高致病性禽流感防治技术规范.-.2007716151735

一、试剂盒组成、储存、稳定性 六、疑难解答 出现的问题 可能的原因 建议解决方法 RNA产量低 样品裂解不彻底。 液氮研磨的时候尽量研磨完全，加入裂解液后剧烈震荡或者用枪头吹打帮助裂解。 使用的样品或者裂解物在-20℃或者-70℃存放太久。 存放时间过长可能降低RNA产量，应尽快的处理样品或者裂解物。 本身含RNA少。 不同类型的土壤含有不同量的RNA，对于含量少的样本应该适当提高起始处理量。 电泳或回收过程中降解 电泳槽处理；操作过程尽量避免外源RNase降解。 OD260/OD280吸光度比值<1.6 分光光度计检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，OD280值会较高，造成比值偏低。 检测时用TE稀释样品。 一、试剂盒组成、储存、稳定性 试剂盒组成 保存 50次（RP8001） 100次（RP8002） 裂解液SLS 室温 55ml 110ml 溶液SS1 室温 6ml 12ml 溶液SS2 室温 16ml 32ml 溶液SS3 室温 16ml 32ml 70%乙醇 室温 22.5ml RNase-free H2O 45ml RNase-free H2O 第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free H2O 室温 5 ml 10ml 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 二、原理简介 独特裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，通过独特的沉淀剂去除其它杂质，酚氯仿抽提去除杂质及蛋白，最终RNA被异丙醇沉淀下来 三、试剂盒特点 1．​ 本试剂盒操作简单，时间短，极大的避免RNA的降解。 2．​ 兼容性强，适用于各种不同的土壤样本。 3．​ 不需要特殊的震荡器，方便客户的使用。 4．​ 本试剂盒操作过程中已经尽量去除DNA，一般无需再用DNA酶消化 四、注意事项（实验前必须首先阅读这部分！） 1．​ 在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的，可以选用RNase喷雾清除剂去除RNase（RP6001）。在实际的操作中应遵循以下： 1)​ 全程佩戴手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。 2)​ 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。 3)​  在裂解液中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。 2．​ 有些离心步骤需在4℃完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 3．​ 试剂含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。 4．​ 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。 5．​ 需自备水饱和酚(酸性酚)﹕氯仿﹕异戊醇 （25:24:1，pH6.5-8.0）、异丙醇、无水乙醇、2ml RNase-free离心管。 五、操作步骤 1.​ 取0.5g 土壤样本，转入已预先加入1ml裂解液SLS的2ml RNase-free的离心管中，充分涡旋振荡混匀。 2.​ 加入100μl 溶液SS1，涡旋振荡混匀。 3.​ 加入300μl 溶液SS2，涡旋振荡(至少5min)混匀。于4℃ 10,000 rpm离心10分钟取上清转移至新管。 4.​ 加入1ml酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，pH6.5-8.0）。涡旋振荡(至少5min)混匀。 5.​ 于4℃ 10,000 rpm 离心10分钟。 6.​ 取上清（约1ml）至一RNase-free 的2ml 离心管中，加人300μl溶液SS3，振荡混匀，4℃放置10分钟。 7.​ 于4℃ 10,000 rpm 离心10分钟。 8.​ 取上清，加入等体积异丙醇（约1ml），上下颠倒混匀，-20℃放置15-30分钟。 9.​ 于4℃离心10分钟，弃上清。 10.​ 加入1ml 70%乙醇，颠倒几次。于4℃ 10,000 rpm 离心5分钟，弃上清，小心不要倒出沉淀。 11.​ 室温晾干，溶于10-30μl RNase-free H2O中。