高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶和奶粉中的三聚氰酸

2010年9月 September2010 色 谱 ChineseJournalofChromatography V01．28N0．9 859～862 研究 DOI：10．3724／SP．J．1123．2010．00859 高效液相色谱．串联质谱法测定牛奶和奶粉中的三聚氰酸 桂茜雯4， 柳 菡， 赵增运， 丁 涛， 徐锦忠， 沈伟健， 沈崇钰， 吴 斌， 张 睿 (江苏出入境检验检疫局动植物与食品检溯中心，江苏南京210001) 摘要：建立了牛奶和奶粉中三聚氰酸(CYA)的高效液相色谱一串联质谱(HPLC，MS／MS)测定。样品用乙腈提 取并沉淀蛋白，经强阴离子交换柱富集和净化，AX色谱柱分离，HPLC·MS／MS法测定．内标法定量。50～2000 斗g／L范围内CYA的线性关系良好(r≥0．999)；在奶粉和牛奶基质中，添加200、500和l000斗g／kg3个添加水平 的同收率均在97％～12l％之间，相对偏差(RSD)均小于4．8％；定量限(LOQ)为200斗g／kg。方法的前处理快 速简便，净化效果好，准确度和精密度高，可用于牛奶和奶粉中CYA的测定。 关键词：高效液相色谱一串联质谱；=三聚氰酸；牛奶；奶粉 中图分类号：0658 文献标识码：A 文章编号：1000-8713(2010)09-0859—04 Determinationofcyanurieacidinmilkandmilkpowder 41 byhighperformanceliquidchromatography一 tandemmassspectrometry GUIQianwen8，LIUHan，ZHAOZengyun，DINGTao，XUJinzhong， SHENWeijian，SHENChongyu，W．UBin，ZHANGRui ‘ (Animal，PlantandFoodInspectionCenterofJiangsuEntry·ExitInspection 。。． and蛳绍￡l孵Bureau，Nanfing210001，China) 溺 Abstract：Amethodforthedeterminationofcyanuficacid(CYA)inmilkandmilkpowder wasdevelopedusinghighperformanceliquidchromatography—electrosprayionizationtandem massspectrometry(HPLC·ESIMS／MS)．Thetargetanalytewasextractedfromsamplesby acetonitrile，andtheproteinswereprecipitatedatthesametime．ThesupernatantWascleaned upandenrichedwithastronganionexchangecolumn，analysedbyHPLC—MS／MSwithanAX column，andquantifiedbyinternalstandardmethod．Goodlinearitywasobtainedintherange of50—2000斗g／L．Therecoverieswereallrangedfrom97％to12l％atthreelevels，200，500 and1000I_Lg／kg，andtherelativestandarddeviations(RSDs)wereallbelow4．8％．Limitof quantification(LOQ)was200斗g／kg．Themethodhashighaccuracyandprecision，theopera- tionisfast，easyandsuitableforthedeterminationofCYAinmilkandmilkpowder． Keywords：highperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry(HPLC-Ms／ MS)；cyanuncacid；milk；milkpowder 三聚氰酸(CYA)又名氰尿酸，与三聚氰胺结构 类似，同属三嗪类含氮杂环有机化合物。CYA因含 氮量高，有人将其作为伪蛋白添加使用。而另一种 非法添加物三聚氰胺在强酸或强碱溶液中水解最终 也会生成CYA。研究结果显示，生物体内单独摄入 三聚氰胺毒性较低，同时摄人CYA和三聚氰胺后会 导致肾毒性¨。1。 目前对CYA的检测方法有高效液相色谱法 (HPLC)’4。71、气相色谱．质谱联用法(GC—MS)J‘II] 和液相色谱一质谱联用法(HPLC．MS)。12。“，单独检 测CYA㈠5’7·¨t14。或与三聚氰胺同时检测：6’8。住’13·”3。 常用的前处理方法是用有机溶剂或水溶液等试剂提 $通讯联系人：桂茜雯。助理师，主要研究方向为食品检测．Tel：(025)52345177，E—mail：wendy_gqw@yahoo．corn．ca 收稿日期：2010-05—26 篱：{；，。麓 万方数据 ·860· 色 谱 第28卷 取，离心后过滤膜直接进行HPLC或HPLC—MS测 定，大都缺乏更加有效的前处理方法。采用GC—MS 法需经过衍生，衍生化试剂会产生一定的杂质，对目 标物的测定产生干扰，也易对仪器造成污染。有研 究使用透析方法H1将CYA与高蛋白基质分离，净化 效果较好但是耗时过长。也有方法¨¨为达到较好 的净化效果，多次加入不同试剂，前处理相对烦琐， 处理后样品浓度被稀释多倍，不利于痕量检测。本 文建立了采用乙腈提取牛奶和奶粉中的CYA，经强 阴离子交换固相萃取(SPE)柱富集和净化，采用 AX色谱柱进行分离，HPLC·MS／MS测定，内标法定 量的分析方法。 1 实验部分 1．1仪器与试剂 AppliedBiosystems4000QTrap质谱仪(美国 AppliedBiosystems公司)，配有电喷雾离子源 (ESI)；Agilent1200液相色谱仪(美国Agilent公 司)；真空氮气吹干仪(美国Zymark公司)；Milli—Q 去离子水发生器(美国Millipore公司)；XW一80A涡 旋混匀器(上海医科大学仪器厂)；LDZ5—2离心机 (北京医用离心机厂)；KQ·250DE超声仪(江苏昆 山超声仪器有限公司)。 乙腈、甲醇、甲酸、氢氧化钠(分析纯，江苏南京 化学试剂厂)；乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；强 阴离子交换SPE柱(60mg，3mL，天津Agela公 司)；CYA(纯度≥99．0％，美国Fluka公司)；CYA 同位素(CYA_13C，，纯度≥98．2％，上海振翔公司)； 水为去离子水；牛奶和奶粉样品为各地送检的阴性 样品。 1．2仪器条件 HPLC条件BioBasiclMAX(150mmx2．1 mm，5“m，美国ThermoFisher公司)；流动相： 90％(体积分数)乙腈水溶液；等度洗脱，流速0．5 mL／min；柱温：室温；进样体积：25wL；分析时间： 5 min。 MS条件离子源：ESI，负离子方式检测；检测 模式：多反应监测(MRM)；离子喷雾(IS)电压： 一4500V；雾化气(GSI)压力：55Pa；气帘气 (CUR)压力：25Pa；辅助气(GS2)压力：50Pa；离 子源温度：550℃；去簇电压(DP)：一4lV；碰撞气 能量(CE)：一14V；碰撞室入口电压(EP)：一10V； 碰撞室出口电压(CXP)：一15V。CYA和其同位素 内标的其他质谱条件见1。 表I 三聚氰酸及其内标的质谱条件 Table1 MS／MSconditionsofcyanuricacidandCyA．13C， 1．3标准溶液配制 准确称量lOmg的CYA标准品或CYA同位素 标准品，用50％(体积分数)乙腈水溶液溶解并定容 于100mL容量瓶中，配制成100mg／L的CYA或 CYA同位素的标准储备液。放置于冰箱中0—4℃ 下避光存放(有效期1年)。 准确吸取一定量的100mg／LCYA和CYA同 位素标准储备溶液，用乙腈逐级稀释为lmg／L的 标准溶液，于0～4℃下保存备用。 逐级稀释CYA标准溶液，用乙腈配制质量浓度 分别为50、100、200、500、1000、2000斗g／L，每个浓 度的标准溶液都含0．1mg／LCYA同位素。 1．4样品前处理 准确称取1g(±0．02g)样品于50mL有盖塑 料离心管中(奶粉样品中需加入2mL去离子水，涡 旋30S混匀)，加入lmg／L的CYA同位素内标标 准溶液100斗L，在涡旋器上快速混匀10S，再加入 乙腈8mL，加盖涡旋30S，超声15min。以8000 r／min速率离心4min，将上层清液转移至10mL氮 吹管中，在45℃水浴下氮气吹至1mL，加去离子水 8mL，加入1moVL的氢氧化钠溶液0．5mL，混匀， 待净化。 用3mL甲醇、3mL水依次活化强阴离子交换 柱，将待净化液全部上柱，再用3mL水和3mL甲 醇依次洗涤SPE小柱，用3mL1．0％(体积分数) 甲酸甲醇溶液洗脱至10mL氮吹管中，在45℃水 浴下氮气吹干。用1．0mL90％乙腈水溶液定容 后，涡旋，过0．45ixm有机相滤膜到进样瓶中，供 HPLC—MS／MS测定。 2结果与讨论 2．1提取和净化条件的选择和优化 乳制品蛋白含量较高，需要加入有机溶剂沉淀 蛋白。实验中考察过甲醇、乙醇、乙腈，发现乙腈的 沉淀蛋白效果和提取效果均较好，因此选择乙腈作 为提取溶剂。对于奶粉样品，需先加入少量水溶解， 再加入乙腈，比直接加入乙腈时的提取回收率高，净 化效果好。 万方数据 第9期 桂茜雯．等：高效液相色谱一串联质谱法测定牛奶和奶粉中的三聚氰酸 ·861· 由于CYA含羟基，呈弱酸性，因此可采用强阴 离子交换柱进行SPE净化。实验中发现洗脱液中 甲酸含量(用体积分数表示)对CYA的回收有显著 影响。对洗脱液中甲酸含量(10％、5％、3％、l％、 0．5％和O．1％)进行考察，发现用甲酸含量较高 (5％以上)的洗脱液回收率较低，且随洗脱后溶液 放置时间的延长而降低，推测CYA在较多甲酸环境 中不稳定。含0．1％甲酸的洗脱液回收率较低，增 加洗脱液体积可以提高回收率。可见甲酸含量低时 洗脱能力下降，不能将CYA完全洗脱。采用1％的 甲酸甲醇溶液，既能将CYA洗脱，又不影响其稳定 性。因此选择1％的甲酸甲醇溶液作为洗脱溶液。 2．2色谱和质谱条件的优化 在实验方法调试过程中，采用C，。色谱柱与AX 色谱柱分别进行测定。由于CYA极性较大，在C，。 柱上没有保留，与很多杂质同时流出，在离子化时相 互竞争，造成严重的基质抑制效应，影响峰形和灵敏 度。使用具有正相机理的AX柱，正相模式下进行 分离，使CYA在色谱柱上产生保留，与杂质有效分 离，既改善了CYA的色谱行为，又减少了电喷雾时 基质中其他成分对CYA离子化的抑制。负离子模 式下的电喷雾离子化使CYA产生m／z127．8的准 分子离子峰[M—H]一，对碰撞能量进行优化得到子 离子m／z41．9和84．9，其丰度比为100：74。CYA 同位素内标产生m／z130．8的准分子离子峰[M— H]一，子离子为m／z43．1。 2．3线性范围和定量限 用CYA及其内标配制相应浓度的系列标准溶 液，以CYA和内标物的峰面积比为纵坐标，CYA的 质量浓度为横坐标进行线性回归，结果表明本方法 在CYA为50—2000¨g／L时，相关系数为0．9990， 线性关系良好。在空白奶粉和牛奶基质中添加 CYA标准品，当CYA质量浓度达200斗∥kg时，信 噪比远远大于10，而此浓度已达到国际贸易的限量 要求(250v．g／kg)。121，故确定定量限为200¨g／kg。 CYA和其内标标准溶液的MRM谱图见图1。 ＆ U 、 蚤 。磊 董 t／min timin 圈1 CYA标准溶液1200●喀／L)及内标标准溶液的MRM谱图 Fig．1LC．MS／MSehromatogramsofCYA(200v．／L)andCYA 13 C3inmulti．reactionmonitoring(MRM)mode 2．4回收率和精密度 在空白牛奶和奶粉样品中添加CYA标准溶液， 添加的水平分别为200、500和l000斗g／kg，计算其 回收率和精密度(n=7)，结果见表2。牛奶基质和 奶粉基质在200斗g／kg添加水平下的MRM谱图见 图2和图3。 t／min t／min 图2奶粉阴性样品中添加CYAf200．1jg／kg)和内标标准溶液的MRM谱图 Fig．2LC．MS／MSchromatogramsofablankmilkpowderspikedCYA(200pg／kg)andCYA一”C3inMRMmode ＆=童slIo菪一 sdo、扫ISco董『Isd口、扫一su3c一 万方数据 ·862· 色 谱 第28卷 t|rain t|rain 圈3 牛奶阴性样品中添加CYA(200tug／kgl和内标标准溶液的MRM谱图 Fig．3LC-MS／MSchromatogramsofablankmilkspikedCYA(200pg／kg)andCYA-13C3inMRMmode 袭2奶粉和牛奶基质中不同添加水平的CYA的回收率和精密度(n=7) Table2 ReeoveriesandprecisionsofCYAspikedinblankmilkandmilkpowder【n=7) 2．5实际样品检测 除了对送检样品进行检测以外，我们采用本方 法对市场上8种品牌的牛奶和奶粉做抽样检测后发 现，在品牌A的鲜奶中检测出CYA，其中瓶装奶和 袋装奶检出值分别为310Ixg／kg和270Ixg／kg；品 牌B的鲜奶中的CYA的检出量约为210¨g／kg。 而其他品牌鲜奶未检出CYA。抽样的各品牌奶粉 中均没有检出CYA。 3 结语 建立了HPLC-MS／MS检测牛奶和奶粉中CYA 的方法。利用乙腈沉淀样品中的蛋白质并提取 CYA，用强阴离子交换柱富集净化，用AX色谱柱取 代C，。色谱柱进行HPLC分离，HPLC—MS／MS方法 检测，内标法定量。方法前处理操作简便，净化效果 好，CYA在AX柱上的色谱行为得到改善，抗干扰能 力强，准确度和精密度高，在牛奶和奶粉基质中有较 高的回收率。经200余个样品的实际检测证明，该 方法适合国内外监控和检测的要求。 参考文献： [i]BrownCA，JeongKS，PoppengaRH，eta1．JVetDiagn invest，2007，19：525 [2]DobsonRLM，MoflaghS，QIIijanoM，eta1．ToxicolSci， 2008，106(1)：251 [3]WangYY，ChalWJ，GaoMZ，eta1．JToxicol，2009，23 (3)：243 [4] [5] [6] [7] [8] WeiWB，ZhangCL．ChineseJournalofHealthLaboratory Technology(魏文彬，张长龙．中国卫生检验杂志)，2009， 19(3)：481 ‘ WangQ，XianYP，LuoHY，eta1．ModernFoodScience andTechnology(王强，冼燕萍，罗海英，等．现代食品科 技)，2009。25(6)：71l HouSJ，WangH，DingMY．ScienceinChinaSeriesB： Chemmtry(侯升杰，王辉，丁明玉．中国科学B辑：化学)， 2009。39(8)：845 YuC，ZhuLH，XiaoJY，eta1．FoodControl，2009，20： 205 LiFG，YaoWQ，SuM．eta1．ChineseJournalofChroma- tography(李锋格，姚伟琴，苏敏，等．色谱)，2009，27(2)： 233 GB／T22288-2008 MiaoH，FanS，WuYN，eta1．BiomedEnvironSci，2009， 22：87 LiF G。YaoWQ，TianYH，eta1．ChineseJournalof Chromatography(李锋格，姚伟琴，田延河，等．色谱)， 2010，28(3)：319 TurnipseedS，CaseyC。NochettoC，eta1．FDALabhlf0 Bull，2008。24：442l LuanW．JournalofInstrumentalAnalysis(栾伟．分析测试 学报)。2008，27：203 PaUlK．JonesK．JChromatogrB，2007，853：360 KarbiwhykCM。AndersenWC，TurnipseedSB，eta1． AnalChimActa，2009，637：lOl ∞8、^l_口8_口_o口口、五_∞薯3薯一 ]O l p．二| 二． 2 3 4 5；P【 万方数据 高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶和奶粉中的三聚氰酸 作者： 桂茜雯， 柳菡， 赵增运， 丁涛， 徐锦忠， 沈伟健， 沈崇钰， 吴斌， 张睿， GUI Qianwen， LIU Han， ZHAO Zengyun， DING Tao， XU Jinzhong， SHEN Weijian， SHEN Chongyu， WU Bin， ZHANG Rui 作者单位： 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心,江苏,南京,210001 刊名： 色谱 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY 年，卷(期)： 2010,28(9) 参考文献(15条) 1.Karbiwhyk C M;Andersen W C;Turnipseed S B 查看详情 2009 2.Patel K;Jones K Analytical method for the quantitative determination of cyanuric acid as the degradation product of sodium dichloroisocyanurate in urine by liquid chromatography mass spectrometry[外文期刊] 2007(1/2) 3.栾伟 查看详情 2008 4.GB/T 22288-2008 5.李锋格;姚伟琴;苏敏 查看详情 2009(02) 6.Yu C;Zhu L H;Xiao J Y Ultrasonic extraction and determination of cyanuric acid in pet food[外文期 刊] 2009(3) 7.侯升杰;王辉;丁明玉 查看详情 2009(08) 8.王强;冼燕萍;罗海英 查看详情 2009(06) 9.魏文彬;张长龙 查看详情 2009(03) 10.Wang Y Y;Chai W J;Gao M Z 查看详情 2009(03) 11.Dobson R L M;Motlagh S;Quijano M 查看详情 2008(01) 12.Turnipseed S;Casey C;Nochetto C 查看详情 2008 13.李锋格;姚伟琴;田延河 查看详情 2010(03) 14.Miao H;Fan S;Wu Y N 查看详情 2009 15.Brown C A;Jeong K S;Poppenga R H 查看详情 2007 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_sp201009008.aspx