实验3 叶绿体色素的提取、分离、性质

实验三 叶绿体色素的提取、分离、性质及含量 一、实验目的 1、掌握叶绿体色素的提取方法； 2、掌握纸层析法分离叶绿体色素的原理和步骤； 3、掌握叶绿体色素的部分理化性质。 二、实验原理 叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为色素蛋白复合体，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色层的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。 叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。 三、实验仪器及材料 仪器及试剂：吹风机、定性滤纸、脱脂棉、火柴、碘钨灯、95%乙醇、汽油、醋酸铜、浓盐酸、CaCO3 材料：菠菜叶片 四、实验步骤 1、提取 称菠菜叶子10g，加少许石英砂、CaCO3、乙醇研磨，研成匀浆，过滤，用乙醇定容至50ml，分装于5个试管内。 2、分离 用滤纸条浸色素提取液（试管1），吹干，反复多次；将带色素的滤纸条卷成灯芯，将表面皿放在培养皿内，注上汽油，把灯芯浸在汽油内，加盖，色素层分清后，取下吹干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。用铅笔标出各种色素的位置和名称。 3、叶绿体色素吸收光谱曲线 取1ml提取液于比色杯中（试管2），加3ml95%乙醇。用95%乙醇作为对照，在400~700nm之间每隔20nm测一次光。记录波长和吸光度A于表中，并在绘图纸上绘出叶绿体色素的吸收光谱曲线。 4、叶绿体色素含量的计算 在标准曲线上查出波长600nm时的叶绿体色素浓度。根据下列公式计算： 叶绿体色素含量（mg·g-1）= 叶绿体色素的浓度（mg·l-1）×提取液体积（l）×10-3/样品鲜重（g） 5、性质 （1）荧光现象 将试管3置于光源前，分别观察叶绿体色素提取液的透射光颜色和反色光颜色，反射光颜色即为叶绿体色素产生的荧光现象。 （2）光对叶绿素的破坏作用 将试管4置于暗处，试管3置于强光下，照射2~3小时后，观察试管颜色的变化，解释这种现象。 （3）铜在叶绿素分子中的替代作用 向试管5中逐滴加入浓盐酸，并不断摇匀，至颜色变化，观察并记录现象；向变色后的叶绿素溶液中加入少量醋酸铜，并在酒精灯上缓缓加热，观察并记录颜色的变化，分析原因。 五、注意事项 1、分离色素用的圆形滤纸，在中心打的小圆孔，周围必须整齐，否则分离的色素不是一个同心圆。 2、每次改变波长后，要用95%乙醇重新调零。 六、实验结果 1、画图说明叶绿体色素纸层析结果，并解释原因。 2、解释光对叶绿素的破坏作用现象。 3、在标准绘图纸上绘出叶绿体色素的吸收光谱曲线并计算色素含量。 4、解释叶绿素的荧光现象。 5、解释叶绿体色素分子的替代作用现象。 七、思考题 1、用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水丙酮等提取干燥材料中的叶绿体色素，结果会如何？为什么？ 2、研磨提取叶绿素时，为何要加入CaCO3？ 3、铜在叶绿素分子中具有替代镁的作用，这有何实用意义？