氨甲喋呤联合咖啡因对骨肉瘤细胞株的作用观察

氨甲喋呤联合咖啡因对骨肉瘤细胞株的作用观察 毕业 【摘要】  ［目的］观察氨甲喋呤联合咖啡因对骨肉瘤细胞株的作用。［方法］以国人骨肉瘤细胞株OS-732细胞为研究对象，根据析因试验设计原因，设1无药组（阴性对照组），2咖啡因组，3氨甲喋呤组，4咖啡因、氨甲喋呤联合用药组（混合用药组）。培养1段时间后，分别采用MTT法细胞毒性试验和流式细胞仪（FCM），观察3组药物对细胞的毒性（用残存细胞吸光度A值示）及细胞周期的影响。［结果］FCM分析各组于48 h G2/M期细胞比例（%）为1组（23.210±0.416），2组为（23.120±0.440），3组为（28.770±0.531），4组（23.267±0.319），1组与2组间差异无统计学意义，其余各组间差异有统计学意义（P＜0.01）。各组残存细胞吸光度A值为1组（0.411±0.006），2组（0.401±0.006）；3组（0.304±0.007），4组（0.105±0.002），组间差异及交互作用有统计学意义（P＜0.01)。［结论］氨甲喋呤与咖啡因具有协同作用，可增加氨甲喋呤对骨肉瘤细胞株的抑制率。 【关键词】  骨肉瘤； 氨甲喋呤； 咖啡因； 肿瘤细胞,培养的     Abstract［Objective］To observe whether or not caffeine can improve the cyto-toxicity effect of methotrexate (MTX) on osteosarcoma cell line.［Method］Osteosarcoma cell(OS-732)were incubated with no drug,caffeine,MTX or MTX adding caffeine separately,and were named as control group,caffeine group,MTX group and mixing group respectively.The ratios of cells on G2M phase of each group were measured with flow cytometry after 48 h incubation and the cell inhibition ratios were measured with the MTT colorimetric analysis after 72 h incubation.［Result］The ratios(%)of cells on G2M phase were control group（23.210±0.416),caffeine group（23.120±0.440),MTX group（28.770±0.531）and mixing group（0.105±0.002）(P＜0.01,except control group between caffeine group),the absorbency of survival cell(A value)were control group（0.411±0.006),caffeine group（0.401±0.006）；MTX group（0.304±0.007）and mixing group（0.105±0.002）(P＜0.01).［Conclusion］Caffeine can improve the cyto-toxicity effect of MTX on osteosarcoma cell line.     Key words：osteosarcoma;  MTX;  caffeine;  tumor cell,incubation     肿瘤细胞在化疗药物作用后,有的会出现细胞周期受阻的现象，包括G1停滞，S期蓄积，G2M期阻滞等。G2M期阻滞被认为是细胞的1种保护性调节，可以使DNA受损的细胞获得充分的修复时间，从而顺利地进入下1个细胞周期，避免被诱导凋亡。咖啡因是近年来发现的肿瘤化疗增加剂，主要作用机理是缩短G2M期阻滞。氨甲喋呤作用于骨肉瘤细胞后会不会出现G2M期阻滞，加入咖啡因能否增加其细胞毒性，目前尚缺乏试验依据。     1  材料与方法     1.1  材  料     OS-732细胞株购于北京积水潭医院创伤骨科研究所，RPMI 1640干粉及胰酶购于美国Cibco公司，氨甲喋呤购于浙江万马药业有限公司，咖啡因购于美国Sigma公司，FCM美国Coulter公司生产，酶联免疫检测仪美国Coda公司生产，CO2孵箱Sheldon Manufacturing公司生产，倒置显微镜重庆光学仪器厂生产，96孔培养板Nunclon International公司生产。     1.2  方  法     1.2.1  细胞培养     细胞常规培养于体积分数为10%新生小牛血清（经56  ℃30 min水浴灭活）的RPMI 1640培养液中，其中含有青霉素100 IU/ml及链霉素100 μg/ml，在37  ℃体积分数为5%CO2、95%空气、饱和湿度的CO2孵箱内闭式培养。取传代后第3 d处于指数增殖期的细胞备用。     1.2.2  细胞处理     取生长良好的细胞，以少量胰蛋白酶将贴壁细胞消化、离心，倒去上清液，加入适量RPMI 1640培养液，用吸管反复吹打均匀制成细胞悬液。根据析因试验设计原理将细胞株分为4组，1组无药组（阴性对照组）；2组咖啡因组，培养液内加入咖啡因，浓度为5.0 mmol/L；3组氨甲喋呤组，培养液内加入氨甲喋呤，浓度为320 μg/ml；4组混合用药组，培养液内同时加入浓度为5.0 mmol/L的咖啡因与浓度为320 μg/ml的氨甲喋呤。同时调整细胞浓度为2×105/ml。各组细胞加入96孔培养板，每组设3复孔，每孔200 μl。置37  ℃体积分数为5%CO2、95%空气、饱和湿度的CO2孵箱内闭式培养，供测量各组药物的细胞抑剂率。同时各组取相同浓度的细胞悬液10 ml于培养瓶中在37  ℃体积分数为5%CO2、95%空气、饱和湿度的CO2孵箱内闭式培养供观察G2M期比例。     1.2.3  流式细胞仪（FCM）对细胞周期进行分析     将置于培养瓶内的各组细胞于48 h取出，以0.25%胰蛋白酶消化3～5 min，至贴壁细胞间出现筛状间隙为止。弃去消化液，加Hank’s液。用吸管将细胞自瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中。短时低速离心（1 000 r/min，5 min)。弃上清，加冷PBS（pH 7.4)，均匀吹打，并短时低速离心3次（1 000r/min,5 min)以去除悬液中的细胞碎片。再次加入冷PBS（pH 7.4)均匀吹打，制成单细胞悬液。将细胞液以500目尼龙网过滤，以去除重叠成团的细胞。调整细胞浓度为1×104/ml。在4  ℃冰箱内进行荧光染色后用流式细胞检测G2M期细胞百分比。每组细胞测3次，用SPSS 12.0统计软件，对结果进行方差分析。     1.2.4  MTT法测定各组细胞的A值及抑制率     72 h后将96孔板取出，每孔再加1∶2稀释的MTT应用液（5 mg/ml)20 μl,继续培养4 h后弃除上清液，于每孔中加入10%的2甲亚砜10 μl，振荡5 min，直到结晶完全溶解，液体呈蓝紫色，然后在酶联免疫检测仪上以570 nm波长测定吸光度（A）值。并可根据A值计算出各组的细胞抑制率。用SPSS 12.0统计软件，对结果进行方差分析，观察各组间的差异及药物间交互作用是否具有统计学意义。 2  结  果     2.1  FCM分析各组48 h G2M期细胞所占比例（表1）     1组与2组间差异无统计学意义，其余各组间差异有统计学意义（P＜0.01）。单独应用5.0 mmol/L的咖啡因对G2M期无明显影响，单独应用氨甲喋呤时出现G2M细胞比例增高，2者联合应用后G2M期细胞比例降低。表1  各组48 h G2M期细胞所占比例（略）     2.2  MTT法测定各组细胞72 h A值（表2）     各组间差异具有统计学意义（P＜0.01）。单独应用5.0 mmol/L的咖啡因对骨肉瘤细胞有轻微影响，320 μg/ml的氨甲喋呤对骨肉瘤细胞有较大抑制作用，2者联合应用后可明显减少A值，对肿瘤细胞抑制作用最明显。根据统计分析2者联合具有交互作用，差异有统计学意义（P＜0.01）。表2  MTT法测定各组细胞的A值（略）     3  讨  论     新辅助化疗的开展及新的细胞毒性药物的使用使包括骨肉瘤在内的许多肿瘤治疗有了明显改观〔1〕，尽管如此，肿瘤细胞对多种化疗药物产生耐药性仍是造成化疗失败的主要原因。传统上对肿瘤耐药及逆转剂的研究主要集中在细胞膜/核膜蛋白，即药物输出泵：如P糖蛋白（Pgp）、多药耐药相关蛋白（MRP）和肺耐药相关蛋白（LRP）。已有的逆转剂大部分是针对细胞P糖蛋白（Pgp)，通过抑制P糖蛋白（Pgp)对进入细胞内化疗药物的外排作用，提高细胞内化疗药物的水平，来增加化疗药物的杀伤作用。如钙离子通道阻滞剂，环孢酶素A及其衍生物，抗激素类化合物等，但其效果仍欠理想。     近年来研究表明，DNA作为多种抗癌药物攻击的靶分子，其损伤修复能力异常与肿瘤耐药性的形成有着密切关系。因此，从DNA损伤修复的研究入手，将为肿瘤治疗和耐药性逆转开辟新的途径。周期运转中的细胞有1种识别DNA损伤的能力，1旦出现DNA损伤，细胞周期就会受阻，包括G1停滞、S期蓄积和G2M期阻滞，从而给细胞修复提供足够的时间。细胞周期素(Cyclin)为重要的细胞周期蛋白的调控基因。目前发现的Cyclin有Cyclin A～H。Cyclin B主要出现在G2M期〔2〕。其表达的产物细胞周期蛋白与P34cdc2蛋白复合物被称为有丝分裂促进因子(maturation promoting factor,MPF)。在正常细胞，G2后期MPF氨基酸被磷酸化或去磷酸化，从而具有激酶活性，进而诱导1系列底物(如核层蛋白，H1组蛋白，核仁蛋白等)磷酸化，引导核膜崩解，染色质凝聚等有丝分裂所具有的变化。细胞通过抑制cyclin B表达，或抑制P34cdc2激酶活性，使细胞不能进行有丝分裂，从而产生G2M期阻滞。Yao SL〔3〕等发现，咖啡因有活化受抑制的MPF的能力。因此可以缩短甚至取消G2M期阻滞，从而可以逆转肿瘤耐药。该原理在国外已经临床使用，并取得不错的临床效果〔4〕。国内也开始对此进行研究。万双林〔5〕等发现安全浓度的咖啡因在骨肉瘤细胞株(OS-732)顺铂热化疗中具有增效作用，并发现咖啡因能促进经顺铂热化疗后的骨肉瘤细胞由G2/M期向G0/G1期移行，导致G2/M期缩短，细胞不能进行足够的DNA修复而进入分裂期，从而加速细胞死亡。李钧等〔6〕的研究表明，咖啡因有促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用。     目前在临床上使用更多的Rosen T12〔5〕化疗，其中氨甲喋呤作用于骨肉瘤细胞后，是否出现G2M期阻滞，咖啡因能否缩短甚至取消G2M期阻滞，2者联合应用能否增加肿瘤细胞抑制率，尚未见报道。作者根据析因试验设计原因，设置4个实验组，用FCM测定各组细胞于48 h G2M期比例，用MTT法来测定各组药物对肿瘤细胞作用72 h后残存细胞吸光度，结果显示，单纯应用5.0 mmol/L咖啡因，对肿瘤细胞G2M期比例无明显影响，对肿瘤细胞有轻微抑制；单纯应用氨甲喋呤，增加G2M期比例，对肿瘤细胞有抑制作用；2者合用后G2M期比例有明显降低，对细胞抑制明显。根据统计分析，2者间交互作用具有统计意义（P＜0.01）。本实验提示，氨甲喋呤与咖啡因联合，可以提高对骨肉瘤细胞株的抑制作用。但由于体外细胞培养不能模仿体内的3维结构，不能准确地反映药物在人体中的全面作用，因此，本试验结果需要更进1步的验证。   【参考文献】   〔1〕 郭全义，卢世璧，张莉，等.骨肉瘤的治疗及生存率的多因素分析［J］.中国矫形外科杂志，2006，14：497-499. 〔2〕 Sandberg Avery A,Bridge Julia A.Updates on the cytogenetics and moleculargenetics of bone and soft tissue tumors osteosarcoma and related tumors［J］.Cancer GenetCytogenet,2003,145:50-55. 〔3〕 Yao SL,Akhar AJ,Mckenna KA,et al.Selective radiosensitivization of p53 deficient cells by caffeine-mediated activation of p34cdc2kinase［J］.Nat Med,1996,2:1140-1143. 〔4〕 H ayashiM,Tsuchiya H,Yamamoto N,et al.Caffeine-potentiated chemotherapy for metastatic carcinoma and lymphoma of bone and soft tissue［J］.Anticancer Res,2005,25:2399-2405. 〔5〕 万双林，杨迪生，范顺武，等.咖啡因在骨肉瘤细胞株热化疗中增效作用的实验研究［J］.中华骨科杂志，2001,21:115-118. 〔6〕 李钧，裴仁模，张玉良，等.咖啡因促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究［J］.中国矫形外科杂志，2003，11：975-976.