ 巴比妥钠 ２．００ｇ 去离子水 ２０００ｍＬ 将巴比妥加入５００ｍＬ蒸馏水内，加热溶解后再加入其他成分，溶解，加蒸馏水至２０００ｍＬ，分装， １．０３４×１０５Ｐａ高压灭菌２０ｍｉｎ，冷却后置４℃冰箱保存。临用时稀释５倍。 犃．９　阿氏液（犃犾狊狏犲狉’狊） 葡萄糖　　　　　　 １８．６６ｇ 氯化钠（ＮａＣｌ） ４．１８ｇ 柠檬酸钠 ８．０ｇ 柠檬酸 ０．５５ｇ 去离子水 １０００ｍＬ 加热溶解，过滤，分装成５瓶，用５．４×１０４Ｐａ高压灭菌２０ｍｉｎ，冷却后置４℃冰箱保存备用。 犃．１０　６％绵羊红细胞悬液 选健康成年绵羊，无菌颈静脉采血，１．２份阿氏液加１份血液，混和后置４℃冰箱稳定４ｄ～５ｄ。使 用时将血液吸入离心管中，１５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，用吸管吸取上清液和红细胞上层的白细胞和血小 板薄膜后加 ＶＢＳ缓冲液洗涤，再经１５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，弃去上清液，如此反复洗四次。吸取 ６ｍＬ红细胞泥，加９４ｍＬ的ＶＢＳ缓冲液，混匀即成６％绵羊红细胞悬液。 犃．１１　包被液（０．０１犿狅犾／犔狆犎值７．４犘犅犛） 氯化钠（ＮａＣｌ）　　　　　　　　　　　８．０ｇ 氯化钾（ＫＣｌ） ０．２ｇ 磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ） ０．２ｇ 磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ） １．４４ｇ 水 １０００ｍＬ 加蒸馏水溶解至１０００ｍＬ，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，冷却后置４℃冰箱备用。 犃．１２　稀释液 ０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ值７．４ＰＢＳ　　　　　　１００ｍＬ 马血清 ０．５ｍＬ 吐温２０ ０．０５ｍＬ 混匀后置４℃冰箱备用。 犃．１３　洗涤液（犠犅） ０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ值７．４ＰＢＳ　　　　　　１０００ｍＬ 吐温２０ ０．５ｍＬ ３１ 犛犖／犜２８４９—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 混匀后置４℃冰箱备用。 犃．１４　底物液 磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４）　　　　　　　　　　　　　　　　　１．８４ｇ 柠檬酸 ０．５１ｇ ＡＢＴＳ，２，２′Ａｚｉｎｏｂｉｓ（３ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｂｉｏｚｏｌｉｎｅ６ｓｕｌｆｏｎｉｃ） ５０ｍｇ ３％双氧水 ２００μＬ 水 １００ｍＬ 犃．１５　终止液（２犿狅犾／犔硫酸） 量取浓硫酸４ｍＬ，加入３２ｍＬ水，混匀。 ４１ 犛犖／犜２８４９—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 １１０２— ９４８２ 犜／ 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 进出境牛传染性胸膜肺炎检疫规程 ＳＮ／Ｔ２８４９—２０１１  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 １．２５　字数 ２９ 千字 ２０１１年６月第一版　２０１１年６月第一次印刷 印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２２１１５　定价 ２１．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售