人类基因组的染色体作图

人类基因组的染色体作图 第八节 人类基因组的染色体作图 一、人类基因定位方法 人体基因组由22条常染色体、一条X染色体和一条Y染色体组成。 99有30亿(3×10)个核苷酸对，其中70,(约2×10)核苷酸对是单拷贝的DNA，包括编码蛋白质的结构基因，和一大批功能目前不明的DNA序列。此外是一些长度不等，拷贝数不同的重复序列，约占人类基因组30,。 20世纪90年代，遗传学进入了揭示人类自身的遗传本质的伟大时代。这个时代的标志是自1991年始的为期15年、投资30亿美元的全球性的跨世纪的规模宏大的“人类基因组”(human genome project,HGP)。这项巨大的研究计划的主要内容是测定和分析人类基因组DNA的全部核苷酸对的排列顺序，认读全部遗传信息。这项研究在短短的几年时间里取得了惊人的进展。至 1990年时，人体基因组中已经确定了在染色体上位置的基因座位共6552个，已经测定了核苷酸序列的基因 772个;发现了 2275个基因座有多态性。制备了各条染色体的探针共11852个，完成了500万个核苷酸对的序列测定，约占人类基因组全序列的2,1000。 1992年绘制了除Y染色体以外的23条染色体的遗传连锁图，美、法科学家绘制出了人的Y染色体长臂和第21染色体长臂的图谱。这两项成果无疑为按期完成人类基因组计划展示了美好前景。 1993年的资料报道，已定位4183个基因。到1994年上半年为止，已定位了人的3300个遗传标记，已完成基因组作图第一期工程目标的60,。 将人体的基因(或遗传标记，marker)定位在特定染色体上，有下列方法: (一)家系分析法通过分析、统计家系中有关性状的连锁情况和重组率而进行基因定位的方法。其中连锁分析法是最常用的家系分析法(pedigree method)。早在20世纪30年代，通过家系分析法已将人类的绿色盲、GPD、红色盲、血友病A的基因定位在X染色体上。 6 1(如果某性状只出现在男性，则可将决定这个性状的基因定位在Y染色体上。 2(X连锁基因的定位根据伴性遗传原理，男性的X染色体总是来自他的母亲，而这条X染色体又总是传给他的女儿，所以在正常情况下在X染色体上的基因不会出现直接从男性到男性的传递方式，而是隔代交叉遗传，亦即外祖父出现的某种性状在母亲身上不出现(当外祖母为纯合正常时)，往往出现在其外孙身上。如果两个性状都表现为隔代交叉遗传，则可以判定这两个性状的基因都在X染色体上，或可以说这两个基因是性连锁的。但这种方法不能确定其排列顺序和连锁强度。 3(外祖父法在确定X染色体的连锁关系后，进一步确定其相对距离，但这一步必须测定重组率才可完成。根据双亲的基因型来判断子代中哪些是重组体，哪些是亲本型才可计算重组率。对于X染色体上的基因来说，只需要知道母亲的基因型是否为双重杂合体(即两对基因都处于杂合状态)。根据双重杂合体的母亲所生儿子中有关性状的重组情况，就可以估计重组率，而母亲X染色体上的基因组成，可以由外祖父的表型得知，因此，这种基因定位的方法称为外祖父法(grandfather method)。就 Aa、Bb两对连锁基因而言，母亲为双重杂合体时，可能有两种连锁相:互引相AB,ab(或称顺式相——cis phase)和互斥相Ab,aB(或称反式相——trans phase)。 - 现以人类X连锁的色盲基因(a)和蚕豆病基因(GPD)(g)为例说明外6 祖父法: (1)若X染色体没有重组交换，则不论母亲是顺式还是反式杂合体，其儿子中的X染色体只有两种类型2)若母亲的X染色体的两个基因间发生了交换 根据外祖父的表型确定作为母亲的双重杂合体的连锁相(反式或顺式)，然后判断其儿子中的各种表型中哪种属于重组型，统计其重组体所占的比例，就可计算两个基因间的重组率，继而确定连锁基因间的相对距离。根据这种外祖父法测得色盲基因与GPD基因间的相对距离约为5cM(平6 均每20个儿子中有一个重组体)。 家系分析法在原则上也可用于常染色体上的基因定位。当已知某染色体上的某种标记与某基因间的连锁关系后，就可以用家系分析法将该基因 定位在这条染色体上。如决定Duffy血型的基因就是这样定位在人的1号染色体上的，这也是第一个用这种方法定位在常染色体上的基因。 (二)体细胞杂交定位法运用体细胞遗传学原理和体细胞杂交的新技术可以在离体条件下，应用细胞培养方法，研究体细胞融合、突变、分离以及连锁和交换等进行人类基因定位，绘制细胞学图，(其基本原理和主要方法将在第十二章作详细论述)。 1(克隆分布板法为了将某一个基因定位在某一条染色体上，必须建立包括人体24条染色体在内的一整套杂种细胞。其中每个杂种细胞都包括有一组人体染色体。这样的一套杂种细胞称为克隆分布板(clone panel)。利用这种克隆分布板，结合细胞遗传学和生物化学分析不同克隆中所含的人的染色体与特定基因产物之间的关系，就可将某一特定基因定位于某一染色体上。 例如有A、B、C三个杂种细胞克隆，每一克隆保留了4条人的染色体，分别含1号至8号染色体，各不相同。例如A克隆保留了染色体1、2、3、4，C克隆保留了第1、3、5、7号染色体(表3,11)。如果某一表型特征(可 因为以是酶的活性、蛋白质产物等)只见于A和C克隆而不存在于B克隆(B克隆不包含第3号染色体)，则可将决定这一表型特征的基因定位于人的第3号染色体上。 若另一待定基因的性状只在杂种细胞克隆A和B出现，而不见于C克隆，则该基因可定位在第2号染色体上。表3-11中的3个合适的克隆就 35可对8条(2,8)染色体作出判断，如果选择5个合适的克隆(2,32)就可对人类的32条染色体进行基因定位。为了避免各种误差，一般主张采用8个克隆进行基因定位测验。 体细胞中的基因连锁称为同线性(synteny)，用以区别于通过家系分析检出的连锁。在杂种细胞中两个基因同时出现或同时不出现表明这两个基因是同线的。 2(利用染色体异常将基因定位在染色体的具体位置 (1)基因剂量效应法:利用在具有某一特定染色体片段缺失或重复的病人或培养细胞内所观察到的基因剂量效应进行基因的区域定位。如果某一个基因产物的量与染色体上某一片段拷贝数目有明显的比例变化关系，就可将上述基因定位在这一染色体上或某一特定片段上。 例如，发现先天愚型患者(21三体)的超氧化物歧化酶1(SOD—1)的基因的活性为正常人的1.5倍，于是将编码SOD-1的基因定位在21号染色体上。 (2)染色体缺失定位法:此法无需从病人体内获得有关染色体异常的细胞，而是用人工方法在体外造成杂种细胞内特定染色体的不同位置发生断裂，形成各种类型的末端缺失，获得一套特定染色体的缺失杂种细胞，然后通过检测缺失杂种细胞内基因产物存在与否对许多基因进行区域定位。1986年复旦大学遗传研究所利用此法，将编码乙醇脱氢酶基因首先定位在4q21位置上。 此外，利用染色体缺失定位原理将编码红细胞酸性磷酸酶1(ACP1)的基因也成功地定位到2p23内。发现一个2号染色体短臂末端缺失的两个患儿，细胞学检查出一个患儿的断点在2p23末端部分，但来自这个孩子的培养细胞中有ACP1的活性，第二个孩子的染色体缺失是从2p23的最近一端直到末端，带这种染色体的细胞没有ACP1酶的活性，因此推断出ACP1的基因在2p23内，图3,28。 体细胞遗传学原理应用于人类基因定位技术所定位的基因必须在培养细胞中表达。只有编码参与细胞代谢的酶或细胞表面标记的基因才能满足以上要求。这项技术无法测定在培养细胞中没有表型表达的基因。重组DNA技术可以克服上述局限性，于是发展了以下新方法。 (三)DNA介导的基因定位随着重组DNA技术的发展，许多人体基因已经克隆，基因的结构和功能得到了详细的研究，并且发现了一大批存在于人体基因组的DNA随机片段和限制性多态位点。因而只需要通过分子杂交方法直接在染色体DNA水平上进行定位，但是仍然需要以体细胞遗传学技 术为基础。正是由于DNA重组技术与体细胞杂交技术的有机结合和巧妙应用，使定位基因的数量、定位的精确度、准确性和效率都大大提高。 1(克隆基因定位法 采用已克隆基因的cDNA探针与保留在杂种细胞内的人染色体DNA顺序进行分子杂交，来确定克隆基因所在的染色体。例如，要定位人体白蛋白基因，需要应用人体白蛋白基因cDNA做为探针，分别与经过Hind?酶切后的人体细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)杂交。杂交后的人体细胞DNA显示6.8kb带型，CHO细胞的DNA显示3.5kb带型。进一步在含有人体4号染色体的人—CHO杂种细胞中，用Hind?酶切后，再与白蛋白基因的cDNA探针杂交，如果出现6.8kb和3.5kb带型者称为阳性杂种细胞，而不含有人体第4号染色体的杂种细胞中只显示3.5kb带型为阴性细胞。由于人体白蛋白基因的cDNA探针的特异性，Hind?杂交带只出现在含有人体4号染色体的杂种细胞中，所以将此基因定位在4号染色体上。 又例如利用人的β-珠蛋白基因克隆DNA制备的探针与含有人不同染色体组合的细胞杂交，结果只有携带人11号染色体的细胞株才能与之发生杂交，于是就将该基因定位于11号染色体上。再进一步采用只含有人的11号染色体的CHO细胞株，诱变处理这些细胞株，再分离出丢失11号染色体不同片段的5个亚克隆。经过丢失性状和丢失带的组配可构建成11号染色体图，随后分别提取这5个携带有不同缺失的亚克隆DNA，并用限制酶EcoRI分别处理这些DNA样本，用凝胶电泳展示这些限制酶酶切DNA片段，再用已克隆基因探针与之杂交。结果表明，该基因探针可与亚克隆J1-23、J1-10和J1-11杂交，而与J1-9或J1-7亚克隆DNA不杂交。因此β-珠蛋白基因被进一步定位于J1,10断裂点与J1,9断裂点之间的间隔部位。 2(原位杂交法这是一种应用比较广泛的直接的基因定位方法，以标记(同位素、生物素或荧光染料)的探针直接同中期染色体进行原位杂交。现以14.9kb的顺序的定位为例说明此方法的基本原理。由于对于这个DNA片段的功能未知，但知道其在每个单倍体基因组中至少有1,2个拷贝。 3首先将14.9kb的顺序克隆到λ噬菌体上，用切口移位法标记H，将标准的显微制片上的人体中期染色体除去RNA，并将染色体DNA变性。然后将放射性标记的探针加到染色体制片上，16h保温后，洗去过量的未结合的DNA，最后，进行放射性自显影，统计最集中的放射性标记在第几号染色体。结果发现放射性标记集中在1号染色体短臂的端粒区，即在分带1p36处。荧光原位杂交结果显示的荧光亮点处即表示探针与染色体上的相应的结合处，表明克隆到的片段的位置。下表显示利用原位杂交法所定位的人体基因的基本情况。 二、人类染色体作图 先前介绍的是运用不同的技术把基因(或分子标记)定位在特定染色体上。这是基因组分析的第一步骤。第二层次的分析是具有较高分辨率的染色体作图，目的是确定一个基因在染色体图上的位置。 9 由前已知人类基因组有3×10bp，其中还包含着大量的重复序列。每条染色体都是一个巨大的DNA分子，例如X染色体的DNA分子就可能有1.6亿个bp。要在这样庞大的序列中确定某一特定基因或序列的位置并绘制出染色体图，就如在北京这样的大城市中寻找某一个人一样困难。因此，对人类基因组进行细致的划分和标记，正如对某一个街区的每一个小胡同都予以命名，每一院落都进行编号一样。差不多每500kb就设一个特异的DNA标记，以此来作为界定一个基因或序列的可辨认的界标(landmark)。限制性内切酶酶切位点，特定的DNA序列、RFLP、STS、EST等都是有用的遗传界(路)标。 (一)限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms，RFLPs)由于各种原因引起DNA内核苷酸排列顺序改变，当这种改变涉及到限制性内切酶识别位点时，利用限制性内切酶将DNA分子切割成许多长度不等的限制性片段，这些具有不同长度的限制性片段类型在人群中所呈现的多态分布现象就称为限制性片段长度多态性(RFLPs)。对于特定的DNA所产生的限制性片段是特异的，它能作为某一DNA(或具有这一DNA的个体)的特有的“指纹”。利用RFLPs作为遗传界标可以成为对人类基因组作物理图谱的基础。此外，当多态性顺序与人类遗传性疾病的基因连锁时，可作为遗传病的产前诊断或杂合子的标记，以及亲子鉴定的遗传分析等等。由于核DNA的RFLP不能直接观察，通常采 用一组组随机克隆的基因组片段作为探针，与同一种群或家族的不同个体的基因组的限制酶消化产物杂交，来检测各个片段。 RFLP作图经常用在一个特定个体，其结果作为其他个体作图的标准，同样方法应用到人类基因组分析上。例如收集来自61个正常家庭，每个家庭平均有8个子女，共计488个个体的RFLP图谱，作为整个人类基因组作图中的标准。一幅理想的有参考价值的RFLP图谱，其分辨率应在1cM左右。RFLP作为人类基因组的一种遗传标记，其中许多已经定位。在此基础上，只要证明某一基因与某一限制性片段多态性连锁紧密，则两者必定在同一染色体上相邻的位置。RFLP作图也是研究遗传性疾病的一种有力的综合研究手段。用RFLP制备的探针对患者家系的DNA样品进行分析，当大致证实某致病基因与RFLP探针检出的RFLP有连锁关系时，再逐步改用距离较小的探针对该区段作进一步分析，就可以逼近以致精确定位某致病基因的位置。至今已采用这种作图法对许多遗传病的基因进行了定位。 (二)数目可变的串联重复序列(variable number tandem repeat,VNTR)人类的VNTR座位上包含了不同数目的33bp的串联重复DNA，分布在整个基因组的不同位点上，这些重复成分构成了DNA指纹分析的基础。所谓DNA指纹是指限制性酶消化产物在southern杂交中的一系列带纹，不同带纹代表了在染色体不同位置上的不同长度的DNA序列。如果双亲在某一特定带纹上表现不同时，那么这种差异即变成了杂合位置并可用来作图。图3,29给出了一个简单的例子，图中所示的是亲本和5个子女的简化指纹。 所举的例子说明了连锁分析的方法。分子标记之间可以相互参照作图，也可以以表型效应的位点为参照。例如在上图中，F、H总在一起遗传，有可能连锁，母亲中A、B在子代中是分开来的(1、3、5有A，2、4 有B)，表现等位基因的分离，A、D不连锁，F和H，F和E在反式紧密连锁，P等位基因很可能与I、C连锁。 总之，RFLP和VNTR标记的发现，使得构建分辨率为1cM水平上的人类遗传图谱成为可能。但是厘摩(cM)仍是一个巨大的DNA片段，在人类染色体上估计有大约100万个bp(1000kb)的距离。 三、人类基因组的物理作图 最高层次上的基因组作图是对克隆化(也可以不是)的DNA片段进行物理作图(physicalmapping)，它具有最高的分辨率，因为这是靠直接操作DNA片段得到的。由于DNA是基因组的物理材料，所以这种方法称为物理作图。将各种遗传界标标明在DNA分子上，以物理长度单位——碱基对的数目作为彼此间的距离，无需作杂交分析子代性状，也无需作家系调查，用物理、化学技术直接确定界标在染色体DNA分子中的位置，因而可构成分辨率高的精确图谱。物理图谱有许多种，其中之一就是RFLP图谱，利用识别6个或4个碱基的限制性内切酶切位点的RFLP，可以构建分辨率高于8个切点的RFLP图谱，称为精细的限制图。此外，物理图谱还有: STS(sequence—tagged site专一序列位点)图STS一般是人类基因组中已知的、单拷贝的、片段长度通常为200,500 bp的短序列。由于它是特定的专一序列，在基因组中只出现一次，所以可作为专门的标记。此外，这种已知的序列易于用PCR扩增和检测。STS图就是将某一条染色体或某一区段内的STS按照它们在染色体上原来的排列次序和间距绘制成的图谱。人类最小的染色体之一的Y染色体已经得到了高分辨率的STS图谱，Y染色体的STS图谱是用YAC载体(人工酵母染色体)和缺失分析法获得的。 ESTs(expressed sequence tags表达序列标记或称表达的标签序列)图 是来自于cDNA文库的表达序列，长度一般在150,400 bp，它是STS的进一步发展。可作为遗传标记和检测基因组中的编码序列。根据EST序列，同样可作PCR扩增，如果扩增的模板DNA是只保留一条或若干条人的染色体的杂种细胞组合群，则可根据扩增的DNA带型，确定EST在哪条染色体或哪条染色体的哪一区段上，所构成的ETS图谱是一种物理图谱。 由于人类基因工程研究在世界范围内的大规模展开，基因组作图的特殊技术层出不穷。基因组测序是最终和最精确水平的基因组分析，最终，人类的整条染色体或整个基因组的序列可以通过对重叠克隆系的成员的测序来完成。无疑这项大科学的完成将宣告人类彻底认识自身的一个重大进步，同时也为揭开生命之谜，为诊断、预防和治疗遗传性疾病与肿瘤的伟大理想的最终实现奠定基础。