还原型谷胱甘肽对培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响

还原型谷胱甘肽对培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响              作者：王进，王一彪，杨海英，赵丽丽，孔春妍 【摘要】  目的  研究还原型谷胱甘肽对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤的影响。方法  建立心肌细胞A/R损伤模型，随机分为５组：A组，正常对照组；B组，单纯缺氧/复氧(A/R低氧2h，复氧1h)组；C、D、E组为还原型谷胱甘肽处理组，加入还原型谷胱甘肽(GSH)分别使其终浓度为40、80、160 mg/L，后A/R。于复氧后测定各组培养液中乳酸脱氢酶(LDH)变化及细胞内丙二醛(MDA)含量和细胞存活率。结果  与正常组相比，单纯低氧/复氧组LDH漏出量、MDA水平显著升高(P<0.01)，细胞存活率显著降低(P<0.01)。与缺氧/复氧组比较，各谷胱甘肽处理组上述变化明显减轻(P<0.05)。结论  还原型谷胱甘肽对乳鼠心肌细胞A/R损伤具有保护作用，并具有浓度依赖性。     【关键词】  还原型谷胱甘肽  心肌细胞  缺氧  复氧     The effects of reduced glutathione sodium on anoxia/reoxygenation injuries of neonatal rat cardiomyocytes     【Abstract】  Objective  To study the effects of reduced glutathione sodium(GSH)  on  anoxia /reoxygenation injuries of neonatal rat cardiomyocytes.Methods  A/R model of myocardial cells of neonatal rats was established. The cells of neonatal rats  were randomly divided into five groups: control group(A): without any treatment; A/R group(B):2-hour anoxia followed by 1-hour reoxygenation; GSH conditioned group(C):adding GSH into culture medium till the final concentration of 40mg/L then A/R; GSH conditioned group (D):adding GSH into culture medium till the final concentration of 80mg/L then A/R; GSH conditioned group (E):adding GSH into culture medium till the final concentration of 160mg/L then A/R. The activity of lactate dehydrogenase(LDH)，the contents of cellular  melondadehyde(MDA) and the rate of cell viability of each group were evaluated after reoxyenation.Results  Compared with group A，the A/R group showed a great increase in levels of LDH，MDA and a decrease in the rate of cell viability(P<0.01). Compared with group B，the GSH conditioned groups significantly attenuated these changes(P<0.05).Conclusion  GSH could be a protective effect on A/R injury of neonatal rat cardiomyocytes in a concentration dependent manner.     【Key words】 reduced glutathione sodium cardiomyocytes anoxia reoxygenation     1  与方法     1.1  材料  实验用1～3天的Wistar大鼠乳鼠，山东大学实验动物中心提供，雌雄不拘；DMEM培养基由爱博公司出品；胎牛血清为美国　Gibco公司出品；胰酶为Sigma公司出品；丙二醛（MDA），乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒均购自南京建成生物研究所；还原型谷胱甘肽（古拉定）由 Laboratorio Farmaceutico C.T.S.R.1生产(批号：4027)。     1.2  乳鼠心肌细胞培养  无菌取出生1～3天大鼠乳鼠心脏，剪碎后用0.25％胰酶消化4～5次，取除第1次以外的上清，用含15％胎牛血清的高糖DMEM 中止消化，离心取心肌细胞沉淀，加入培养液，集中混匀制成悬液，应用差速贴壁法分离纯化心肌细胞，以5×105/ml的培养密度接种于２４孔培养板中， 在CO２培养箱中培养，48h后换液。     1.3  实验分组及操作程序  试验分为５组，每组重复８孔，A组为正常对照组（培养板置培养箱中持续孵育3h结束实验）；B组为单纯缺氧／复氧组（A/R  缺氧2h，复氧1h）：将培养板置于充有99.５％氮气的缺氧孵育器中37℃密闭培养2h，再以９5％氧气＋５％二氧化碳进行复氧1h；C组，D组，E组为古拉定处理组，加入古拉定使其终浓度分别为40、80、160mg/L。各组缺氧前、复氧前均给。     1.4  实验检测指标  (1)计数细胞搏动：在倒置显微镜观察并计数心肌细胞搏动的频率及节律。(2)细胞存活率计数：采用台盼蓝排斥法检测，各组取少许细胞混悬液，0.4%台盼蓝混匀2min，按白细胞计数法在光镜下计数蓝染细胞。台盼蓝摄取率＝蓝染细胞／（蓝染细胞＋未蓝染细胞）×100%。(3)LDH及MDA活性及含量测定：实验结束后按试剂盒说明测定。     1.5  学方法  数据以均数±差(x±s)     2  结果     2.1  古拉定对缺氧/复氧心肌细胞搏动的影响  正常培养对照组心肌细胞搏动相对恒定，节律规则；A/R组心肌细胞搏动频率减慢，搏动幅度减弱，节律不齐，有部分停搏，与对照组相比，差异有非常显著性（P<0.01)；各古拉定处理组明显逆转A/R 损伤造成的搏动频率和节律异常，与A/R 组比较差异有显著性（P<0.05)。     2.2  古拉定对心肌细胞缺氧/复氧损伤LDH及MDA的影响  结果表明，A/R心肌损伤是十分明显的，而古拉定能明显减轻这种损伤，古拉定处理组各观察指标均差异有显著性，因此提示古拉定对于缺氧／复氧心肌细胞损害具有保护作用，且存在量效关系，见表1。     表1  还原型谷胱甘肽对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤LDH及MDA的影响  (x±s)     注：B组与A组比较，P＜0.01；与B组比较，**P＜0.01；与B组比较，*P＜0.05     3  讨论     3.1  还原型谷胱甘肽对缺氧／复氧心肌细胞损伤的影响  大量研究表明，缺血再灌注期间大量氧自由基的产生可造成细胞损伤。氧自由基导致细胞损伤主要环节为作用于细胞外基质，使胶原和透明质酸崩解，使膜磷脂结构的多聚不饱和脂肪酸过氧化而直接损伤细胞膜；肌浆网和线粒体崩溃，心肌细胞在缺氧缺糖条件下，ATP产生减少，代谢障碍，代谢产物堆积，使膜稳定性降低，溶酶体释放，导致生物损伤、变性，使LDH释放在培养基中，同时再给氧时氧自由基增加，细胞膜受攻击，细胞膜损伤。细胞内LDH进一步增加，故LDH释放量是观测缺血再灌注损伤重要指标。脂质过氧化产物丙二醛(MDA)，其含量变化可作为评定自由基生成及对膜脂质双层结构破坏的指标。本实验从培养的未成熟鼠心肌细胞入手，排除了在体和离体灌注模型中神经、体液因素及其他混杂细胞因素的影响，直接利用还原型谷胱甘肽处理培养的未成熟鼠心肌细胞，结果发现还原型谷胱甘肽各浓度组均可降低缺氧／复氧损伤造成的心肌细胞死亡率，减少细胞内LDH漏出，减少细胞内MDA生成，且存在量效关系，表明还原型谷胱甘肽对未成熟鼠心肌细胞有保护作用。     3.2  还原型谷胱甘肽对缺氧／复氧心肌细胞损伤的保护机制  还原型谷胱甘肽(GSH)对清除自由基有重要作用，它是机体内一种重要的抗氧化剂，它能有效清除氧化产生的自由基，维持细胞内的稳定，并在使暴露于氧化环境的组织免受自由基损害方面起重要作用［4］。GSH在谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的作用下对有机过氧化物(ROOH)和无机过氧化物(H2O2)起重要清除作用，其还可以起维生素C还原剂的作用，使维生素C成为还原型而不断清除超氧自由基。近期有研究表明［5］，GSH可维持线粒体内膜巯基基团的还原状态。当GSH含量下降，内源性自由基攻击线粒体蛋白巯基的可能性增大，一方面使酶活性降低，影响线粒体氧化代谢的3个关键酶及传递链中酶的活性，NADH减少，ATP产生减少。另一方面，导致膜蛋白巯基氧化交联，构型改变，线粒体膜渗透性转运通道打开，钙释放增加，胞浆钙上升，激活细胞膜PLA2和中性蛋白水解酶(CANP)，导致细胞膜的损伤或死亡。本实验表明补充外源性GSH，对保护细胞膜的功能可能具有重要意义，对临床各种疾患造成的心肌细胞缺氧／复氧损伤有保护作用。     【】     1 Shigematsu  S，Arita M.Anoxia depresses sodium-calcium exchange currents in guinea