第3章 蛋白质化学

null蛋白质化学蛋白质化学2.1 氨基酸 2.2 肽 2.3 蛋白质的分子结构 2.4 蛋白质结构与功能的关系 2.5 蛋白质的重要性质 2.6 蛋白质的分类 2.7 蛋白质的分离提纯及应用null蛋白质是由20种L-α-氨基酸缩合而成的长链分子(多肽链 polypeptide chain)。 蛋白质作为生物体的最重要的组分，是生活细胞中含量最丰富、功能最复杂的生物大分子（分子量为6000~1000000D或更大）。几乎参与所有的生命活动和生命过程。因此研究蛋白质的结构与功能是生命科学最基本的课题。 大肠杆菌中约有3000种蛋白质，真核细胞中约有35000种蛋白质。nullFireflies emit light catalyzed by luciferase with ATPnullErythrocytes contain a large amount of hemoglobins, the oxygen-transporting protein.nullThe protein keratin is the chief structural components of hair, scales, horn, wool, nails and feathers.null ①催化作用 ③代谢调节 ④细胞运动 ⑤保护作用 ⑥物质运输 ⑦细胞结构组成 胞通讯 ⑧参与遗传 ⑨蛋白贮藏 ⑩其他 淀粉酶 溶菌酶 DNA聚合酶 胶原蛋白 膜蛋白 伸展蛋白 胰岛素 生长素 促甲状腺激素肌动蛋白 鞭毛 纤毛蛋白抗体 补体 干扰素 血红蛋白 脂蛋白 细胞色素蛋白受体蛋白 味觉蛋白 细胞表面抗原 转录因子 阻遏蛋白 细胞周期蛋白酪蛋白 卵清蛋白 麦醇溶蛋白毒蛋白 凝集素 金属蛋白蛋白质的功能null组成蛋白质的元素 组成蛋白质的元素有：C、H、O、N和S，这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： C：50% H：7% O：23% N：16 % S：0~3% 其它(P、Mo、Fe等) 微量元素。 平均含N量：16％ 平均残基Mw: 110 null2.1.1 蛋白质氨基酸结构及分类2.1.1.1 氨基酸结构特点 ①组成蛋白质的20种氨基酸（脯氨酸除外）均为-AA。 ②除Gly外，其它Aa的-碳原子均为不对称碳原子，因而均有两种不 同的空间构型。 20种AA在结构上的差异取决于侧链基团R的不同。nullnull②除Gly外，其它AA的-碳原子均为不对称碳原子，因而均有两种不同的空间构型：L-型（左）和D-型（右），二者互为对映体。L—丙氨酸 D—丙氨酸 D—甘油醛nullIn protein chemistry, we use Greek letter nomenclature.nullnull2.1.1.2 氨基酸的种类和结构 按R基的极性分 ⑴非极性AA（8种）:Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Pro、Trp; ⑵极性AA(12种)： ①R-基不带电荷的AA（中性AA）：Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr ②R-基带正电荷的AA（碱性AA）：Lys、Arg、His ③R-基带负电荷的AA（酸性AA）：Glu, Asp nullGly, G Ala, A Val, V Leu, L Met, M Ile, InullPhe, F; Tyr, Y; Trp, WnullSer, S Thr, T Cys, C Pro, P Asn, N Gln, QnullLys, K; Arg, R; His, HnullAsp, D; Glu, E2.1.2 氨基酸的理化性质2.1.2 氨基酸的理化性质2.1.2.1 氨基酸的两性解离与等电点氨基酸的酸碱滴定氨基酸的酸碱滴定氨基酸的酸碱滴定null2.1.2.2 氨基酸的化学性质 1、两性解离和等电点 ⑴AA的两性解离酸性溶液中的AA 水溶液中的AA 碱性溶液中有AA （阳离子） （兼性离子） （阴离子）氨基酸的两性解离性质及等电点 氨基酸的两性解离性质及等电点 pH = pI 净电荷=0 pH< pI 净电荷为正pH > pI 净电荷为负NH2R(pK´2) 当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点(isoelectric point，pI)。null等电点（isoelectric point) 在一定pH值时，Aa以兼性离子存在，在电场中不会向正、负极移动，此时的pH值称氨基酸的等电点（pI）。 pI= 1/2 (pK1’ +pK2’) 酸性Aa pI= 1/2(pK1’ +pKR’) 碱性Aa pI= 1/2(pK2’ +pKR’)nullK1’ 和 K2’ 分别代表-C上的-COOH和-NH3+的表观解离常数，如果侧链R基上有可解离的基团，用K R’ 表示其表观解离常数。 表观解离常数可用测定滴定曲线方法求得。null2.1.2.2、光吸收 组成蛋白质的20种Aa均不吸收可见光，在近紫外光区（220nm~300nm）Tyr、Trp、Phe有吸收光的能力，其吸收峰和摩尔消光系数为： Tyr max=278nm Trp max=279nm Phe max=259nm 一般蛋白质的最大吸收在280nm波长处，可用分光光度法测量蛋白质含量。null2、氨基酸的重要化学反应 ①、茚三酮反应 氨基酸脱羧脱氨被氧化，水合茚三酮被还原，氧化型和还原型的水合茚三酮与 氨反应生成二酮茚-二酮茚胺的取代盐等蓝紫色 化合物。 脯氨酸(Pro)或羟脯氨酸(Hyp)与茚三酮反应，生成黄色化合物。常用于AA的定性和定量。null水合茚三酮 还原型水合茚三酮蓝紫色物质null②Sanger反应 在弱碱溶液中AA与2,4-二硝基氟苯（FDNB）反应，生成黄色的二硝基苯氨基酸（DNP-AA），Sanger首先用此反应鉴定多肽链或蛋白质的NH2末端氨基酸。null③ Edman反应 在弱碱条件下AA与异硫氰酸苯酯（PITC）反应生成苯乙内酰硫脲衍生物，生成的衍生物可通过层析法分离鉴定，Edman首先用此反应鉴定多肽的N-端AA。异硫氰酸苯酯(PITC)苯氨基硫甲酰衍生物 苯乙内酰硫脲衍生物 （PTC-氨基酸） （PTH-氨基酸）null2.2 肽(peptide) 2.2.1 肽和肽链的结构即命名 氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水形成肽。肽键是蛋白质分子中氨基酸连接的 基本方式。肽键相连构成了蛋白质的主链。null2.2 肽(peptide) 2.2.1 肽和肽链的结构及命名 氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水形成肽。肽键是蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式。肽键相连构成了蛋白质的主链。肽键null⑴肽 氨基酸间通过肽键联结起来的化合物称为肽。两个 氨基酸形成的肽叫二肽，三个氨基酸形成的肽叫 三肽……，十个氨基酸形成的肽叫十肽，一般将 十肽以下称为寡肽(oligopeptide)，以上者称为 多肽(polypeptide)或称多肽链。 ⑵氨基酸残基(amino acid residues ) 肽链中的氨基酸在参加肽键形成时失去了1分子水，已经不是原来完整的分子，称为氨基酸残基。null⑶命名及书写方式 一条肽链通常含有一个游离的-氨基端(N-末端)和 一个游离的-羧基端(C-末端)。 规定肽链的氨基酸排列顺序从其N-末端开始，到C-末端终止。常把N-末端氨基酸残基放在左边，C-末端氨基酸残基放在右边。 小分子肽一般按其氨基酸残基排列顺序命名。null 丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸null⑷二硫键 连接氨基酸残基的共价键除肽键外，两个Cys残基的侧链之间可形成二硫键(disulfide bond)，即胱氨酸残基中的二硫键。它可使两条单独的肽链共价交联起来(链间二硫键)，或使一条链的某一部分形成环(链内二硫键)。 null氧化型 GSSG还原型 GSHnull2.2.2 重要的天然活性肽 生物体内存在很多游离的活性肽（active peptide），它们具有特殊的生物学功能。 如：催产素、加压素、舒缓激肽、生长激素释放因子、谷胱甘肽等。动植物细胞中的还原型谷胱甘肽，可作为某些氧化还原酶的辅酶，在细胞中作为-SH缓冲剂，维持细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原态，并防止过氧化物累积。null Tyr-Gly-Gly-Phe-Met 酪氨酰甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰蛋氨酸 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu 酪氨酰甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酸 脑啡肽（5肽），近年来引起人们的关注，它们在中枢神经中形成，具有镇痛作用。是体内产生的一类鸦片,但不上瘾。 后者有中科院上海生化所，1982年5月利用蛋白质技术合成。 null催产素：8肽，能使多种平滑肌收缩，催产催乳； 参与记忆。加压素：8肽，可使小动脉收缩，增高血压，减少排尿； 促进遗忘。短杆菌肽S短杆菌肽S某些抗生素也是肽或肽衍生物，如：短杆菌肽S （环10肽），放线菌素D和多粘菌素E等。null α-鹅膏蕈碱：双环8肽，剧毒。 真核RNA聚合酶II高度敏感，RNA聚合酶III 中度 敏感，RNA聚合酶I不敏感，真核生物转录抑制剂。 但不影响原核生物RNA合成。 功能性活性肽： 功能性食品 玉米肽（玉米降血压肽）， 大豆肽，乳肽 调节人体代谢，促进免疫，抗菌、降血压，促消化。 null2.3 蛋白质的分子结构 蛋白质具有三维空间结构，执行复杂的生物学功能，结构与功能之间有密切关系。 null为了研究方便，将蛋白质的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构4个层次，同时在二、三级结构间又划分出超二级结构和结构域。null2.3.1 蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构是指蛋白质中氨基酸的排列顺序。null1953年英国Sanger等人，完成了牛胰岛素(Isulin)一级结构测定工作，分子量为5700D，有A链(21AA)和B链(30AA)两条肽链，两个链间二硫键和一个链内二硫键(A链)。null1960年Stanford Moore等完成了牛胰核糖核酸酶(RNase)的分析， RNase由一条含124个氨基酸残基的多肽链组成，分子内含有4个链内二硫键，分子量为12600。它是水解核糖核酸磷酸二酯键的酶。nullnull 1967年Edman等发明的氨基酸序列分析仪 1973年Moor等制造的氨基酸自动分析仪极大地推动了氨基酸序列测定的进度。 目前已对上千种蛋白质的一级结构进行了测定。null2.3.2蛋白质的构象和维持构象的作用力 蛋白质的构象(conformation)：蛋白质分子是由氨基酸首尾相连而成的共价多肽链，每一种蛋白质都有自己特有的构象，而不是一条走向随机的松散链，这样才能保证其特有的性质和功能。null蛋白质天然构象主要是由氢键、离子键、疏水作用、范德华力等这些弱的作用力维持的，二硫键、酯键和配位键也参与蛋白质构象的维持。 氢键：多肽链中电负性很强的N原子或O原子与N-H或O-H的H原子之间可形成氢键。 盐键(离子键)：蛋白质分子中的某些氨基酸在生理pH条件下，其侧链是带电荷基团，它们之间可以形成离子键。null疏水作用：介质水分子对疏水基团的排斥作用，疏水作用在维持蛋白质的三级结构的稳定性和四级结构的形成中占有重要作用。 范德华力：范得华力虽然很弱，但在蛋白质分子中它的数量较大，且具有加和性，因此也是形成和稳定蛋白质构象的一种作用力。 配位键：两个原子之间由单方面提供共用电子对形成的共价键。如Fe2+、Cu2+、Zn2+等金属离子以配位键与蛋白质连接，参与蛋白质高级结构的形成与维持。nulla.盐键、b.f.氢键、c.疏水作用 d.范得华力、e.二硫键、g.酯键null2.3.3 蛋白质的二级结构(secondary structure) 多肽链(polypeptide chain) 借助氢键盘旋折叠而形成的局部空间结构.主要有-螺旋结构,折叠结构, 转角,无规则卷曲.null2.3.2.1 多肽链折叠的空间限制 ⑴肽平面(peptide plane)是组成多肽链的基本单位。多肽链是很多的肽平面通过碳原子相连而成的。 1 肽键的键长在C—N与C=N之间，具有部分双键性质。不能自由旋转。 2 肽键的四个原子和与之相连的两个碳原子(C)都处在同一个刚性平面。且通常呈反式构型。null参与肽键形成的2个原子以及另外4个取代成员：羰基氧原子、酰胺氢原子、以及2个相邻的-碳原子构成了一个肽单位（peptide group）（图2.2b）。null肽链主链上只有C连接的两个键(C–N、C–C)是单键，它们可以旋转，绕(C–N)键旋转的角度称角，绕(C–C )键旋转的角度称ψ角，这两个旋转角度称二面角(dihedral angle) 。可表示出相邻的肽平面的相对位置。 ψ=±180º ， =±180ºnullnull实际上肽链在构象上受到很大的限制 一个蛋白质的构象取决于肽单位绕N-C键和C-N键的旋转，这些键连接着多肽链中的刚性的肽单位。旋转本身受到肽链的主链和相邻残基的侧链原子之间的立体干扰的限制. null图2.5a表示的是肽链中的肽单位处于一种伸展状态；图2.5b表示的是肽单位处于一种不稳定构象。 null当C的一对二面角=180º、ψ=180º时，的两个相邻肽平面呈充分伸展的构象。二者均为0º的构象实际上不存在。null2.3.2.2 二级结构的基本类型 为了使暴露在多水介质中的疏水基团降低到最小程度，同时保持多肽链与周围水分子之间形成的氢键相互作用的有利能量状态，多肽链自发折叠形成由氢键维系的有规则的重复构象，从而形成蛋白质的二级结构。null⑴-螺旋结构（-helix） 1951年Pauling和Corey对α-角蛋白(α-keratin)进行X线衍射分析，从衍射图中看到有0.5～0.54nm的重复单位，故推测蛋白质分子中有重复性结构，认为这种重复性结构为α-螺旋。 天然蛋白质绝大多数为右手螺旋。 nullα-螺旋（可重复性结构）特点： ①多个肽键平面通过α-碳原子旋转，相互紧密盘曲成规则的周期性构象，即右手螺旋或左手螺旋。 ②主链呈螺旋上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm，每个Aa残基沿轴上升0.15nm。null③N-末端出发，氢键是由每个肽基的C＝O与前面第3个肽基的N-H之间形成。氢键的取向与中心轴平行。氢键是稳定α－螺旋的主要键。α -螺旋也叫3.613-螺旋nullnull④- 螺旋中氨基酸侧链R分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响α-螺旋的形成。 酸性或碱性氨基酸集中的区域，由于同电荷相斥，不利于α-螺旋形成；较大的R(如苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸)集中的区域，也妨碍α-螺旋形成；脯氨酸因其α-碳原子位于五元环上，不易扭转，加之它是亚氨基酸，不易形成氢键，故不易形成上述α-螺旋；甘氨酸的R基为H，空间占位很小，也会影响该处螺旋的稳定。nullnullnull⑵ 折叠结构（ pleated） Pauling等人曾对β-角蛋白进行X线衍射分析，发现具有0.7nm的重复单位。 如将毛发α-角蛋白在湿热条件下拉伸，可拉长到原长二倍，这种α-螺旋的X线衍射图可改变为与β-角蛋白类似的衍射图。说明β-角蛋白中的结构和α-螺旋拉长伸展后结构相同。 null折叠也称β-片层（pleated sheet） conformation)是由两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向通过氢键连接在一起，相邻两肽链以相同或相反方向平行排列成片状。nullβ -片层结构特点： ①肽链处于相当伸展的结构，肽链平面之间折叠成锯齿状，相邻肽键平面间呈110°角。每个Aa残基伸展的长度为0.35，Aa残基的R侧链伸出在锯齿的上方或下方。 ②依靠两条肽链或一条肽链内的两段肽链间的C=O与另一条的-NH基之间形成氢键，使构象稳定。null③两段肽链可以是平行的或是反平行的。 ④平行的β-片层结构中，两个残基的间距为0.65nm；反平行的β-片层结构，则间距为0.7nm。nullnullnull 蚕丝的主要成分是丝心蛋白，而丝心蛋白的主要二级结构是-折叠。Pauling和Corey正是依据丝心蛋白的X-射线衍射图提出了-折叠结构。丝心蛋白含有的多肽链都是反平行排列的-折叠结构。null⑶  转角（非重复结构）（ turn） 也称弯曲(bend)、回折(reverse turn)或发夹结构(hairpin structure)，是指肽链出现的180º回折，由弯曲处的第一个Aa残基的-C=O与第四个Aa残基的-NH之间形成氢键(41氢键)。产生一种不很稳定的环形结构。null⑷无规卷曲 没有确定规律性的部分肽链构象，肽链中肽键平面不规则排列，属于松散的无规卷曲(random coil)。null2.3.4 蛋白质的三级结构(tertiary structure) 2.3.4.1 超二级结构和结构域 超二级结构和结构域都是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次。 ⑴超二级结构(super-secondary structure) 超二级结构是多肽链内顺序上相互邻近的若干二级结构单元常在空间折叠中靠近，相互作用形成规则的结构组合体(combination) ，充当三级结构的构件。null己知的超二级结构有3种基本组合形式：α螺旋组合(αα)；β折叠组合(βββ)和α螺旋β折叠组合(βαβ) ，其中βαβ组合最常见。它们可直接作为三级结构的“建筑块”或结构域的组成单位，是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次。null 由二股或三股右手-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋(superhelix)，存在于-角蛋白、肌球蛋白和纤维蛋白中。  由两段或三段平行折叠链（单股链）和一段连结链组成，连结链为-螺旋或无规则卷曲。最常见的 组合是由三段平行式的折叠链和二段-螺旋链构成，称为Rossmann折叠(Rossmann fold)。 是由几段平行的折叠链连结而成，有曲折和回形拓扑结构两种类型。 nullnull⑵结构域(domain) 结构域是存在于球状蛋白质分子中的两个或多个相对独立的，在空间上能辨认的三维实体，充当三级结构的构件，其间由单肽链相连。 一个典型的结构域都具有一种特殊的功能，例如可以结合小分子等。每个结构域含有1～3个配体的结合部位。 常见的是一种/式的折叠桶，它是由重复的单位组成的，折叠桶的核心通常都是疏水结合部位或反应部位。nullnull2.3.4.2 蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构是整条多肽链在各种二级结构的基础上，通过侧链基团的相互作用，借助次级键维系，进一步盘绕折叠形成具有一定规律的三维空间结构。null稳定蛋白质三级结构的主要是次级键，包括：氢键、疏水键、盐键以及范德华力等。 这些次级键可存在于一级结构序号相隔很远的氨基酸残基的R基团之间，因此蛋白质的三级结构主要指氨基酸残基的侧链间的结合。因此，三级结构是由多肽链的Aa顺序决定的。nullnull具备三级结构的蛋白质有细长型的纤维状蛋白质(fibrous protein)，如丝心蛋白；基本上呈球形的球状蛋白质(globular protein)，如血浆清蛋白、球蛋白、肌红蛋白。 球状蛋白的疏水基多聚集在分子的内部，而亲水基则多分布在分子表面，因而球状蛋白质是亲水的，更重要的是，多肽链经过如此盘曲后，可形成某些发挥生物学功能的特定区域，例如酶的活性中心等。null肌红蛋白和丙糖磷酸异构酶的三级结构nullnull2.3.5 蛋白质的四级结构(quaternary structure )具有三级结构的几条多肽链通过次级键相互组合而形成的特定构象称为蛋白质的四级结构。四级结构的概念只适用于具有多个亚基的蛋白质，所以四级结构指的是亚基的组织。 null亚基(subunit、单体)：四级结构的蛋白质中的每一个具有独立三级结构的多肽链称为亚基(subunit)或亚单位、单体(monomer)。 四级结构实际上是指亚基的立体排布、相互作用及接触部位的布局。亚基之间不含共价键，亚基间次级键的结合比二、三级结构疏松，因此在一定的条件下，四级结构的蛋白质可分离为其组成的亚基，而亚基本身构象仍可不变。 亚基单独存在时无生物活性，只有聚合成特定的四级结构才具有完整的生物活性。nullnullnull球状蛋白质三维结构的形成：多肽链的主链首先折叠成一系列二级结构，相邻的构象单元随即组合成规则的超二级结构，若干超二级结构进一步盘旋产生结构域，两个或多个结构域形成具有独立三级结构的亚基，若干亚基组装成具有特定四级结构的寡聚体。nullnullnull2.5 蛋白质结构与功能的关系 蛋白质的顺序异构现象是蛋白质生物功能多样性和种属特异性的结构基础，如一个由20种氨基酸组成的20肽，有2×1018种顺序异构体。 2.5.1 蛋白质一级结构与生物功能的关系 蛋白质一级结构是空间结构的基础，特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链R基团形成的次级键来维持，蛋白质的多肽链在体内被合成后，即可根据一级结构的特点自然折叠和盘曲，形成一定的空间构象。 null因此，蛋白质的一级结构决定了它的二级、三级结构，即由一级结构可以自动地发展到二、三级结构。 null2.5.1.1 一级结构的种属差异与分子进化 同源蛋白质(homologous protein)的种属差异与生物进化 同源蛋白质是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质(如血红蛋白)。 同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有的种属是相同的，称不变残基(invariant residue)；而其它位置的氨基酸对不同的种属有相当大的变化，称可变残基(variable residue)；同源蛋白质的氨基酸顺序中这样的相似性称为顺序同源(sequence homology)。null不同种属来源的细胞色素c (cytochrome c)中，可以变换的氨基酸残基数目与这些种属在系统发生上的位置有密切关系，即在进化位置上相距愈远，则氨基酸顺序之间的差别愈大。nullCytC分子中Aa残基的差异数目及分歧时间 null2.5.1.2 一级结构的变异与分子病 在蛋白质的一级结构中，参与功能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基，即使在整个分子中发生一个残基的异常，该蛋白质的功能也会受到明显的影响。 被称之为“分子病”的镰刀状红细胞性贫血仅仅是574个氨基酸残基中，一个氨基酸残基改变所造成的。 nullnullnull血红蛋白β亚基N端的第6号氨基酸残基发生了变异，它变异来源于基因上遗传信息的突变。null2.5.2 蛋白质空间结构与功能的关系 空间结构是功能的直接体现者，空间结构的变化，特别是活性中心构象的变化，会导致功能发生改变或丧失。 核糖核酸酶S中的4个二硫键维持其三级结构，用巯基乙醇的尿素溶液证明了蛋白质的功能取决于特定的天然构象，而规定其构象所需的信息包含在它的氨基酸序列中。nullnull2.以血红蛋白为例来说明构象与功能的关系 血红蛋白(hemoglobin,Hb)是红细胞中所含有的一种结合蛋白质，它的蛋白质部分称为珠蛋白(globin),非蛋白质部分称为血红素(辅基) 。 Hb分子由四个亚基构成,每一亚基结合一分子血红素. 人的Hb分子结构为α2β2,α和β构象相似.每个亚基都具有独立三级结构, 肽链折叠盘曲形成球状,表面为亲水区，球形向内有20多个巯水AA侧链构成口袋形的疏水区，辅基血红素就嵌接在其中。null血红蛋白和肌红蛋白的AA残基数和AA序列有相当大的差异，但三级结构几乎完全相同，血红蛋白的亚基和肌红蛋白的单体分子各有一个血红素与O2结合。 Hb在体内的主要功能为运输氧气，而Hb的别构效应， 极有利于它在肺部与O2结合及在周围组织释放O2。 Hb通过其辅基血红素的Fe2+与O2发生可逆结合，血红素的铁原子共有6个配位键，其中4个与血红素的吡咯环的N结合，一个与珠蛋白亚基His残基的咪唑基的N相连接,空着的一个配位键可与O2可逆地结合, 结合物称氧合血红蛋白。null血 红 蛋 白 亚 基 的 构 象nullnull血红素的 结构式null在血红素中，四个吡咯环形成一个平面，在未与O2结合时，Fe2+的位置高于平面0.7Å。 一旦O2进入某一个α亚基的疏水“口袋”时，与Fe2+的结合会使Fe2+向该平面内移动0.75Å，嵌入四吡咯平面中。Fe2+在氧合时落入血红素平面null血红蛋白亚基间盐键示意图null一个亚基的别构作用，促进另一亚基变构的现象，称为亚基间的协同效应(cooperativity)。 在不同氧分压下，Hb氧饱和曲线呈“S”型。nullnull别构效应（allosteric site）：蛋白质与配基结合改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质的生物活性的现象。 别构蛋白质（allosteric protein）：具别构效应的蛋白质,除活性部位外,还有与别的配基结合的部位.别构蛋白都为寡聚蛋白。null总结 人的Hb分子结构为α2β2,α和β构象相似.每个亚基都 具有独立三级结构, 肽链折叠盘曲形成球状,表面为 亲水区，球形向内有20多个疏水AA侧链构成口袋形 的疏水区，辅基血红素就嵌接在其中。 血红蛋白的亚基之间相互作用形成稳定的四级结构，使其中的血红素与O2的结合能力降低。当血红蛋白分子中一个亚基的血红素与O2结合后，立即引起该亚基的构象发生变化,这种构象变化随即通过亚基间次级键引起另外3个亚基的构象改变，结果改变了整个分子的构象，使所有亚基都变成适宜与O2结合的构象，从而使血红蛋白的氧合速度大大加快。 null2.6 蛋白质的重要性质 蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，其部分理化性质与氨基酸相似，如两性电离、等电点、呈色反应、成盐反应等，同时又具有胶体性和变性等。null2.6.1 蛋白质的相对分子质量和测定方法 蛋白质的相对分子质量一般在104~106。其相对分子质量可根据其化学组成测定或者利用蛋白质的某些理化性质来测定。nullnull①沉降速度法 将蛋白质溶液放在超速离心机的离心管中进行超速离心。由于超过重力几十万倍的离心力的作用，而使蛋白质分子沉降下来。大小和形状都相同的蛋白质分子下沉速度相同，在离心管中产生一个明显的界面，利用光学系统可以观察到此界面的移动，从而测得蛋白的沉降速度。 一种颗粒在单位离心力场中沉降速率为恒定值，称沉降系数(sedimentation coefficient，S)，用S表示。可以通过公式计算蛋白质分子量。null已测得许多蛋白质的s值都在1×10-13 - 200×10-13秒之间。因此将1×10-13秒作为沉降系数的一个单位,用S(Svedberg unit)表示。 某蛋白质的沉降系数为30×10-13秒，表示为30S。 用超速离心法测得某种蛋白质的沉降系数之后，则可按照一定公式,计算出该蛋白质的相对分子质量。 null②凝胶过滤法 在层析柱中装入葡聚糖凝胶颗粒。这种凝胶颗粒具有多孔的网状结构。这些网孔只允许较小的分子进入颗粒内，而大于网孔的分子则被排阻。当用洗脱液洗脱时，被排阻的相对分子质量大的分子先被洗脱下来，相对分子质量小的分子后下来。null nullnullCation- exchange columnnull将3种以上相对分子质量有较大的差异的蛋白质制成混合溶液，经上柱和洗脱，根据洗脱峰的位置，量出各种蛋白质的洗脱体积。 以相对分子质量的对数(lg Mr)和洗脱体积作标准曲线。根据待测蛋白质在相同条件下的洗脱体积，在标准曲线查出其相对分子质量。 此法仅适用于球状分子的相对分子质量测定。 nullnull③SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度，决定于蛋白分子的大小、形状和电荷数量；而在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度，则决定于蛋白质分子的大小。 SDS(十二烷基硫酸钠)是一种去垢剂，可与蛋白质结合，使其变性并带上大量的负电荷，解离成亚基，同时变成棒状，从而掩盖了蛋白质原有电荷和形状的差异。这样，蛋白质的电泳速度只决定于蛋白质相对分子质量的大小。nullSDS-凝胶电泳时，蛋白质分子的相对迁移率与蛋白质相对分子质量的对数成直线关系。 用几种标准蛋白质相对分子质量的对数对相应的相对迁移率作图，得到标准曲线。根据测得的样品的相对迁移率，从标准曲线上可以查出样品的相对分子质量。null负极正极蛋白质条带电泳介质nullnullnullnull2.6.2 蛋白质的两性电离及等电点 蛋白质是由Aa组成的高分子化合物，具有许多游离的氨基、羧基、咪唑基、胍基、巯基、酚基等，因此与Aa一样，能象酸一样解离，也能象碱一样解离，也是两性电解质。null当溶液在某一 pH 值时，蛋白质所带正、负电荷相等，即总净电荷为零，此时溶液的 pH 称该蛋白质的等电点(isoelectric point)。nullnull蛋白质在等电点时，因没有同性电荷排斥，故最不稳定，溶解度最小，极易借静电引力结合成较在的聚集体沉淀出来（分离提纯蛋白质的方法）。 电泳：带电质点在电场中向电荷相反的电极泳动的现象。电泳方法是实验室、生产、临床诊断等常用来分离蛋白质和鉴定蛋白质纯度的手段。 null2.6.3 蛋白质的胶体性质 蛋白质分子量很大，一般在10000 ~ 1000000之间，在水溶液中分子直径在1~100nm之间，具有胶体溶液的性质，如不能通过半透膜、电泳现象等。因此可用透析和电泳的方法来分离、纯化蛋白质。null维持蛋白质胶体稳定性的因素 水化层：球状蛋白质表面多亲水基团(-COOH、-OH、-SH、-CONH2 等） ，具有强烈地吸引水分子作用，在水溶液中蛋白质颗粒的表面形成一层很厚的水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集。 同性电荷：在非等电点时蛋白颗粒带有同性电荷，相互排斥。 null2.6.4蛋白质的沉淀反应 破坏蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会凝聚成大的质点而从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀(precipitation)。 稳定蛋白质亲水胶体的因素是颗粒表面的水化层和电荷。若除掉这两个稳定因素（如调节溶液pH至等电点和加入脱水剂），蛋白质便容易凝集析出。高浓度中性盐、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂等都可引起蛋白质沉淀。null①中性盐 加入高浓度的中性盐（如[H4N]2SO4、Na2SO3 、NaCl等），可有效破坏蛋白质颗粒的水化层，同时又中和了蛋白质的电荷，使蛋白质产生沉淀。这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析(salting out)。盐析法是最常用的分离蛋白质的方法。null盐溶与盐析： 盐析（salting out ）：在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。 盐溶（salting in）：低浓度的中性盐可增加蛋白质的溶解度。由于蛋白质分子吸附某些盐类离子后，带电表层使蛋白质分子相互排斥，而蛋白质分子与水分子的相互作用加强，因此溶解度提高。null 由于大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏了蛋白质分子表面的水化层，同时又中和了蛋白质的电荷，使蛋白质沉淀。null常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。 用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来。盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。null②有机溶剂沉淀蛋白质 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。 调节蛋白质溶液至等电点时，加入有机溶剂可加速蛋白质沉淀。 常温下有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备蛋白质。null③重金属盐沉淀蛋白质 当溶液pH值高于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，它易与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）结合成不溶性盐而沉淀。 重金属沉淀的蛋白质常是变性的，误食重金属盐后可大量饮用牛奶或豆浆等蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。 若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。null④生物碱试剂和某些酸类沉淀蛋白质 pH小于等电点时蛋白质带正电荷，易与带负电（酸根阴离子）的生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸) 生成不溶性盐而沉淀。 血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。 null⑤加热凝固(coagulation)  将接近于等电点的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固而沉淀。 加热使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。null2.6.5 蛋白质变性作用 天然蛋白质因受物理及化学因素的影响，使其分子原有的天然构象发生变化（次级键破坏），从而导致理化性质和生物活性发生改变，称为变性(denaturation)。 变性蛋白质只有空间构象的破坏，蛋白质变性本质是次级键，二硫键的破坏，并不涉及一级结构的变化。null引起蛋白质发生变性的因素 化学因素：强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)、苦味酸、浓乙醇等。 物理因素：加热(70℃~100℃)、加压、脱水、剧烈振荡或搅拌、紫外线、X-射线照射、超声波、高压处理等。 变性因素常被应用于消毒及灭菌；保存蛋白质制剂时应注意防止蛋白质变性。null变性蛋白质的特点： ①生物活性的丧失； ② 包藏在分子内部的侧链基团暴露； ③理化性质改变：如变性后疏水基外露，溶解度降低形成沉淀。但在碱性溶液中或有变性剂存在时不沉淀，除去变性剂后则沉淀。球状蛋白质在变性后，分子伸展不对称程度增加，粘度加大，扩散系数降低； ④生化性质改变，蛋白质变性后分子结构伸展松散，因此，变性蛋白质比天然蛋白质更易受蛋白酶作用，这就是熟食易于消化的道理。null复性(renaturation)：当变性因素去除后，有的变性蛋白质又可缓慢重新回复到天然构象，此现象称为蛋白质的复性。 例如，核糖核酸酶在β-巯基乙醇和8M尿素作用下发生的变性，经过透析去除尿素和β-巯基乙醇，酶蛋白又可恢复其原来的构象，生物学活性也几乎全部恢复。 许多蛋白质变性时被破坏严重，不能恢复，称为不可逆性变性。 null2.6.6 蛋白质的颜色反应 ①双缩脲反应 ②茚三酮反应 ③米伦反应 ④坂口反应 ⑤Folin-酚反应 ⑥醋酸铅反应 ⑦蛋白质的黄色反应nullnull2.7 蛋白质的分类 蛋白质的种类繁多，结构复杂，目前尚无一个理想的分类方法。 ① 根据结构可分为单纯蛋白和结合蛋白。 ②按分子外形的对称程度分为球状蛋白和纤维状蛋白 球状蛋白(globular protein) ：球状或椭球状。 纤维状蛋白(fibrous protein)：细棒状或纤维状null也可按蛋白质的功能分为活性蛋白质(酶、激素蛋白质、运输和贮存蛋白质、运动蛋白质、受体蛋白质、膜蛋白质等)和非活性蛋白质(胶原、角蛋白等)两大类。null2.8 蛋白质的分离提纯和应用 每种细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。为了研究蛋白质的结构与功能，需将其分离、纯化，尽量除去不需要的和变性的蛋白质，提高单位质量蛋白质中所要的蛋白质的含量或活性。必须根据所分离蛋白质的性质、含量、分离的目的选择一套适当的程序。null2.8.1 蛋白质分离纯化的一般原则 蛋白质分离提纯的一般程序分为前处理、粗分级和细分级3步。 ①前处理 以适当方式将组织细胞破碎，使蛋白质以溶解状态释放出来，并保持其天然构象和原有生物活性。 动植物组织一般可用组织捣碎机、匀浆器和超声波破碎法；植物组织用研磨或用纤维素酶处理；微生物细胞用超声波法、高压挤压或溶菌酶处理。null组织破碎需加入适当缓冲液并在低温下进行，必要时加入蛋白酶抑制剂、巯基试剂等。对膜蛋白需加入去垢剂使膜结构瓦解，再用适当的介质提取。若所要的蛋白质主要存在于某一细胞组分，如线粒体、叶绿体、细胞核等，可先用差速离心法将其分开，再以该细胞组分作为下一步分离提纯的。nullnull②粗分级 通常用盐析、等电点沉淀、超滤、有机溶剂分级等简便、处理量大的方法从蛋白质混合液中除去大量杂质，得到浓缩蛋白质溶液。null③细分级 选用分辨率高的方法进一步提纯，如经过凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析、反相高效液相层析、亲和层析以及凝胶电泳、等电聚焦等。null2.8.2 蛋白质的应用 蛋白质制剂主要用于某些疾病的预防、治疗和辅助诊断，例如预防注射用的各种疫苗；用尿激酶、蛇毒蛋白酶溶解血栓；用胰岛素治疗糖尿病；用生长激素治疗侏儒症；注射丙种球蛋白治疗某些免疫功能缺损和感染；用蛋白酶制剂治疗消化不良；利用抗体(尤其是单克降抗体)帮助诊断某些癌症和病毒感染等。null某些蛋白制剂已用于食品加工和饲料工业。例如-淀粉酶(液化酶)和-淀粉酶(糖化酶)用于发酵工业以提高淀粉原料利用率；葡萄糖淀粉酶用于酶法生产葡萄糖；葡萄糖异构酶用于生产高果糖糖浆；菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等用作肉类嫩化剂；果胶酶用于果汁澄清；纤维素酶用作饲料添加剂，以提高饲料的利用率；碱性蛋白酶用作洗涤剂、添加剂等。