番茄花柄脱落区多聚半乳糖醛酸酶的提取与纯化1

番茄花柄脱落区多聚半乳糖醛酸酶的提取与纯化1 豆丁网:www.docin.com/week114 1 番茄花柄脱落区多聚半乳糖醛酸酶的提取与纯化 徐杨，齐明芳，李天来，许涛 沈阳农业大学园艺学院，辽宁省 设施园艺重点实验室，沈阳 (110161) E-mail:qimf@syau.edu.cn 摘 要:多聚半乳糖醛酸酶是植物器官脱落过程中的重要水解酶，本实验以 20µL•L-1 乙烯 处理的离体番茄花柄为试材，建立了与脱落相关的多聚半乳糖醛酸酶提取与纯化体系:以 50mmol•L-1 乙酸缓冲液(pH=5.5)为提取液，加入 0.1mol•L-1NaCl，1mmol•L-1DTT 提取效果 较好;将酶的粗提液低温浓缩后，经 Sephadex G-75 凝胶层析分离纯化，最佳条件为流速为 0.2mL•min-1、上样量为 3.5mL;再将凝胶层析分离的活性部分低温浓缩后，经 CM SepharoseCL-6B 离子交换层析再次纯化，流速 0.3mL•min-1、洗脱液 pH 值为 5.5 纯化效果好。结果 明 Sephadex G-75 凝胶过滤层析和 CM Sepharose CL-6B 离子交换层析是分离纯化番茄花 柄中 PG 的一种有效的方法。本实验为研究脱落相关酶的性质及活性调控提供了参考。 关键词:番茄;脱落;多聚半乳糖醛酸酶 中图分类号:Q556+.2;S62 1. 引言 器官脱落是植物界普遍发生的生理现象，是植物长期以来形成的一种对环境适应的能 力，而在农业生产中，如番茄栽培中的落花、落果问题成为影响番茄生产的重要因素。因此， 研究如何调控脱落过程具有重要意义。对于脱落进程调控研究，现已明确生长素抑制脱落， 而乙烯促进脱落，所以在生产中常采用植物生长调节剂来调控脱落，然而，由于植物生长调 节剂施用不当常会造成生理障碍和环境污染等问题。 研究结果表明，细胞壁降解酶系统是导致植物离区细胞发生分离的主要原因，其中多聚 半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase PG)是植物离区重要水解酶之一，其活性的升高与离区脱 [1-3]落进程中强度的降低相一致，并且位于细胞发生分离的部位。前人曾对番茄果实和冬枣 [4-6]果实中的多聚半乳糖醛酸酶进行过提取纯化，但其回收率都较低，并且大多研究者关注 的内容多集中在果实软化方面，而在器官脱落与多聚半乳糖醛酸酶的关系方面的研究尚鲜见 报道。本文对番茄离体花柄中脱落相关的多聚半乳糖醛酸酶进行了分离纯化，并在前人的基 础上加以改进，简化了纯化的步骤，提高了回收率，为番茄花柄脱落区多聚半乳糖醛酸酶的 性质与活性调控奠定了基础，进而为从蛋白水平调控番茄花柄脱落进程的研究提供了参考。 2. 材料与方法 2.1 材料 供试番茄(Lycopersicon esculentum L.)品种为辽园多丽，日光温室栽培。参照王彦昌 [7]等的方法，于番茄开花当天上午采样，剪取各株相同或相近位置花序上正常开放的花，放 入盛在蒸馏水的烧杯中，立即带回实验室，用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗 3 次，剪去花柄 -1 上端花冠，只留花柄部分，插入装有 1,琼脂培养基的培养皿中。并将其放入 20µL?L乙烯 培养箱中，于 25?培养。待花柄离区发生分离时，取脱落区上下 1cm 处的花柄作为酶提取 材料，贮藏于-70?冰箱中备用。 1 本课题得到教育部博士点基金(番茄花柄脱落相关酶—纤维素酶与多聚半乳糖醛酸酶的性质及活性调控 研究(20040157004))的资助。 - 1 - 豆丁网:www.docin.com/week114 2.2 方法 2.2.1 PG 提取纯化过程 取 1.00g 左右离区组织，加入 5mL 缓冲液进行研磨，12000g，4?离心 20 分钟，取上 清液经低温浓缩后，上样于 Sephadex G-75 凝胶过滤层析柱，柱长 100cm，直径 1.6cm。以 乙酸缓冲液(50mmol/L)作为洗脱液，洗脱后收集有活性的部分经低温浓缩，经 CM Sepharose CL-6B 离子交换层析再次纯化，柱长 30cm，直径 2.6cm。收集有活性的部分进行 PG 活性和 蛋白含量的测定。各处理重复 3 次，数据由 DPS 软件进行处理。 2.2.2 不同提取缓冲液体系对 PG 提取活性的影响 -1-15 种缓冲液分别为乙酸缓冲液(pH5.5，50 mmol?L)、柠檬酸缓冲液(pH6.0，50 mmol?L)、 -1-1磷酸缓冲液(pH6.5，50 mmol?L)、Tris-HCl 缓冲液(pH7.5, 50 mmol?L)、硼酸缓冲液(pH9.0， -150 mmol?L)，分析不同提取缓冲液下的 PG 活性。 2.2.3 不同离子强度对 PG 提取活性的影响 -1 在提取缓冲液中分别加入 0、0.1、0.3、0.5 mol?L的 NaCl，分析不同离子强度下的 PG 活性。 2.2.4 不同保护剂对 PG 提取活性的影响 -1 -1 在提取缓冲液中分别加入 1m mol?LEDTA、1mmol?L二巯基乙醇、20% 甘油、 -1 1mmol?LDTT、1%Triton X-100，分析不同助剂下的 PG 活性。 2.2.5 凝胶过滤层析 -1-1将浓缩的酶液上样于 Sephadex G-75 凝胶过滤层析柱，采用 0.1mL?min、0.2mL?min、 -1 0.3mL?min三种流速，1.5mL、2.0mL、2.5mL 三种上样量，比较回收率和纯化度，探索适 合 PG 纯化的凝胶层析条件。 2.2.6 离子交换层析 将经凝胶层析所得酶液，经冻干机低温浓缩后，上样于乙酸缓冲液平衡的 CM Sepharose -1-1-1 CL-6B 阳离子离子交换层析柱，采用 0.2 mL?min、0.3 mL?min、0.4 mL?min三种洗脱流 -1速，pH5.0、5.5、6.0 三种乙酸缓冲液(50 mmol?L)分别对样品进行洗脱，比较回收率和 纯化度，探索适合 PG 纯化的凝胶层析条件。 2.2.7 PG 活性测定 取 0.5ml 酶液，加入 0.5ml 0.25%的多聚半乳糖醛酸，于 40?培养箱中反应 3h，采用 [8]DNS 法测定反应生成葡萄糖的含量。一个酶活性单位定义为:在 40?、pH5.5 的条件下， 每小时产生 1µmol 葡萄糖所需的酶量。 2.2.8 可溶性蛋白含量测定 采用 G250 法测定[9]。 3. 结果与分析 3.1 PG 提取条件对其活性的影响 3.1.1 不同提取缓冲液对 PG 抽提活性的影响 从图 1 可以看出，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液提取的 PG 活性最高，对提取液中蛋 - 2 - 豆丁网:www.docin.com/week114 白含量除乙酸-乙酸钠缓冲液外无显著差异，而提取液中酶的比活以乙酸-乙酸钠缓冲液最高，说明其对 PG 的选择性较高。根据以后纯化步骤的需要，我们选择乙酸盐缓冲液作为 PG 的提取缓冲液。 5 0.10 a a aa a 0.08 4 c b 0.06 b 3 PG activity(U) bc 活性 0.04 PG2 0.02 蛋白含量1 protein contents (mg.g-1 FW) 0.00 乙酸 硼酸 柠檬酸磷酸Tris- 0 HCl Tris -HCl 乙酸 不同硼缓酸冲液柠檬酸 磷酸 不同缓冲液different buffer different buffer PG活性 PG activity(U)0.03 a a 0.02 b c c specific activity (U?mg) 0.01 比活 0 Tris- 乙酸 硼酸 柠檬酸 磷酸 HCl 不同缓冲液 different buffer 图 1 不同提取缓冲液下的 PG 提取活性 图中不同小写字母表示不同处理间差异达 5%显著水平,下同 Fig.1 Different buffers on PG extraction activity Different normal letters among the same times of treatment mean significant difference at 5% level. They mean the same below 3.1.2 不同离子强度对 PG 活性的影响 -1 从图 2 可以看出，在乙酸缓冲液中加入 NaCl 后，显著影响了 PG 的提取活性，0.1 mol?L的 NaCl 提取 PG 活性最高，高浓度的 NaCl 反而抑制了 PG 活性，达到了显著性差异，说明 高浓度的盐不适合于该酶的提取。 0.20 a 0.15bb 0.10 c 0.05 0.00 0 0.1 0.3 0.5 NaCl浓度 NaCl concentration(mol?L-1) 图 2 不同浓度 NaCl 下的 PG 提取活性 Fig.2 Different NaCl concentration on PG extraction activity - 3 - 豆丁网:www.docin.com/week114 0.10 aba ab ab ab 0.08 b 0.06 PG activity (U) 活性0.04 PG 0.02 0.00 CK EDT A 20%DT T T rit on 巯基乙醇 油 甘 different composit ion 不同成分 图 3 缓冲液中加入不同成份对 PG 提取活性的影响 Fig.3 Effect of different composition on PG extraction activity 3.1.3 不同蛋白保护剂对 PG 活性的影响 图 3 表明，在乙酸-乙酸钠(pH=5.5)缓冲液中加入 EDTA、二巯基乙醇、20%甘油、 DTT、Triton X-100，除 20%甘油外，均不同程度地提高了 PG 的活性，其中 DTT 的效果最 好。 3.2 方法和条件对 PG 纯化效果的影响 3.2.1 凝胶过滤层析不同洗脱流速对 PG 纯化效果的影响 -1-1-1 在上样量为 3.5ml，流速分别为 0.1mL?min、0.2mL?min、0.3mL?min时对 PG 的分离 效果如图 4 所示，不同流速的凝胶层析都能得到三个蛋白峰，其中第二个峰为 PG 的活性高 -1 峰。当流速为 0.1mL?min时，峰能完全分开，但由于洗脱流速太慢，洗脱活性和回收率都 -1 比较低(表 1)，而流速为 0.3mL?min时，出现蛋白峰的重叠现象，未能将活性蛋白与杂 -1 蛋白分开，流速为 0.3mL?min时蛋白分离的较好，酶的比活性与回收率都较高，所以流速 -1 为 0.2mL?min为凝胶过滤层析的适宜流速。 ivit yAbsorbency Act 吸光度酶活性3.0 0.5 3.00.53.00.5 A BC 2.5 2.5 2.5 0.4 0.4 0.4 2.0 2.0 2.0 0.3 0.3 0.3 OD 1.5 1.5 1.5 (U) 0.2 0.2 0.2 2801.0 1.0 1.0 0.1 0.1 0.1 0.5 0.5 activity0.5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 15 90 165 240 315 390 15 75 135 195 255 315 375 315 375 15 75 135 195 255 Elut ion t ime (min) 洗脱时间PG活性PG 图 4 不同流速下 PG 在 Sephadex G-75 柱上的洗脱图-1 -1 -1A. 流速 0.1mL?minB. 流速 0.2mL?minC. 流速 0.3mL?min Fig.4 Elution profiles of PG on Sephadex G-75 with different flow rate -1 -1 -1A. Flow rate at 0.1mL?minB. Flow rate at 0.2mL?minC. Flow rate at 0.3mL?min - 4 - 豆丁网:www.docin.com/week114 表 1 不同洗脱流速下的 PG 活性 Table 1 Eluted activity of PG on Sephadex G-75 column at different flow rate 流速上样活性洗脱活性蛋白含量酶比活性回收率 Flow rate Crude activity activity protein Specific activity Ratio -1(ml/min) (U) (U) (mg) (U?mg) (%) 0.1 1.03 0.48 0.039 12.31 46.60 0.2 1.03 0.51 0.034 15.00 49.51 0.3 1.03 0.49 0.036 13.61 47.57 3.2.2 凝胶过滤层析上样量大小对 PG 纯化效果的影响 -1在流速为 0.2mLl?min，上样量分别为 2mL、3.5mLl 和 5mL 时 PG 的纯化分离效果如图 5 所示，上样量为 2mL 和 3.5mL 时，目的蛋白与杂蛋白的分离效果较好，而上样量为 5mL 时，蛋白峰出现重叠现象，未能将目的蛋白与杂蛋白分开，但是与 2mL 的上样量相比，3.5mL 时酶的比活和回收率都较高(表 2)，所以 3.5mL 上样量适合凝胶过滤层析对 PG 的分离。 0.53.03.0 0.5 0.3 2.5C A B2.5 0.4 2.5 0.4 2.0 (U) 2.0 0.2 0.3 0.3 1.5 activity 0 OD 0.2 0.2 1.0 281.0 1.0 PG0.1 0.1 0.1 0.50.5 0.5 活性 PG0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 15 75 135 195 255 315 375 15 90 165 240 315 390 15 75 135 195 255 315 375 Elut ion t ime (min) 洗脱时间 A. 2mL B. 3.5mL C. 5mL 图 5 不同上样量下 PG 在 Sephadex G-75 柱上的洗脱图 Fig 5 Elution profiles of PG on Sephadex G-75 with different sample volume 表 2 不同上样量下的 PG 活性 Table 2 Eluted activity of PG on Sephadex G-75 column at different sample volume 上样量上样活性洗脱活性蛋白含量酶比活性回收率Sample volume Crude activity activity protein Specific activity Ratio -1(ml) (U) (U) (mg) (U?mg) (%) 2.0 1.03 0.37 0.031 11.94 35.92 3.5 1.03 0.51 0.034 15.00 49.51 5.0 1.03 0.54 0.039 13.85 52.43 3.2.3 离子交换层析洗脱缓冲液不同 pH 值对 PG 纯化效果的影响 洗脱缓冲液 pH 值与吸附被分离物质的量和吸附程度有关。从图 6 中可以看出，不同流 速条件下的离子交换层析都能得到两个蛋白峰，其中第一个蛋白峰为活性的高峰。流速为 -10.3mLl?min,洗脱缓冲液 pH 值为 6.0 时，目的蛋白与杂蛋白未能分开，当 pH 为 5.0 时，尽 管分离效果很好，但样品洗脱活性较低，回收率也较低(表 3)，而 pH 值为 5.5 时，目的 蛋白与杂蛋白得到很好的分离，并且酶的比活性与回收率也较高，所以缓冲液 pH 值为 5.5 时，洗脱的效果最好，适合离子交换层析对 PG 的分离。 - 5 - 豆丁网:www.docin.com/week114 Activity Absorbency 酶活性吸光度 A0.2 2.0 2.0 0.4 2 0.3 City 1.5 /U1.5 1.50.3 活性PGPG activ 0.2 B 1.0 0.1 1 1.0 0.2 280 O D 0.1 0.5 0.5 0.10.5 活性PG PG activ 0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 15 60 105 150 195 240 15 75 135 195 255 15 60 105 150 195 240 285 315 285 Elut ion t ime (min) 洗脱时间 A. pH5.0 B. pH5.5 C. pH6.0 图 6 不同 pH 值下 PG 在 CM Sepharose CL-6B 柱上的洗脱图 Fig 6 Elution profiles of PG on CM Sepharose CL-6B with different pH 表 3 不同 pH 值下的 PG 活性 Table 3 Eluted activity of PG on CM Sepharose CL-6B column with different buffer 上样活性洗脱活性蛋白含量酶比活性回收率pH 值 Crude activity activity protein Specific activity Ratio -1(U) (U) (mg) (U?mg) (%) 5.0 1.05 0.29 0.025 11.60 27.62 5.5 1.05 0.37 0.026 14.23 35.24 6.0 1.05 0.32 0.025 12.80 30.48 3.2.4 离子交换层析洗脱流速对 PG 纯化效果的影响 -1-1-1 如图 7 所示，0.2mL?min、0.3mL?min、0.4mL?min三种洗脱流速的峰形基本一致， -1 -1 都得到了两个蛋白峰，流速为 0.2mL?min时峰形宽，分离效果好;0.4mLl?min时分离效果 -1 则较差，峰未能完全分开，不能有效的将杂蛋白分离开;而尽管流速为 0.2mL?min时分离 -1 效果好，但比活和回收率低(表 4)，所以，流速为 0.3mL?min为该离子交换层析的适宜 流速。 Activity酶活性 Absorbency 吸光度 2.0 0.3 2.0 0.3 0.3 2.0 (U)B C 1.5 A1.5 ity 0.2 1.5 0.2 0.2 1.0 1.0 1.0 280 OD 0.1 0.1 0.5 0.1 0.5 0.5 0.0 0.00.00.00.0 0.0 15 60 105 150 195 240 1 240 285 5 60 105 150 195 285 15 60 105 150 195 240 285 Elut ion t ime (min) 洗脱时间 图 7 不同流速下 PG 在 CM Sepharose CL-6B 柱上的洗脱图 -1 -1 -1A. 流速 0.2mL?minB. 流速 0.3mL?minC. 流速 0.4mL?min Fig.7 Elution profiles of PG on CM Sepharose CL-6B with different flow rate -1 -1 -1A. Flow rate at 0.2mLl?minB. Flow rate at 0.3mL?minC. Flow rate at 0.4mL?min - 6 - 豆丁网:www.docin.com/week114 表 4 不同洗脱流速下的 PG 活性 Table 4 Eluted activity of PG on CM Sepharose CL-6B column at different flow rate 流速上样活性洗脱活性蛋白含量酶比活性回收率 Flow rate Crude activity activity protein Specific activity Ratio -1(ml/min) (U) (U) (mg) (U?mg) (%) 0.2 1.02 0.28 0.021 13.33 27.45 0.3 1.02 0.35 0.024 14.58 34.31 0.4 1.02 0.29 0.023 12.61 28.43 3.2.5 PG 纯化体系的建立 经 Sephadex G-75 层析、CM Sepharose CL-6B 层析和浓缩等方法从番茄花柄中纯化出了 PG，各纯化步骤所得到的纯化倍数及回收率见表 5，根据分子量的不同，通过 Sephadex G-75 层析柱的分级分离，PG 的纯化倍数达到了 17.38 倍，回收率为 63.92%;然后将有活性的部 分浓缩后再经 CM Sepharose CL-6B 离子层析柱，最终纯化倍数达到了 30.85 倍，回收率为 52.58。 表 5 番茄花柄中 PG 的纯化 Table 5 Purification of PG from tomato 蛋白量 PG 活性 比活性 纯化倍数 纯化步骤 回收率 PG Protein(mg Specific Purification Purification Steps ratio(%) -1 activity(U) activity(U?mg) fold ) Crude Extract 1.121 0.97 0.87 1 100 Sephadex G-75 0.041 0.62 15.12 17.38 63.92 CM Sepharose CL-6B 0.019 0.51 26.84 30.85 52.58 4. 结论与讨论 目前对植物类 PG 分离纯化的研究较少，沈全光等对番茄果实中的 PG 进行了分离纯化 [4]-1 和性质的鉴定，用充分成熟的番茄果皮组织，在 pH5.5 和高盐浓度 1.7 mol?LNaCl 介质 中提取的粗酶液，经过硫酸铵分级沉淀，阳离子交换柱层析和葡聚糖 G-75 凝胶过滤两次， 获得具有高纯度和较高活性的酶蛋白。本实验在提取过程中省去了硫酸铵分级沉淀的步骤， 采用了低温浓缩的方法，减少了蛋白的损失;在纯化方面，经过 Sephadex G-75 层析和 CM Sepharose CL-6B 层析各一次，减少了一次凝胶过滤，提高了回收率。于艳军纯化、鉴定了 [5]冬枣果实中的 PG，认为高浓度的盐有利于冬枣果实中 PG 的抽提。本实验的结果表明高 盐浓度降低了 PG 的活性，这与沈全光、于艳军的结果不同，造成这种差异的原因可能是本 研究主要提取纯化的为外切多聚半乳糖醛酸酶，而前人提取的为内切多聚半乳糖醛酸酶，有 关此类问题有待进一步研究。 凝胶过滤层析的流速和加样体积对分离效果的影响较大。较缓的流速可使蛋白样品与 凝胶基质充分平衡，达到理想的分离效果，但是流速过低会造成样品在凝胶床内的横向扩散 增大，使峰宽变宽，降低分辨率;高流速容易引起洗脱峰的重叠，影响分离效果。加样体积 过大，会造成平台洗脱峰或相邻峰的重叠，影响分离效果;加样过少，目的蛋白组分的收集 量少、稀释倍数增大、浓度低，降低实验效率。结果表明 Sephadex G-75 凝胶柱流速为 0.2 -1mL?min、上样量为 3.5mL 时，分离效果较好，回收率较高。离子交换层析的效果与洗脱液 -1pH 值和洗脱流速等有关。CM Sepharose CL-6B 离子交换层析柱流速为 0.3 mL?min、洗脱 液 pH 值为 5.5 时，洗脱效果较好，回收率高。这于于艳军的研究结果基本相一致。但经 - 7 - 豆丁网:www.docin.com/week114 Sephadex G-75 凝胶过滤层析和 CM Sepharose CL-6B 阳离子交换层析后，纯化倍数较低，分 别为 17.38 倍和 30.85 倍，这可能与番茄离区中 PG 酶含量较低有关。 从分离纯化效果来看 Sephadex G-75 凝胶过滤层析和 CM Sepharose CL-6B 离子交换层 析是分离纯化番茄花柄中 PG 的一种有效的方法，为番茄花柄脱落区多聚半乳糖醛酸酶的性 质与活性调控奠定了基础。 参考文献 [1] BONGHI C, RASCIO N, RAMINA A, CASADORO G. 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(in Chinese) - 8 - 豆丁网:www.docin.com/week114 Purification and characterization of a polygalacturonase from tomato pedicel abscission zone Xu Yang，Qi Mingfang，Li Tianlai， Xu Tao Liaoning Key Laboratory of Protected Horticulture，College of Horticulture，Shenyang Agricultural University，Shenyang(110161) Abstract Polygalaturonase is an important hydrolase during abscission process. In this experiment，the pedicels-1 explants of tomato in vitro treated with 20µL•Lethylene were used to extract and purify the ows: 50mmol • polygalacturonase related to abscission. The extraction and purification system as foll-1 -1 -1 Lacetate buffer (pH = 5.5) for the extract buffer by adding 0.1 mol?LNaCl and 1mmol?LDTT; the enzyme extracts then concentrated and purified by Sephadex G-75 chromatography gel with the -1 optimum condition of 0.2 mL?minflow rate and 3.5mL sample volume; then the part with high polygalacturonase activity was concentrated and CM Sepharose CL-6B ion exchange -1 chromatography was used with 0.3 mL?minflow rate and elute pH5.5. The result showed that Sephadex G-75 chromatography gel and CM Sepharose CL-6B ion exchange chromatography are the availability methods to purification and characterization of a polygalacturonase from tomato pedicel. The experimental laid the reference for the study of character and activity regulation of polygalacturonase related to abscission. Keywords:Tomato;Abscission;Polygalaturonase - 9 -