2010MicroRNAs的分子进化与调控机制

遗 HEREDITAS(Beijing)2010年9月 ISSN 0253-9772 WWW．chinagene．on 综 述 DoI：10．3724／SP．J．1005．2010．00874 MicroRNAs的分子进化与调控机制 王天宇 ，董园园 ，李海燕 ，李校垄 1．吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，长春 130118； 2．吉林农业大学生命科学学院，长春 1301 18 摘要：MicroRNAs(miRNAs)是一类专门调控基因表达的非编码小分子 RNA，广泛参与生物发育、细胞分化、 细胞凋亡等多种生命进程。miRNAs在不同种系间独立进化且在进化演变中普遍保守。文章综述了miRNAs起源、 进化上的保守性及甲基化调控方面研究进展，另外在疾病和动植物应用方面的研究也作了较为详细的阐述。 关键词：小分子RNA；微小RNA 进化；甲基化 M olecular evolution and regulatory mechanism of microRNAs W ANG Tian—Yu 一，DONG Yuan—Yuan ，LI Hai—Yan ，LI Xiao—Kun 1．Engineering Research Center ofBioreactor and Pharmaceutical Develoi，merit,Ministry ofEducation，Jilin Agricultural University Changchun 1301 18，China； 2．CollegeofLiyeScience，JilinAgriculturalUnivers ，Changchun130118，China Abstract：MicroRNAs，a type of small non—coding RNA specialized in regulation of gene expression，extensively partici— pate in biological development，cell differentiation，apoptosis，and other cellular processes．MiRNAs evolved independently in different strains and generally conserved in the process of evolution．This review summarized the origin，regulation of methylation，and evolutionary conservation of miRNAs．In addition，application of miRNAs in diseases，animals and plants was discussed． Keywords：miRNA；microRNA evolution；DNA methylation MicroRNAs(miRNAs)是目前研究最为广泛的一 类内源性非编码小分子 RNA，长度范围在 l6～29 nt， 平均长度 22 nt【1】，进化上高度保守。转录后水平上 调控真核生物超过三分之一的基因表达[2】。1993年 首个 miRNA lin．4在秀丽新小杆线虫 (Caenorhab． ditis elegans)时序性发育调控的研究中被发现[31；随 后于2000年在线虫(Nematoda)中鉴定到 f一7『4J。迄 今更多的 miRNA基因相继在植物、动物和微生物中 被发现，并且数据不断更新，人类 中被注释的 miRNA基因在 miRbase1 3．0数据库统计基础上新增 15个，小鼠 miRNA基因新增 32个，拟南芥新增 3 个(miRbase 14．0)。miRNA编码基因大多存在于基因 间隔区、内含子及转录子内部，且多数 miRNA属内 含子 miRNA(intronic。miRNA) 】。在功能上参与真核 生物细胞增殖、分化、发育及凋亡等多种生理过程 和病理过程，属于小分子干扰网络调控系统中一类 收稿日期：2009—12—31；修回日期：2010～02—24 基金项目：国家高技术研究发展计划项目(863计划)(编号：2007AA100503)资助 作者简介：王天宇(1984一)，男，硕士研究生，专业方向：基因工程。E．mail：wty007wty@163．tom 通讯作者：李海燕(1972一)，女，博士，教授，研究方向：植物基因工程。E-mail：hyli99@163．com 李校垄(1964一)，男，博士，教授，研究方向：生物制药。E mail：xiaokunli@163．net 第 9期 王天字等：MicroRNAs的分子进化与调控机制 875 新的调控模式，对其研究将有助于进一步理解基因 间的多层次网络调控模式。miRNA表达可受 DNA 甲基化调控，基因内部或邻近的CpG岛异常甲基化 导致miRNA表达紊乱进而引起肿瘤和疾病。miRNA 起源上存在物种差异和系统差异，所以其形成过程 在植物和动物中存在区别，但转录初始物(pri．miRNA) 均经两步加工剪切后释放成熟 miRNA。 1 miRNA的生物合成与调控机制 1．1 miRNA的生物合成 miRNA基因首先在 RNA聚合酶 Ⅱ的作用下转 录得到 pri．miRNA，再经一 系列 酶切加 工为成熟 miRNA分子。部分 pri．miRNA携带 RNA聚合酶Ⅲ 转录产物特征，位于基因上游的特异位点同转录因 子结合调控RNA聚合酶Ⅲ启动子的转录活性。 Pri，miRNA 的加工在植物和哺乳动物中存在差 异，如图 1所示。细胞核内有 Drosha和 Dicer两种 RNase Iii型酶参与 miRNA 前体(pre—miRNA)的生 成【6】。Drosha蛋白在结构上包含两个 RnaselH结构 域、结合双链 RNA结构域及一个N末端片段 】。在 动物细胞核内绝大多数pri．miRNA经Drosha蛋白剪 切产生具有茎环结构的 pre．miRNA。也并非所有动 物pre．miRNA都由Drosha蛋白介导加工，在昆虫及 哺乳动物中另有一些位于内含子的 pre—miRNA可以 A 利用 RNA 的转录剪切机制形成茎环结构后直接进 入下步 miRNA的加工l6】。植物细胞因缺少 RNase11I 型Drosha蛋白家族，该剪切功能由数个同源的Dicer 酶代替，并在产生pre。miRNA后由HASTY(HST)蛋白 负责转运至核外【8】。由于miRNA／miRNA*双体的互补 结构【9】，pre．miRNA二级结构呈发夹型，其分子长度 在动物中变化并不明显，一般 由约 70个核苷酸构 成。植物 pre。miRNA间长度差异很大，茎环结构长 度相差达 1 1 nt，研究推测这一差异可能与 pri—miRNA 的识别模式有关Il 。 Pre—miRNA输出核外后经另一种 RNase III型酶 Dicer催化剪切并释放成熟 miRNA。植物 miRNA主 要由类 Dicer的DCL酶加工剪切。DCL是一类 RNase Ⅲ型酶，结构上含有一个解旋酶结构域和两个串联 的RNaselII结构域以及一个双链 RNA结构域⋯J。成 熟的 miRNA 来源于发夹结构的任意端臂，大多数 miRNA位置上起源于5 臂，可能是由于5 臂动力学 不稳定性引起Il训。 1．2 miRNA分子的转录后调控 内源性 miRNA的转录后调控 、生殖细胞特有的 piRNA调控、siRNA介导的小分子干扰调控都可介 导 RNA转录沉默机制的发生 引¨。siRNA和 miRNA 分别为 Dicerl及 Dicer2酶的加工产物，有趣的是： piRNA 的生物合成作用不依赖 Dicer酶[1引。大多 miRNA基因 B 皿 Ⅱ() A 皿 町 皿CⅢ mi — ◆ 成熟miRNA 图 l microRNA在动、植物中的加工过程 A：动物 miRNA生物合成；B：植物 miRNA生物合成。 miRNA基因 ]工[ 一miRNA l DC 皿 Ⅲ I●◆ 皿 n1iRNA／miRNA 烈体 ● 成熟miRNA 876 遗 HEREDITAS(Beijing)201 0 第32卷 siRNA起源于双链 RNA(DsRNA)前体产物，与成熟 miRNA分子大小及作用机制相似，均可作为转录因 子行使基因表达调控，也可介导抗病毒机制。成熟 miRNA和 miRNA*在细胞质中的去向有别。miRNA 可与蛋白结合形成 RISC(RNA诱导的转录沉默复合 物)后与靶标mRNA以碱基互补方式结合，进而降解 靶标分子或抑制蛋白的翻译过程，如图 2所示。在 RISC复合体诱导转录复合物降解过程中，研究者发 现多蛋白因子协助复合体对靶基因结合从而介导转 录抑制[14]0 Jinek等l1 研究指出GW．182家族蛋白N 末端的保守序列TNRC6C为RISC内Argo蛋白的结 合域，同 c末端 PABC沉默结构域组成晶体复合物 介导 mRNA脱腺苷化。miRNA*分子因动力学不稳 定性则被核酸酶降解。在转录后水平的基因表达调 控中，miRNA作为RNA干扰调控系统中的一类进化 保守的关键因子介导靶基因降解或抑制蛋白翻译。 动物 miRNA特异识别并结合 3 ．非编码区(3 UTR)， 该匹配不完全互补，允许一定程度的错配l1制。 miRNA内部 7～8 nt的种子区，是发挥靶标序列识别 和精确匹配的关键结构。Malhas等 7¨J研究显示： miRNA31正是通过同靶基 因 P16／P19的 3 一UTR区 域结合来调控 CDKN2a细胞分裂周期。植物 miRNA 同靶标的绑定位点似乎更广泛，不仅可以同 mRNA 的3 ．UTR结合，也可识别包括开放阅读框在内的成 熟转录序列Il引。尽管动物和植物 miRNA在结构和 作用机制上存在差异，但参与miRNA加工的催化酶 却相同或高度同源，推测他们进化上可能起源于相 同的 RNA干扰系统，而在随后的进化演变中，因动 miRNA基因 物及植物的 miRNA 独立进化而呈现物种间的系统 差异和弱相关}1 9' 刚。 作为两类广泛参与基因表达调节与转录后调控 的小分子干扰RNA，siRNA及miRNA的作用机制也 存在微小差异【2IJ：(1)在基因来源方面，miRNA是一 类内源小分子 RNA，自身存在编码基因；而 siRNA 不存在编码基因，主要来源于外源双链小分子 RNA 的降解或在基因组中整合的转位因子的转录物；(2) 在匹配程度上，siRNA同靶基因完全匹配，而在动物 细胞中，miRNA同靶基因存在一定程度的错配l2】。 miRNA抑制靶基因的翻译，并通过mRNA 3 端 脱腺苷酸化导致整个 mRNA降解。Joel等【2 】运用无 功能突变子竞争抑制和RNA干扰技术等方法，寻找 并证实了CCR4一NOT复合体的成员 CAF1和 POP2 在 miRNA引发的 mRNA脱腺苷酸化过程中起到了 关键性 的作用。研究还首次证实了 CAF1在 siRNA 引起的off-target现象中也起到了重要作用。进一步 研究发现，CAF1并不是通过 RISC的直接招募作用 而发挥功能 ，而可能通过 miRNA 和 RISC 改变 mRNA的结构，从而促进 CAF1对 mRNA的降解。 该研究成果为进一步揭示哺乳动物细胞内大量 mRNA分子命运如何被决定奠定了基础。 2 miRNA的进化 2．1 miRNA的保守性 绝大多数miRNA基因是高度保守的，这一保守 性尤其体现在同靶标基因匹配的种子区序列的保守 靶标基因 图 2 miRNA介导的转录抑制机制 第 9期 王天宇等：MicroRNAs的分子进化与调控机制 877 性上。双子叶植物拟南芥的 miR一168基因同样保守 地存在于单子叶植物水稻中。Axtell等口 还发现该 基因也存在于被子植物、裸子植物和蕨类植物，但 并未在苔藓类植物中发现。目前已有包括 miR一168 在内的21个 miRNA基因家族被发现在被子植物中 有保守性，这些基因甚至出现在进化上更为古老的 藻类植物和裸子植物中，其中 13个miRNA可以预测 到对应靶mRNA及在进化中的地位。被子植物中的两 个miRNA基因家族miR．165、miR．166在苔藓和水藻 中完全保守，尤其是针对 miR一166的高度保守性可推 测在进化中这些植物可能起源于共同的陆生植物祖 先。动物rrfiRNA与植物保守程度一致，都属于系间高 度保守。如动物中 f_7基因在脊椎动物、节肢动物、 线虫中均被证实保守。这些保守的 miRNA基因均参 与了动植物进化、演变、分化与发展等过程 钔。 miRNA在植物与动物间差异较大，推测这可能 是独立进化引起。通常认为不存在在动植物间均保 守的 miRNA，但是研究人员发现来源于长末端重复 的转录子区域的 miR．854及 miR一855基因，在动物 和植物中均存在，意味着动物和植物可能来源于同 一 基因调控系统【2引。 miRNA并非多细胞真核生物特有的一类调控 分子，近来发现单细胞生物也能够加工单链前体得 到miRNA。研究表明单细胞生物也能从不完全匹配 的单链前体结构中加工得到小分子 RNA，如藻类和 细菌I2郇。尽管在细菌中还未检测到与 miRNA 相作 用的靶标，但藻类 miRNA 经证实可诱导靶基因降 解。目前，在单细胞生物和多细胞生物研究领域尚 未发现单细胞生物中的 miRNA同动植物 miRNA存 在相似或同源性。 2．2 miRNA与靶标的进化关系 进化关系相近的种系间常存在一系列保守的 rniRNA，如动物中的 ．7等miRNA基因，其转录产 物序列表明：对于直系同源的 miRNA，与它们 相互作用的靶基因也是同源的，并且这种相互关系 更倾向存在于进化关系邻近的种系内。对脊椎动物 及昆虫而言，保守 miRNA同靶基因 3'-UTR互补序 列的分析有利于进行亲缘关系较近物种的 miRNA 靶基因预测。但对于一些种系进化关系较远的种间 虽存在高度保守 miRNA，其靶基因只有部分同源。 Grun等f2 研究发现：大多数动物及昆虫中保守的 miRNA，两个种系间对应的靶标却并不同源。推测 保守miRNA基因在起源上并不同步，动物内保守的 miRNA 起源时序先于昆虫，导致系间 miRNA 与其 靶标 mRNA 的进化历程不同，系特异的 miRNA在 mRNA的进化过程起了重要作用。Ruby等【28】提到动 物中平均每个 mRNA分子受到 7个 miRNA分子的 调控，mRNA内 3 一UTR区序列受突变影响，在进化 历程中和miRNA间的相互关系并不固定，除了高度 保守的 miRNA 外还存在着大量低丰度表达的系特 异 miRNA，这些 miRNA常以组合方式调控转录。 由于动物中 miRNA 同靶标的匹配不像植物那么严 格，因此，动物体内功能基因更易受到进化 miRNA 的转录后调控。 3 miRNA基因的甲基化调控 表观遗传是指在核酸序列水平上不涉及基因组 改变的遗传变化。表观遗传的发生与改变调节细胞 内多数关键生理过程的有效进行【2 。miRNA自身转 录表达也受到一系列表观遗传学、尤其是 DNA甲基 化的严密调控。miRNA基因内部或邻近的 CpG岛 发生异常甲基化导致某些关键 miRNA 表达紊乱进 而引起肿瘤和疾病发生 】。Lodygin等 对抑癌基因 p53的研究发现，p53转录因子可靶向调节 miR34．a， p53产物可同miR34．a基因结合并通过介导 Gl期细 胞复制停滞从而抑制前列腺、黑色素肿瘤、膀胱等 多数癌细胞的增殖。如果 miR34一a启动子受到异常 水平的甲基化调控后不能被 p53诱导，其肿瘤抑制 作用也相应减弱。此外在不同类型癌症中均发现 miR34一a基因受到的甲基化调控。 甲基化调控的 miRNA 表达水平在正常组织和 不同时期的癌组织中差异很大。最近研究发现： miRNA在肿瘤发生中可作为致癌或抑癌因子，并且 miRNA启动子的 CpG岛甲基化也被视为癌细胞转 移的常规分子标识 。Amaia等[321报道癌组织中 miR一148a、miR一34b／c及 miR．9基因的表达均因受甲 基化调控而基因表达沉默，而 miR．148a等基因去甲 基化后转录激活，相应地癌细胞发生减少，癌细胞 转移信号路径受到抑制，同时伴随 C．MYC、E2F3、 CDK6靶基因表达水平下调。miRNA基因甲基化与 癌症发生及癌细胞转移密切相关联(表 1)。 878 通 HEREDITAS(Beijing)2010 第32卷 4 miRNA的最新应用 随着核酸高通量测序技术的发展，miRNA基因 合成测序与基因芯片、生物信息学中miRNA基因及 靶基因预测、基因发现和功能验证等分子实验手段 结合，至今越来越多的新 miRNA、候选 miRNA基 因以及非保守 miRNA相继被发现和证实，从而为 miRNA功能研究及应用奠定了坚实的基础。 4．1 miRNA在肿瘤中的调控作用 对肿瘤的研究 目前已越来越多的关注微环境作 用。借助于高通量 miRNA 测序等技术，研究发现 miRNA 在癌组织和正常组织中的表达水平差异很 大。其中，Wu等[3 在卵巢癌细胞调控中发现miR一205 表达水平明显低于癌旁组织，指出miR205与抑制细 胞增殖有关。Tavazoie等[341同样发现LM2细胞中存在 m／R-335、， 一126、miR一206、 miR一122a、miR．199a*、 miR一489共 6个表达失调的 miRNA 基因，其中 miR一335、miR一126、miR一206表达差异最为显著，和 正常组织相差 5倍。Marcucci等[3 51利用芯片方法发 现淋巴细胞 白血病 中包含 m／R一21在内的 21个上调 miRNA和 m／R．128a等 6个下调 miRNA基因，其中 let一7b、miR．128a、miR．128b和 miR。223表达水平差 异最显著。高表达的miRNA通过抑制某些抑癌基因 而起到癌基因作用，低表达的miRNA则失去对抑癌 基 因的抑制而发挥抑癌基因的作用。研究结果预示 了 miRNA的复杂作用机制，单个 miRNA基因可调 控多个靶基因，多个miRNA也可能作用于同一靶基 因，且带有一定特异性。miRNA表达变化的这一特 征可作为癌症早期诊断的分子标记物【3刚，也可以解 释和阐述肿瘤的发生及恶化的作用机制。 4．2 对植物的调控作用 目前研究发现，植物miRNA可以调节生长机制， 维持正常生理活动，影响植物发育过程。拟南芥中 miR319a可同靶基因 TCP2、TCP3、TCP4、TCPIO 结合调控花瓣发育过程[37】，尤其是 TCP4转录因子 的靶向结合。miR319家族中miR319a推测同叶片表 型发育相关。miR319a基因内部一个核苷酸定点突 变后，异常表达导致花瓣及雄蕊表型缺陷。miRNA 还参与调控植物对环境适应性的调节，包括植物对 逆境抗性。Zhang等口踟利用高通量测序方法对断尾 草全基因组 的大量小 RNA 分析发现一套非保守 miRNA，其 中 miR395家族的基因组结构与水稻区 别明显，3个保守miRNA和预测的9个miRNA基因 的表达均随寒冷刺激发生变化，推测这些小分子 RNA 与植 物抗寒性相关 。有研究 指出，苜蓿 (Medicago truncatula)在干旱条件下根部 miR169表 达下降，而茎和根部的miR398a／b和miR408表达均 上调，引起与铜调节蛋白 Cox5b、过氧化物歧化酶 CSD1表达下降，预计这两种蛋白主要调控苜蓿对 缺水状态的适应性。有趣的是，根部 miR169的下调 未并引起靶基因 MtHaP2一 产物积累，推测 miR169 可能是通过其他调控路径参与耐旱机制[3 。 4．3 对脊椎动物的调控作用 哺乳动物细胞中 miRNA 以转录后调节作用 的方式参与调控细胞发育和分化、代谢增值、细 胞凋亡、病毒感染等【4们。miRNA可参与脊椎动物 包括心血管生成及正常发育调控。如miR．133a参 与肌细胞发育，miR 23b调节鼠神经发育等。脊椎 动物内皮细胞尤其是血管的构造、功能及血管再 生都与 miRNA的调控作用密切相关。miRNA还 参 与复 杂疾病调 控 。如 miR一378、miR．296及 miR．17—92基因簇调控肿瘤血管生成，这为病理血管 治疗提供了新的路径L4”。miRNA还在心室肥厚、心 律紊乱、心力衰竭等心脏疾病中起调控作用。区别 于正常心脏调控表达，在疾病组织中的 ．7c、 m／R一23a、 miR一100、 miR一103、miR一140"、 miR一214 表达量上升；miR．126"表达水平下降，表明多种 第 9期 王天字等：MicroRNAs的分子进化与调控机制 879 miRNA 在心脏疾病中起调控作用。另外在肝脏中 miR122可调控胆固醇合成速率从而介导脂肪肝形成 过程 J。病毒性肝炎中，HCV病毒序列与 miR． miR 30、miR-128、miR一196、miR．296、miR．351、miR一431 及 miR．448 的种子 区存在互补区域 ，并能够抑制 HCV病毒的复制与感染，miRNA一1等上调表达有效 抑制了病毒性肝炎的发生[431。可见在一系列的复杂 疾病中对 miRNA调控机制的发现有助于疾病的治疗， 并促进由药物治疗向基因靶向治疗的过程转变。 5 前景与展望 小分子 RNA的转录调控渗透于真核生物发育的 各个过程，其中大多数基因位于复杂基因组序列，且 多数为重复序列，在以往的研究中易于被忽视。随着 高通量rniRNA测序方法的应用，对miRNA的报道将 愈加广泛，其参与的基因表达调控机制也逐渐明确。 miRNA 保守性研究不但关联分子发育机制和 分子进化；miRNA靶向调控真核生物各种生理病理 路径；miRNA转录后调控与人类的复杂疾病关系紧 密，可以作为疾病早期诊断的分子信号，或利用其 分子干扰机制进行分子治疗；rniRNA甚至可以作为 癌细胞增生及癌细胞凋亡的分子标识 引。在 miRNA 基因的表观遗传调控中，对正常细胞硬『J中瘤细胞中 miRNA基因的研究有助于了解肿瘤发生。表观遗传 调控的 miRNA 基因表达调节为癌症治疗提供了新 的分子治疗方法【4 ，通过染色质修饰、甲基化修饰、 miRNA 基因表达沉默或过表达等方法恢复抑癌因 子活性，癌细胞中去异常甲基化等。但新近的研究 表明利用 miRNA 对靶基因的调节过程远比想象要 复杂得多，如 miRNA 的过量表达可能会引起“饱和 效应”，启动内源 miRNA 的保护机制，导致靶基因 的表达量升高【4 。另外，在特异性调节方面，由于家 族内miRNA的序列同源度极高，针对 miRNA家族 不同个体的特异性调节仍是一个难题[471。但目前对 大多数生物发育、分化和疾病方面的小分子基因表 达调控机制、非保守 miRNA的起源及其与靶基因作 用方式等还有待研究者深入探讨，以期早 日将 miRNA的机制研究应用到实际中。 参考文献(References) 【2】 【3】 [4】 【5】 [6] 【7】 [8】 【9】 【lO】 【11】 【12] [13】 [14] 【15] 【16】 [17】 【1】Zhang B，Stellwag EJ，Pan X．Large—scale genome analy— sis reveals unique features of microRNAs．Gene．2009． 【1 8】 443(1-z1：100-109． He L．Hannon GJ．MicroRNAs：small RNAs with a big role in 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