粗多糖（碱性酒石酸铜滴定法）

QB/XXXX-2005 粗多糖的测定方法 （一）碱性酒石酸铜滴定法 本方法适用于保健食品中粗多糖的测定。 1.方法提要 样品多糖沉淀物经酸解后，全部转成单糖，单糖具还原性，在加热条件下直接滴定标定过的碱性酒石酸铜液，以亚甲蓝作指示剂，根据样品液消耗的体积计算还原糖含量，再乘以换算系数0.9计算多糖含量。 2.仪器 （1）离心机：4000r/min。 （2）离心瓶容量100mL或具盖10mL离心管。 （3）水解瓶：500mL带冷凝回流装置。 （4）电炉：1000W。 （5）pH计。 （6）水浴锅。 3.试剂 实验用水为双蒸水，所用试剂为分析纯级。 （1）碱性酒石酸铜甲液：称取硫酸铜（CuSO4•5H2O）15g，亚甲蓝（次甲基蓝）0.05g，加水溶解，并稀释至1000mL。 （2）碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000mL储存于橡胶塞玻璃瓶内。 （3）无水乙醇。 （4）浓盐酸。 （5）40%氢氧化钠。 （6）葡萄糖液：准确称取1.0000g经过98~100℃干燥至恒重的分析纯葡萄糖，加水溶解后，并以水稀释至1000mL此溶液1mL含1mg葡萄糖，现用现配。 4.测定步骤 （1）样品处理： a.胶囊、片剂、粉剂、颗粒等（不含淀粉）的样品：准确称取均匀研碎的样品粉末3~5g，置于100mL的离心瓶中，加15mL热水（温度>90℃）搅拌直至溶解无沉淀物为止，如样品难溶，可在沸水浴中加热30min后过滤，定容。取此待测液15mL加75mL无水乙醇搅拌均匀（若只有10mL离心管，则每管加入1.5mL样品溶液，后加7.5mL无水乙醇，加盖反复倾倒管子数次）。在离心机中以4000r/min离心10min，并小心弃去上清液，再加15mL热水（温度>90℃）冲洗离心瓶中沉淀物，或用1.5mL热水冲洗离心管中沉淀物，重复一次后再以4000r/min离心10min，小心地用吸管将上层液体吸去。 用玻璃棒或小羹匙将沉淀物取出并转移至500mL酸水解瓶底部，取50mL热水（温度>90℃），其中部分用来冲洗离心瓶或离心管壁中剩余的沉淀物，将沉淀物一并转移至500mL酸水解瓶中，加入15mL浓盐酸于酸水解瓶中，开启冷凝水，在沸水浴中加热2h，冷却，然后先用40%的氢氧化钠粗调，后用稀的氢氧化钠细调，再置于pH计上调整pH在6.8~7.2之间，（不要用pH纸调试）。 将已中和的酸解液转移至100~250mL容量瓶中（视糖浓度而定），加水定容（V1）。用滤纸过滤，滤液为待测液。 b.口服液样品：准确吸取均匀样品溶液15mL于100mL的离心瓶中，或1.5mL于10mL离心管中，同上操作。 c.胶囊、片剂、粉剂、颗粒等（含淀粉）的样品：准确称取2g均匀研碎的样品粉末，置于100mL的具塞锥形瓶中，加50mL热水（>90℃）溶解，在沸水浴中加热15min，使淀粉糊化，冷却至60℃以下。加1.0mL10%的淀粉酶溶液，加0.5mL乙酸钠缓冲液（pH7.4），加塞，于55~60℃保温1h，中间间歇搅拌（取1滴上清液用碘液检验是否完全水解。若呈蓝色，再加淀粉酶溶液并继续保温，直至酶解液加碘液后不呈蓝色为止），加热至沸（使酶失活），然后再加入1%的葡萄糖酶在37℃温箱中，保温24h使淀粉全部酶解成葡萄糖。再移样液于蒸发皿中，并在沸水浴中稍浓缩，放冷，小心将样液转入25mL容量瓶中，用水洗容器，并定容至刻度，过滤。 然后按上法用无水乙醇沉淀多糖，并用85%的乙醇洗沉淀物2次，将沉淀物酸解中和、定容后待测。 （2）标定碱性酒石酸铜液： a.用定量移液管吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5mL于150mL的锥形瓶中，加10mL蒸馏水及数粒玻璃珠。 b.用滴定管加入9.0mL标准葡萄糖溶液于锥形瓶中，并将锥形瓶置电炉上迅速加热，务必在2min内至沸，并保持溶液在微沸的状态下再用标准葡萄糖溶液滴定，待溶液颜色变浅时，以每2s1滴的速度滴至蓝色刚退去为终点，记录消耗标准葡萄糖溶液的体积，同时平行操作3次，取其平均值（VG）。 （3）样品溶液的预测： a.按4（2）a操作。 b.将锥形瓶置电炉上迅速加热，务必在2min内至沸，并保持溶液在微沸的状态下，从滴定管中滴加样品溶液，待溶液颜色变浅时，以2s1滴的速度滴至蓝色刚退去为终点，记录样液消耗体积即为预测体积。 （4）样品测定： a.按4（2）a操作。 b.从滴定管中滴加比预测体积少1.0mL的样品溶液，将锥形瓶置电炉上迅速加热，务必在2min内至沸，并保持溶液在微沸的状态下，从滴定管中滴加样品溶液，待溶液颜色变浅时，以2s1滴的速度滴至蓝色刚退去为终点，记录样液消耗的总体积，同时平行操作3次，取其平均值（V2）。 5.结果计算 VG×c×V1 样品中粗多糖的含量= ×0.9×100% m×V2×1000 式中：VG——标定10mL碱性酒石酸铜液（甲、乙各5mL）消耗标准葡萄糖溶液mL数； c——标准葡萄糖溶液的浓度（mg/mL）； m——样品质量（g）； V1——酸解液中和后定容的体积（mL）； V2——测定时平均消耗样品溶液体积（mL）； 1000——mg换算成g； 0.9——还原糖换算成多糖的系数。 计算举例： 灵芝胶囊（灵芝粉）称3.9080g于100mL离心瓶中，加15mL热水溶解，加75mL无水乙醇沉淀多糖，将沉淀物酸解后，调pH至6.8~7.2，用水定容至250mL。滴定10mL碱性酒石酸铜液（甲、乙液各5mL）耗样品液8.02mL。 标准葡萄糖溶液的浓度为1.0mg/mL。 10mL碱性酒石酸铜液消耗标准葡萄糖溶液的体积为10.90mL。 10.90×1.0×250 粗多糖= ×0.9×100%=7.82% 3.9080×8.02×1000 6.回滴法 如样品含糖量少或水解后溶液颜色太深，影响终点观察误差较大时，可采用回滴法，操作同4（2）。但将加水10mL及标准葡萄糖溶液9.0mL改为加样品水解液20mL，然后用标准葡萄糖溶液滴定至终点（预试），正式实验时可先加比预试少1mL的标准葡萄糖液于锥形瓶中，如上法测定，记录标准葡萄糖液的总耗量（Vg）。 计算公式同上：式中VG用VGˊ表示。 VGˊ=（VG—Vg） 计算举例： 样品4.3280g溶于热水，放冷并定容至25mL，取1.5mL于10mL具塞试管中，加7.5mL无水乙醇沉淀多糖，将沉淀物酸解后，调pH，用水定容至100mL。 测定 样液用量 /mL 葡萄糖液加入量/mL 葡萄糖液回滴用量/mL 粗略 用量1 用量2 用量3 平均 总耗量 预试 20 9.70 正试 20 8.70 0.63 0.60 0.60 0.61 9.31 标准葡萄糖溶液的浓度为1.0mg/mL，10mL碱性酒石酸铜液消耗标准葡萄糖溶液的体积为10.90mL： （10.90-9.31）×1.0×100×25 粗多糖= ×0.9×100%=2.75% 4.3280×20×1.5×1000 7.注释 （1）保健食品中糖的种类很多，欲测定样品中多糖的含量，可先将样品溶于热水，后用5倍容量的无水乙醇将多糖沉淀，经离心分离后除去水溶性的单糖及低聚糖，再用热水冲洗沉淀物，重复沉淀-分离步骤，获得活性多糖。 分离后的多糖可用盐酸水解，过滤后用碱性酒石酸铜滴定法测定其还原糖含量，再换算成多糖含量。 用热水溶解多糖沉淀物，并用苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法以葡萄糖为对照品用分光光度法测定。 （2）为了减少实验误差，在操作时应严格遵守所规定的操作条件，注意热源强度（电炉功率）、锥形瓶规格、加热时间、滴定速度的一致性。 （3）保健食品中样液多为有色溶液，可采用回滴法。回滴法因标准糖溶液浓度是已知的，所以终点更容易控制，但在正式滴定前，一定要进行预测，以确定加入标准葡萄糖溶液的量，同时可以练习掌握操作条件。 （4）加热至沸后，用标准葡萄糖溶液滴定至终点时，标准液的用量必须控制在0.5~1.0mL之间，平行测定相差不超过0.1mL，否则应再重复滴定。 （5）亚甲蓝被糖还原为无色，表示终点到达，但与空气接触又可被氧化为蓝色，所以一定要保持在微沸状态下（防止空气进入滴定）。具体操作时可将石棉网中的石棉部分平放在电炉的一半位置，调节好酸式滴定管的高度，电炉先通电待温度恒定后才加热，并用烧瓶夹固定锥形瓶，置电炉上迅速加热至沸后再将锥形瓶移于另一半有石棉网的电炉上继续加热，这样可避免把锥形瓶从热源上取下，并保持在微沸状态下滴定，而且方便终点观察。 （6）淀粉酶的水解具有专一性，它只水解淀粉而不会水解其它多糖，在淀粉酶的作用下，使淀粉水解成低分子糊精和麦芽糖，再在葡萄糖酶的作用下变成葡萄糖。酶的用量应根据酶活力而定。 （7）脂肪的存在会妨碍酶对淀粉的作用及可溶性糖类的去除，故应用乙醚脱脂，如样品中脂肪含量较少，可省略此步。 （8）多糖-还原糖换算系数F值之计算解释： H+ C12H22O11+H2O 2C6H12O6 （双糖） （还原糖） H+ C18H32O16+2H2O 3C6H12O6 （三糖） （还原糖） H+ ∴ C6nH(10n+2)O(6n+1)+(n-1)H2O nC6H12O6 （多糖） （还原糖） 设：还原糖为A，多糖为B 解：含量A换算成含量B时 B C6nH(10n+2)O(5n+1) = A nC6H12O6 12×6n+1×(10n+2)+16×(5n+1) B = ×A n(12×6+1×12+16×6) 72n+10n+2+80n+16 = ×A 180n 162n+18 = ×A 180n 162n+18 当n>25时 ≌0.9 180n