肝细胞癌p53和Rb基因改变的分析
肝细胞癌p53和Rb基因改变的分析 肝细胞癌p53和Rb基因改变的分析
严世荣阮绪芝朱明磊
V0ll41?
【摘要】目的研究肝细胞癌p53和Rb基因的突变特点和规律.探讨2种抗癌基因在肝癌发生过程中的作用及其与组织学
和预后的关系.方法应用PCR—SSCP和PCR—RFLP法检测65例肝癌p53基因第5--8外显子和Rb基因17和2l外显子的突
变率.结果肝癌中p53基因突变率为5o.8%,以缺失为主;Rb基因的突变率为38.5%;p53和Rb基因同时突变率为12.3%.
结论肝细胞癌中既有p53基因突变也存在Rb基因突变,两者在肝癌的发生中均有重要作用.p53和Rb基因同时突变与肝癌组
织学分级密切相关.
【关键词】肝细胞癌;基因突变;PCR一单链构象多肽;PCR.限制性片段长度多肽 中图分类号:R7357文献标识码:A文章编号:1001?5930c2001)014)041—03 p53andRbGeileAIterationsiit_HumanHepatocellularCarcinoma
YANShi—tong,RUANXu.zhi,ZHUMing-leiBicohemistryDepartmentofYuny~ngMedicalCollege,
Shiyan,4420(10
【Abstract】ObjectiveToexplorethecharacteristicsandregularpatternsoftheantlcancergenep53andRb
mutationsinhep?
atoeellularcmminoma(HCC)anditssignificance.MethodsPCR—SSCPandPCR—RFLPwreperformedin65casesofHCCform目?
suerment.fthenuta60nlate~ofp53geneexon5,6,7and8.and.ftheRbgeneexon17and21.Res
ultsThemutationlateofp53
岫
508%withdeletionasadominance,themutationlateofRbwas385%andthesimultaneousmu
tationboth12.3%Con- cluslonGeniemutationsofp53andRbare~nvolvedinHcc.sngg~tingthatbothplayapivotalr
oleinthedevelopmentofhepato—
cetlularcarcinoma.Furthermore.theirsimultaneousmutationiscloselyrentedtothehistolog
icalgradingofHcc
【Keywords】Hepatocellularcarcinoma;Genemutation;PCR—SSCP;PCR—RELP
(,r^PPract@a[Jo"r嘏2ofCancer,200l,16:041,043) 肝细胞癌(hepatocellularc~cinoma,HCC)是我国 常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈上升趋势.肝细胞 癌的发生是多基因突变的结果,p53抑癌基因的失活 在肝癌的发生,发展中起重要作用.而关于另一抑癌基 因Rb基因与肝细胞癌的关系却未见报道.我们检测 了65例HCC组织中p53和Rb基因突变的情况,并 探索了2种基因的改变与HCC生物学特性的关系. 1材料与方法
1.1材料
收集鄂西北地区1995年9月,1998年10月手术 切除的肝癌标本65例,每例同时取癌正常组织作为对 照,存放于一8o?备用.其中男性63例,女性2例, 年龄29,6O岁.主要试剂:PCR引物由中国科学院 上海植物生理研究所合成,SDS蛋白酶KTris为 Sigama产品,TaqE为Promega产品,HaeIII酶为 Boringer产品,其它试剂均为国产分析纯.主要仪器: DYY一?型垂直电泳槽为北京六一仪器厂产品.PCR 作者单位:442000鄙阳医学院生化教研室
仪为PE公司产品.
l2方法
l2.1DNA抽提肿瘤及癌旁组织各1g,分别加入
5m1消化液[100mmol/LNaCI.10mmol/LTris—HC1 (pH8.0),25mmol/LEDTA,0.5%SDS.1mg蛋白 酶K]55?消化过夜,酚.氯仿抽提DNA2,3次,酒清 沉淀DNA,双蒸水溶解(测O.D26o/0.D280比值在1.8 --
2.0之间).
1.2.2PCR扩增扩增p53第5--8外显子和Rb基 因17,21外显子.每次循环时间为90?45s,55? 45s,70?1rnin.
本实验所用的p53基因第5,8外显子及Rb基因 l7,21外显子的引物序列和扩增片段长度见表1. 1.23PCR.SSCP及银染法
灌制1O%的聚丙稀酰胺凝胶(含5%甘油),电泳 槽内添加TAE缓冲溶液,待胶凝固后取出梳子,冲洗 加样孔,预电泳1h,取PCR产物5,8,97?变性 10rnin,立即冰浴3rnin,加2FI缓冲溶液(95%甲酰 胺.2mmo[几EDTA,0.05%溴酚蓝.0.05%二甲苯 青)混匀,加样,8oV电泳3-4h.电泳结束后,凝胶在 固定液中(10%乙醇,0.5%冰乙酸)固定15rain,双蒸
42实用癌症杂志2001年1月第l6卷第】期ThePracticalJournalC
水漂洗2次,0.2%硝酸银染色10min,双蒸水漂洗2 次.显色液(1.5%氢氧化钠,04%甲醛)显色约lO rain直到样品信号呈褐色,凝胶背景呈透明的淡黄色, 双蒸水漂洗2次,用透明玻璃纸密封凝胶,自然晾干, 保存.
1.24PCRRFLP法
p53第7外显子249--250密码子含有HaeIlI酶切 位点,酶切后产生35bD和75bD2个片段.第7外显
子PCR扩增产物纯化后,加限制性内切酶HaeIlI2, 3u酶,37?保温4h,2%的琼脂糖电泳,溴乙锭染色, 紫外灯下观察结果.
表1PCR『物序列及扩增片段长度
外显于引物序列查:{l麈
2结果
2.1肝细胞癌p53基因突变率和突变特征 65例肝癌组织中有33例p53基因异常
(508%),其中25例p53基因缺失(385%),8例基 因碱基突变(12.3%),碱基突变的8例中外显子5,6, 78各有2…042例突变(第7外显子突变如图1),原 发性肝癌p53基因突变主要集中在第5,7,8外显子. 第7外显子Hae?酶切显示,有l例249位密码子发 生点突变见图2,第7外显子可能存在其它位点突变. 22Rb基因突变率和突变特征
65例肝癌Rh基因的17和21外显子均有突变, l3例l7外显子突变,lO例2l外显子突变. 2.3基因突变型与肝细胞癌转移的关系
65例肝细胞癌中p53和Rb基因突变共5O例,有 8例p53和Rb基因同时出现异常,均为低分化癌,且 早期均出现肝内转移.2种基因的突变与HCC的分 期关系不大.本组33例p53基因异常的病例中,有25 例伴肝内转移,3例伴肝外转移,转移率为84.8%.l7 例单纯Rb基因突变的病例中,有6例发生肝内转移 或肝外转移,转移率为353%.
圄l第7外显子PCR—sscP结果
1,4为Hcc组织第7外显于;5,8为癌旁组职 1234
围2突变第7外显子Hae?酶结果
1,2,4为Hae?酶切2条带;3为Hae?酶切1条带 3讨论
p53基因位于人类l7号染色体短臂(17p13),含 11个外显子,编码53kD核磷酸蛋白.野生型p53基 因具有阻止不正常细胞的增殖和诱导程序性死亡的作 用…,D53基因突变是HCC最常见的基因改变之一, 突变位点主要在第5,8外显子.乙型肝炎病毒 (rmv)和黄曲霉素B是肝细胞癌的2个重要致病因 素.我国启东市和南非地区的HCC存在第7外显子 249编码区特征性的突变,点突变率为50%l2一.这 一
改变与黄曲霉素Bt作用有关.本文报道的HCC, p53基因异常率为50.7%,以基因缺失为主,缺失率为 38.5%,第7外显子249密码子突变率仅为1.5%.鄂
西北地区属于低黄曲霉素Bt含量区,HCC的主要病 因为乙肝病毒感染,95%的HCC患者可检出HBV. HBV整合位点两端的DNA片段:一端为17号染色 体,另一端为l8号染色体.HBV整合引起细胞遗传 稳定性的破坏,导致DNA重排,整合位点细胞DNA 的丢失和染色体异常的改变.本组研究发现,HCC患 者p53基因突变以缺失为主,而第7外显子249密码 子特征突变率很低.
本组p53基因突变的病例848%发生肿瘤转移, 表明p53基因作为HCC转移的生物学标志有一定价 值.对于p53基因突变的这类患者采用野生型p53基 因替代突变型p53基因的阻断疗法,免疫疗法具有重 要意义.
Rb基因是人类发现并克隆的第1个抗癌基因L5j,
Rb基因的突变在肝癌的发生发展过程中的作用尚未
见报道,我们应用PCR.SSCP法检测的65例HCC
中,Rb基因突变率为38.5%,单纯Rb基因突变率为
26.0%(不伴p53基因突变),提示在HCC发生过程
中,虽然Rb基因突变不是主要的抗癌基因改变,但其
在非p53突变的HCC的发生中起着重要作用,是一不
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可忽视的基因.这些特征为进一步了解HCC的发生
机制提供了基础.p53和Rb基因同时突变与HCC组
织学分级密切相关,是其预后判断的1个重要参考指
标.
参考文献
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(收稿日期2000—04—24修回日期2000—09—15)
(上接第26页)
腺癌复治有效但价格较高,部分患者经济上不能承受.DDP, ADM均单药对乳腺癌有效且价格不高,本组总有效率为
62.5%,较2种药疗效相加的35%为高,看来有疗蚊协同增加 的作用.
DDP的主要不良反应是恶心,呕吐,肾毒性和周围神经毒 性J,ADM的主要毒性是骨髓抑制,脱发和累积量 >400mg/m2时的心脏损害l,2种药联合使用毒性不会相加. 给药前后各给恩丹西酮1次,加上使用地塞米松,甲氧氯普胺 加强止吐,全组仅有3例出现?度呕吐,其余为较轻的I,?度 恶心,呕吐,无难以控制的?度呕吐.化疗前后注意足够的液 体摄人量及使用利尿剂,以保证24h尿量不少于2500ml,因 此无肾损害病例.本组患者的ADM累积量均未达 4O0mg^n,治疗后复查心电图.无心脏损害表现有4例发生 ?度白细胞减少,给予粒细胞集落刺激因子治疗2--3天后,全 部恢复正常.全组患者均有脱发,较重的?度脱发占563% (9/16),但停药后都能逐步恢复.周围神经毒性发生率不高且 程度较轻,无须特殊治疗,停药后很快自行恢复. 大剂量DDP联合ADM治疗晚期乳腺癌有一定疗效,不 良反应不严重,经济花费不高,故认为有继续应用的价值.本 组病例数较少,有待进一步积累经验进行更详细的观察
. 参考文献
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(收稿日期如0o一06一l9恪回日期2000一加一30)