apoptosis细胞凋亡

null 细胞凋亡 Apoptosis 细胞凋亡 Apoptosis nullApoptosis- Cells die by murder or suicide by an active process of programmed cell death . Programmed cell death play a key role both in the maintenance of adult tissues and in embryonic development. In contrast to the accidental death of cells resulting from an acute injury, programmed cell death takes place by an active process and Genes responsible for both the regulation and execution of apoptosis are conserved from nematodes to humans.细胞凋亡 细胞凋亡 细胞凋亡（apoptosis）是Kerr于1972年首次提出的。 细胞凋亡或细胞程序化死亡（programmed cell death, PCD）不同于坏死（necrosis）。 “凋亡”一词来自希腊语，apo意为“分离”，ptosis指花瓣或树叶的脱落，“凋亡”是由这两个词组合而成，意指细胞凋亡的形态类似秋天花瓣或树叶的凋落一样。 null程序化死亡（programmed cell death, PCD）=细胞凋亡（广义） 细胞凋亡apoptosis（狭义）:形态学 胀亡 自噬 坏死（necrosis）二、研究简史二、研究简史半个世纪前:人们就观察到在人体的发生、生长、发育以及衰老过程中，一直伴随着组织细胞的生理自发退化死亡现象. 　　　1965年:发育生物学家Lockshin和Williams首先提出了PCD（程序化死亡）一词，用于描述蛾的发育过程，认为随着成年蛾的出现，其幼虫死亡是一种发育调节性死亡〈development-regulated death)。null1972年:Kerr等首次提出了细胞凋亡的概念，从形态学角度描述细胞的生理死亡，并认为这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本生物学现象，有重要生物学意义。 1977年:人们注意到在生理或病理性刺激条件下，淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。null1980年:Wyllie研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞凋亡变化，并建立了细胞凋亡的共同特征，包括核固缩和DNA降解成寡核苷酸片段等。 1989年: 0wen及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中，发现T细胞受体(TCR)与自身抗原相互作用与未成熟T细胞的PCD发生有关，并在体外证实剌激CD3分子可诱导未成熟T细胞PCD的发生。 null1991年:Ellis首先发现了线虫(C.elegans)体内Ced-3、4两个基因与PCD的发生密切相关，随后逐渐发现了多种参与PCD的正调节基因和负调节基因，前者包括Ced-2、p53、c‐myc、Fas、糖皮质激素受体及白细胞介素1β转化(ICE〉等基因，后者则有Ced-9、bcl-2等基因.细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征具有典型的特征，包括胞质浓缩、染色质凝集、染色体降解呈DNA ladder、细胞膜出芽形成凋亡小体（apoptosis bodies）。 体内被正常细胞或吞噬细胞清除，而不引发炎症。 (一)细胞凋亡与细胞坏死在形态学上的差别(一)细胞凋亡与细胞坏死在形态学上的差别null相差电镜下null透射电镜下透射电镜下null（二）细胞凋亡与细胞坏死在生物化学上的区别（二）细胞凋亡与细胞坏死在生物化学上的区别nullnull细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图 1．细胞色素c诱导0 h 2．细胞色素c诱导1 h 3．细胞色素c诱导2 h 4．细胞色素c诱导3 h 5．细胞色素c诱导4 h 6．阴性对照 7．Marker （ 自赵允、翟中和） null胞内Ca2+、Mg2+浓度明显增高，依赖Ca2+的核酸内切酶（Endonuclease）被激活，将DNA在核小体间切割，酶切后会形成带有粘性末端的、相差180——200bp的不同长度的片段，故电泳呈特征性的梯形改变(ladder patlern) 。 由于生化改变是从基因开始，从内到外，所以DNA的损伤发生在胞质、胞膜通透性改变之前即凋亡早期，而坏死由于损伤是从外到内，细胞器溶酶体等先溶解、破裂，释放的酶再把DNA随机降解成无数大小不一的片段，电泳呈涂沫状拖带，不能形成“梯子”nullnull细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病 细胞凋亡过度：爱滋病，心、脑缺血引起的损伤荡扩大，应激引起的淋巴细胞凋亡，阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD)，帕金森病等。 细胞凋亡不足：自身免疫病、肿瘤等。 细胞凋亡与药物研制开发及疾病的治疗细胞凋亡与药物研制开发及疾病的治疗基因治疗研究开发。 生物制剂制品研究开发。 利用细胞凋亡中细胞因子或细胞保护因子开发新药。 细胞凋亡研究中注重无机离子、无机化合物的研究可开发出新药。 参与细胞凋亡的受体的研究，开发受体激动性或拮抗性药物。 阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）AD是以遗忘为最早期症状、近记忆力丧失为最突出症状的常见大脑变性病。发生于60岁以前又称早老性痴呆,60岁以后发病者称老年性痴呆，两者临床表现和病理形态改变相同。 病理特点：病理特点： 广泛的大脑皮质萎缩，显微镜下可见皮质神经元脱失，伴有胶质细胞增生及皮质下继发性脱髓鞘。 本病病因尚不清楚，现代分子生物学和细胞生物学认为，本病的发生与神经第质的缺陷有关，主要是乙酰胆碱转移酶和乙酰胆碱合成酶的活性降低造成乙酰胆碱（Ach）显著低于正常，而这是由胆碱能传入神经元的渐进性凋亡所致。 1981,1982年Whitehouse 等对AD患者进行尸检后发现，AD患者的海马及基底神经核的胆碱能神经元丧失达30-50%，有时可达90%。 null胆碱能神经元广泛凋亡的假说不仅可解释AD发病机制，还有助于AD制定一个较合理的预防和治疗。如果这一假说正确，那么降低神经元凋亡率应是主要策略。 事实上在八十年代，针对AD药物治疗的主要依据是“胆碱能系统受损假说”，设计的药物如胆碱酯酶抑制剂毒蕈碱、胆碱能激动剂槟榔碱、氨甲酰胆碱等均疗效不大； E 乙酰辅酶A+胆碱→乙酰胆碱 → 乙酸 +胆碱糖皮质激素诱导胸腺细胞凋亡糖皮质激素诱导胸腺细胞凋亡 病理教研室董新刚null而凋亡的主要机制涉及到核酸内切酶的激活、断裂，核酸内切酶的激活需胞内游离Ca2+增加，这是细胞毒性机制导致细胞凋亡或坏死的共同最后通路，很多证据表明衰老和AD时胞内游离Ca2+均明显增加，75岁后胞内增加的Ca2+浓度水平足以激活易感个体的凋亡相关基因，可能导致细胞毒性蛋白即淀粉样蛋白的表达，使神经元凋亡。推想维持细胞固有游离Ca2+浓度的正常可降低神经元凋亡率，从而治疗AD。据此设计的Ca2+通道阻滞剂尼莫地平（nimodipine, NMD）等确实可延缓AD进行性的记忆受损，而无明显的副作用，NMD是目前治疗AD的主要药物。令人感兴趣的是Ca2+通道阻滞剂类药物还有可能作为AD的预防用药。确定细胞凋亡而不是坏死确定细胞凋亡而不是坏死通过如下方法： 1. 普通光镜、电镜观察 2.DAPI荧光染色 3.TUNEL原位杂交 4.Annexin V-GFP/PI标记 5.Sub-Gl流式细胞仪定量分析 6.DNA ladder (1) 经相差显微镜观察，细胞经·OH处理后，逐渐变圆，失去与周围细胞的联系，而最终从瓶壁脱落下来；而对照组显示正常的细胞形态。(1) 经相差显微镜观察，细胞经·OH处理后，逐渐变圆，失去与周围细胞的联系，而最终从瓶壁脱落下来；而对照组显示正常的细胞形态。(2) DAPI荧光染色显示，细胞核皱缩，染色质凝聚碎裂，形成凋亡小体；对照细胞核呈现均匀，明亮的荧光。(2) DAPI荧光染色显示，细胞核皱缩，染色质凝聚碎裂，形成凋亡小体；对照细胞核呈现均匀，明亮的荧光。(3) 用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP切口末端标记（TUNEL）原位杂交能够检测到DNA的片段化。(3) 用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP切口末端标记（TUNEL）原位杂交能够检测到DNA的片段化。null(4)凋亡早期细胞，细胞膜由于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻被Annexin V-GFP标记在荧光显微镜下观察呈现绿色荧光；凋亡晚期细胞呈现红色荧 光，是由于细胞膜与核膜破损，PI进入核区与 DNA结合。而对照组正常活细胞不显示任何荧光。 (4)凋亡早期细胞，细胞膜由于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻被Annexin V-GFP标记在荧光显微镜下观察呈现绿色荧光；凋亡晚期细胞呈现红色荧 光，是由于细胞膜与核膜破损，PI进入核区与 DNA结合。而对照组正常活细胞不显示任何荧光。 Annexin V标记 荧光显微镜 观察发现: 经·OH处理的凋亡细胞显示绿色和红色荧光，而胶原组的绿色和红色荧光明显减弱，对照组无荧光。 Annexin V标记 荧光显微镜 观察发现: 经·OH处理的凋亡细胞显示绿色和红色荧光，而胶原组的绿色和红色荧光明显减弱，对照组无荧光。 共聚焦激光扫描显微镜观察：Δψm持续下降的全过程，随着·OH处理时间的增加，线粒体跨膜电位越来越低。共聚焦激光扫描显微镜观察：Δψm持续下降的全过程，随着·OH处理时间的增加，线粒体跨膜电位越来越低。·OH诱导线粒体跨膜电位降低－时间依赖性 ·OH诱导线粒体跨膜电位降低－时间依赖性 ·OH诱导线粒体跨膜电位降低－浓度依赖性 ·OH诱导线粒体跨膜电位降低－浓度依赖性 随着·OH浓度的增加，线粒体跨膜电位低水平细胞数逐步增加，而跨膜电位高水平细胞数逐步减少。 用Jc-1取代Rh123 ，凋亡细胞Jc-1从红变绿用Jc-1取代Rh123 ，凋亡细胞Jc-1从红变绿Jc-1和DAPI共染色共聚焦激光扫描显微镜观察Jc-1和DAPI共染色共聚焦激光扫描显微镜观察(5) 细胞凋亡时DNA片段化可能导致DNA含量的大量丢失，当细胞用流式细胞仪分析时产生一个明显的Sub-Gl峰。流式细胞仪定量分析显示实验组Sub-G1细胞数明显增加(5) 细胞凋亡时DNA片段化可能导致DNA含量的大量丢失，当细胞用流式细胞仪分析时产生一个明显的Sub-Gl峰。流式细胞仪定量分析显示实验组Sub-G1细胞数明显增加null(6) DNA ladder(6) Fig.2-6显示，细胞经不同浓度·OH处理24h后，DNA断裂形成明显的DNA ladder，浓度越大，DNA断裂越明显；该结果与Fig.2-5显示的结果相一致，随着·OH浓度加大，Sub-G1细胞数明显增加。，·OH诱导HeLa细胞凋亡具有浓度依赖性。细胞凋亡的一般过程 细胞凋亡的一般过程 null细胞凋亡基本执行程序：细胞凋亡基本执行程序：诱导期：凋亡的信号转导 诱导凋亡因素+受体→→→激活凋亡蛋白酶系统caspase 效应期： 调控的终末信号转导 半胱氨酸蛋白酶caspase的逐级活化 执行期：细胞结构改变 多种酶活化，死亡底物death substrate降解。凋亡细胞出现特异的形态变化如DNA片段化、 核致密 、细胞皱缩 nullGenetic studies in C.elegans efined an evolutionarily conserved cell-death pathway with three major components. Regulators(or antiapoptotic proteins):Ced-9 in C.elegans and Bcl-2 in vertebrate脊椎, they are structurally and functionally homologous Effectors are cysteine proteases半胱氨酸 蛋白酶, called caspases generally, or ICE (Ced-3)in C.elegans. Pro-apoptotic proteins(adapter适配器), Apaf1 or Ced-4, promote caspases activation. caspases凋亡发展的中心问题:凋亡发展的中心问题:1．线粒体：线粒体的早期改变为线粒体膜通透性变化和线粒体转膜电位（MTP）降低，膜间孔(PT)开放，离子通过，内膜H+梯度破坏，基质渗透压升高，线粒体体积扩大，外膜破裂。 2.caspases蛋白酶：凋亡是一种进化过程保留下来的细胞自杀，发生的机制是蛋白溶解系统活化，涉及一组半胱氨酸蛋白酶家族Caspases ，也称为胱天蛋白酶。 caspase胱天蛋白酶caspase胱天蛋白酶凋亡蛋白酶caspase ，其所有成员的活性中心都含半胱氨酸（Cys ），特异性水解底物蛋白中特定位点天冬氨酸（Asp）的羧基形成的肽键nullcaspase的级联活化，特别是caspase-3的激活是凋亡程序的关键步骤。 虽然诱导细胞凋亡的信号各异，但凋亡的生物化学特征及死亡通路却高度守保守和恒定细胞凋亡的途径细胞凋亡的途径依赖caspase的途径： 1.死亡受体途径：由细胞表面受体启动，直接激活下游caspase，这些受体属于肿瘤坏死因子/神经生长因子（TNF/NGF）受体超家族。 2.线粒体途径：通过线粒体释放Cyt C，间接激活下游caspase 不依赖caspase的途径null死亡受体途径死亡受体途径null线粒体途径线粒体途径线粒体调控细胞凋亡线粒体调控细胞凋亡在脊椎动物细胞的凋亡过程中，线粒体被认为是处于凋亡调控的中心位置。 Cyt C从线粒体释放与胞浆中Apaf-1结合活化caspase-9，进而激活caspase-3，导致细胞凋亡。 Bcl-2通过阻止Cyt C从线粒体的释放抑制凋亡。而Bax与线粒体上的膜通道结合促使Cyt C的释放促进凋亡。 Caspase 如何杀死细胞？Caspase 如何杀死细胞？使抑制凋亡的因子失活，如CAD/iCAD 破坏细胞结构，如Lamin A 将调节区与催化区分离，使蛋白失活，如Gelsolin细胞凋亡途径与调控细胞凋亡途径与调控死亡底物 调亡特征出现细胞调亡的信号传导模式null调控细胞凋亡的相关基因 调控细胞凋亡的相关基因 目前发现的细胞凋亡有关基因有三类:促细胞凋亡基因、抑制细胞凋亡基因和在细胞凋亡过程中协助的基因。 Bcl-2家族 p53 fas/fasL C-fos和C-jun C-myc Bcl-2家族:包含两类功能相反的基因Bcl-2家族:包含两类功能相反的基因 抑制细胞凋亡的基因Bcl-2、Bcl-XL 等 促进细胞凋亡的基因Bax、Bak、Bad、 Bik和 Bcl-Xs等 bcl-2基因（P262）bcl-2基因（P262）bcl-2激活和表达是调控细胞调亡的关键因素，对细胞增殖不影响。 bcl-2蛋白是一种高度保守的膜蛋白，分布于线粒体膜、核膜、内质网上，功能与线粒体的氧化磷酸化、核的转运、Ca2+的分布有关，通过调节这些过程阻断细胞凋亡而且是阻断凋亡的最后共同通道。 与bcl-2同源的另一家族蛋白Bax与bcl-2形成异二聚体，使bcl-2灭活，决定活性bcl-2蛋白分子数目。 bcl-2的转基因动物脾细胞与正常动物比生存优势提高了500倍，导入bcl-2基因并使之过表达可造成宿主动物患淋巴瘤。nullp53p53调亡的启动和传导还受多基因的调控基因。野生型p53表达使细胞G1期阻滞，诱导调亡。突变型p53作用相反——抑制调亡。 缺失p53的小鼠品系所有纯合子都自发产生肿瘤； 用转基因及表达技术重建p53的表达和生物学活性时，自发性的细胞凋亡情况与野生型小鼠无异。 p53 p53nullp53p53p53与细胞周期和凋亡调控p53与细胞周期和凋亡调控高水平活性p53至少有两个效应: 【1】一是诱导p21表达（ATM-Chk2-p21途径），p21是广谱CDK抑制因子，CDK不能使Rb磷酸化而释放E2F,使细胞发生G1期阻滞。p53还可诱导CyclinB1、GADD45等基因表达，使细胞阻滞于G2/M期null【2】二是通过诱导bax、IGF-BP3、Fas/CD95 和抑制bc12、IGF-1R、IGFII表达，促使线粒体中细胞色素C的释放，激活Caspase9、8、3等使细胞凋亡。 p53-----Gate keeperp53-----Gate keeper 促进 P21表达------抑制CDK-Cyclin对RB磷酸化 GADD45表达、MDM2激活------促损伤修复 Bax表达------诱导凋亡 抑制 bcl-2表达------ 诱导凋亡Fas/FasLFas/FasL人Fas蛋白即APO-1抗原分子,是分子量为50KD的跨膜糖蛋白，是神经生长因子（NGF）及肿瘤坏死因子(TNF)受体的超家族成员，它们的一级结构有较高同源性。FasL为Fas的天然配体。表达Fas的细胞才能发生PCD。 肿瘤细胞的Fas反击 活化的淋巴细胞表达Fas，也表达 FasL; 肿瘤低 表达 Fas， 表达 FasL 并旁分泌FasL, 与淋巴细胞结合， 淋巴细胞发生PCD，使机体发生免疫逃逸