人原发性肺癌癌基因
达研究 �
赵 建 升 孙 芝 琳 周 青华 伍伫
�华西医科大学生物化学教研室 , 成都 � ��。牡 � �华西医科大学附院胸外科教研室 , 成都�
关触询 人原发性肺疮 , 瘤基因 , 斑点杂交 , 基 因表达
分子生物学的新近发展揭示某些癌基因与人类肿
摘的发生 、发展 、分化密切相关� 目前认为 , 至少有两
大类癌基因 , 即 � �� 家族基因与 �二 家族基因在肺癌
钓病理发生中包重要作用 “ , , ’。 但是有关肺癌基因表
达的研究 , 国内迄今尚未见报道 �
本研究以 � �� 家族基因 �卜 � �� 、� 一� �� 及 � �
‘� ‘� 、 与肺癌关系密切的 � 卜 � � ‘基因及蛋白产物定
位于核内的 。一 �。 。 基因为探针 , 对 �呼例人原发性肺癌
及 � 例正常人肺组织的总 � � � 进行斑点杂交 分 析 ,
观察癌基因在转录表达水平的特点 , 为进一步研究肺
癌的发病机理提供依据 , 同时探讨其在临床诊断上的
应用前景 �
扫描结果计算出肺痛总 � � 人相对于正常人肺总 � � 人
表达增强的倍数�
用于提取 � � � 的试剂与器皿均经 。� � � � � �
及高压消毒处理 �
结 果
� � 总 � � � 的纯化与鉴定
用酸性盐酸肌一酚一氯仿 法 ‘� � � 法� 所 提 总
� � � 见表 �及图 � 。
结果表明所提总 � �人 纯度高 , � � � 无降解 , 将
总 � � � 分别溶于 。 � �� �� � 溶液及 � � �肠 � � � 处
理的水中 , 一 �� ℃贮存半年 , 总 � � � 是稳定的 �
农 � � � � � 法制备总 � � �
材 料 与 方 法
� � 正常肺组织及肺病组织标本
正常肺组织及肺癌组织标本由华西医科大学附一
「院胸外科提供 , 均为病理确诊 � 手术标本经液氮冷冻
后 , 置 一 �� ℃ 贮存 �
� � 撼基因探针及标记
� �一 � “, 及 “ 一�� �� 基因的重组质粒菌株由中日友
好医院范慕贞教授赠 , � 一 � �� 及 卜�“� 基因的 重 组
质粒菌株由美国� 。 , � 。爪大学 邱政夫教授赠 , � 一� ��
基因的重组质粒菌株由华西医科大学方谦逊教授赠 �
质粒 � � � 按清亮裂解法川制备 , 用 〔。一 , ’� � � � � � �北
京福瑞公司 , 一 � � � � � �� � � � �� , 按缺 口翻译法 , � ’标记
探针 �
� � 总 � � � 制备及斑点杂交分析
用酸性盐酸肌 一酚一氯仿法 「” ‘’制备总 � � � 将肺
组织在 �� “ �� � 盐酸呱溶液中制成匀浆 , 用 � � “�� � 醋
酸钠 ��� 的 将匀浆液调至酸性 , 再经酚 一氯仿抽提 ,
异丙醇沉淀 , 真空抽干后 , 溶于适量体积的 � � �� �� �
溶液或 � � � � � � � 处理的水中 , 采用紫外吸收法测定
� � 含量 � � � 人 样品经 � � 甲醛变性后 , 按梯度顺
序点于硝酶纤维素膜上 , �� ℃烘烤 �� , 预杂交及杂交
条件按 � �� �。
‘, ’� 将斑点杂交结果得到的放射
自显影胶片于日本 �卜� �� 薄层扫描仪上扫描 , 根据
吸吸光比值 ‘�� 通 � ,� � � � 二夕夕
均 提取 �� 例样品的统计结果 �
图 � 总 � � � 的玻脂摘凝胶电泳
�� � 人肺窟总 � � �
� � 酵 刁 �� � � , �一 � � 人肺癌总 � �人
�� � 人肺癌总 � � � 在 一 �� ℃ 贮存半年
� � 酵 母 � � � � , � � 总 � � � 溶于 � � �� � � � 中 , , �
总 � � � 溶于。 � �� � � � 处理的水中
� 国家“七五”攻关资助课题 ,
一 � , � ·
裹 � 人肺右盛基因的农达
基因表达�增强倍数�
� 一� � � � � � �
一 � � � � �� � � � � 一� � �
诊断理病号编品样
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腺癌
鳞癌
腺鳞癌
鳞癌
腺鳞癌
转移癌
鳞痛
鳞癌
腺癌
腺鳞癌
腺癌
鳞癌
鳞癌
腺癌
鳞癌
鳞癌
鳞癌
腺鳞癌
腺癌
肺癌
肺癌
鳞癌
腺癌
鳞庙
鳞癌
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�� 无表达增强 �
� � 未检测 �
�� � � � 斑点杂交结果
斑点杂交结果见表 � , 部分杂交图谱见图 �一� �
‘一也�� 基因的斑点杂交结果表明 � 在 �� 例原 发
性肺癌组织中� 例转移癌除外� , 有 �� 例�”肠 �表达
增强 ,其中有 � 例 �� � � � , 。一 � �� 基因有过强表达
�图 � �。 � 一 � �� 基因的表达增强占检测病例 的 �� �
‘图 � �� � 一� �� 基因表达增强的例数较少 , �� 例中
仅有 � 例 �� � � � 表达增强�图 � � � � �一 � � � 基因在 � �
困 � 人肺疙总 � � � 斑点杂交结果
探针为 � 一�� � , 0 为正常人肺 N H L , 弓, 8 , l 斗~ 17
2 0 ~ 2 1 , 2 3 ~ 2 5 为人肺癌 H L C
例中有 巧 例 (”肠)(图 5). 卜f。‘ 基因在检测的 l,
例中有 11 例(65% )表达增强 , 其中有 l例 〔H L cl 6)
有过强表达(图 6).
圈 2 人肺痛总 R N A 的斑点杂交结果
探针为 c一 m y c , o 为正常人肺 N H L , l一 7, 2 0 一25
为人肺痛 H L C
讨 论
实验结果发现 , 在 m yc 家族基因中 , 。一In yc 基因
表达增强较多 , 而 L 一 m yc 与 N 一二yc 基因表达增强较
少. 这一结果与 N au L.1等研究小细胞肺癌 m yc 基因
表达的结果相似.
最近的研究表明川 , 正常细胞发生癌变并非一种
. 473
‘搞基因起作用 , 可能涉及两种或多种癌基因的共同操
纵.与协同作用. 本实验仅观察 到有 咯例对一种癌基因
表达增强 , 有 斗例 卜tn yc 与 K i一 r 。 基因表达同时增
强 , 有 6例对三种届基表达同时增强 , 有 3 例 (H L C牛 ,
H L c 1 5
,
H L c Z I ) 其 c一 m y e 、 L 一 tn 了c 、 区i一 r a s 及 c一f o s
基因表达同时增强. 这一结果提示 , Ki 一r a s 与 。一 m yc
基因的协同作用 ,在肺庙的病理发生中有重要作用 .在
肺癌癌变中 , 不止一种庙基因发挥作用 , 可能是两种或
多种癌基因共同作用. 本实验还观察到有两例(H L C4
及H L cl 6 , 均为鳞癌)分别对 。 一 m yc 和 c一 f 。 ‘ 基因有
过强表达. 癌基因过强表达是否与其病理学特征有关
尚待进一步研究.另外 ,本实验还对 l例肺甲状腺转移
·疡(H LC 6)迸行了研究 , 结果发现癌基因有较高水平的
表达 , 这一现象提示癌基因与甲状腺癌有密切关系.
已经有许多事实表明L’“一 ” ‘ ,癌基因发挥作用最终
是通过其蛋白表达产物实现的. 目前的 研 究 认 为 ,
m
yc 相关蛋白 p62 在 细胞分裂过程中起重要作 用.r““ 基因表达产物 p21 在传递细胞生长刺激的信号中
起中枢作用. 因此本实验的研究结果提示 , 应 用 抗
p62m那 及抗 PZ lr。‘ 单克隆抗体进一步研究肺癌 免 疫
组化特性 , 并用这些抗体检查庙组织及患者体液 (血
被 、胸水等)中 p62m”及 PZ lr“ 蛋白的存在 , 具有重要
的临床意义和广阔的应用前景。
参 考 文 献
1 Taka.hi T , Y u i e h i o , Y o s h i t a k a S 口 al· C a ”c e r 灵亡‘
1 9名9 ; 4 9 : 2 68 3
2 B os J L . C a” c e r 左‘ , , 1 9 8 9 : 4 9 : 4 6 8 2
3 侯云德 等. 病毒基因工程原理与方法 . 北京 : 人民卫生
出版社 , 1 9 5 5 : 8 9
咚 R ig b y p W J , D i e e k m a n n M , R h o d e s C e ; a l
.
J M
e
l
B i
o
l
,
1 9 7
7
; 1 1 3
:
2 3
7
5 C
h
o
m
c z
v
n s
k i
p
,
S
a c e
h i N
. 才 作 a l夕lica l B ioc h e份15多r夕 19 8 7 ,
1 6 2
: 1 5 8
6 孙宁 , 孙芝琳 . 生物化学杂志 , 1 9 90 ; 6( 3 ) : 2 38
7 W h i
t e B A
,
B
a
n c
r
o
f
t
F
C
.
J
B i
o
l C h
‘m
.
1 9 8 2 ; 2 5 7 :
8 5 6 夕
8 N a u M M , L i t t l e C D , C a r n e y D N 亡t a l . N a 才u r e l 9 8 3 ;
3 0 6 : 1 9 4
9 W e in b e r g R A
.
c a 刀 c e r R 己‘, 1 9
8
9 ; 4 9
:
3 7 1 7
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1 9 8 3 ; 2 2 1
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9
8 犷;
4 1 : 66 ,
[本文于1990年9月2 5日收到, 1 9 9 1年3月2 5日修回1............L..国 .. ”. . ”口一‘ . . 亡一一 , ~ ~ 吧翻
-
‘ 刁一‘. 刀.. . . . .~ ~ .‘暇曰‘. 口. . .. ‘旧. . . . . . r . . .. . . . . . . . . ‘. .. 圈, ‘二. . . . . . . . . . .~ . .. . 曰. 串. . . . . . .
( 上接第 478 页)
裘 , 29 6 健康体检人 的血消 H D L 一 C / T e h 比值勺一叮一相当于 3om g/dL) ; 8川 (相当于 ;om g/dL ), 并使其
与
管同体积 , 再加入胆固醉试剂 , 。。冈 , 37 ℃ 水.裕 巧 m in 后 , 比色 、计算 ,其结果见表 2.H D L 一 c 的平均回收率为 101.3% , 说明本法的准
·确度很高.
(4) 实际应用价值 为了确定本法的实际应用价
仇 , 我们用本法对 296 名 25 岁至 60 岁的健康人作了
调查 ,测定对象是机关干部 、研究所工程技术人员及工
厂工人 ,其中男性 153 人 , 女性 143 人 , 空腹抽血 , 当日
;检查 , 其结果见表 3.
在我们侧定的结果中 , 男子组的 H D L 一 C 值略低
于女子组 , 经过统计学处理后均无显著性差 异 (p >
。· 0 , ) , 男女各年龄组之间均无显著性差异 , 与国内有
关文献的报道基本一致.
2 .讨论 用中生生化试剂技术开发公司研制的胆
固醇酶试剂及沉淀剂和测定血清 H D L 一 C 方法 , 并对
方法学进行了验证 , 其精密度和准确度均较满意 , 本法
快速简便 ,特异性强 , 适合常规检验.
参 考 文 献
李健斋 . 中华内科杂志 , 1 9 5 8 ; 1 ( l ) : 1 3
杨昌国. 中华医学检验杂志 , 1 9 7 9 ; 2 ( 2 ) : 8 5
尸.
子
. 略7 4