胚胎实验室操作手册

胚胎实验室操作手册胚胎实验室每日工作流程胚胎实验室平安与质量控制实验室平安与感染控制实验室必须有完善的平安和防患措施，必须有关于火、电意外引起紧急情况时的应急，实验室人员必须了解灾情中的救援措施。为防止停电影响设备正常运转，应备有双重供电系统，或不间断电源〔UPS〕，以确保二氧化碳培养箱和显微镜等关键设备在意外停电时满足正常工作。所有体液样本〔精液、血液、卵泡液等〕必须视同潜在污染源，所有的供体组织和体液应有适当的传染病监测。实验室工作人员应清楚乙肝疫苗的必要性并接受乙肝疫苗接种。特别小心不要被那些受体液污染的仪器或设备意外损伤。防止将体液溅到眼中。当接触体液或盛放体液的容器时，应带一次性无粉橡胶或塑料手套。离开实验室时，将手套脱下丢掉，决不可重复使用。离开实验室时，脱掉实验室衣服，不能穿着出入公开场所或餐厅。被体液沾染时，必须马上用消毒液或肥皂清洗。接触配子和胚胎的耗材必须使用一次性用品。因体液溢出污染实验室设备时，应在操作完成后用75%酒精消毒。在实验室体液操作中必须使用机械抽吸装置，禁止用口吸。所有操作步骤和体液处理应小心，尽量减少浮滴和烟雾生成。例如离心时必须用带盖的试管。实验室中严禁吃东西、吸烟等。所有丢弃的体液和用后的一次性物品必须按污染物品处理。实验室质量控制培养箱的质量控制专人管理，每日确认以下各项内容并予以：CO2的控制：6%±0.2%；温度的控制：37℃±0.2℃；湿度：大于80%RH，水盘内水的深度始终保持在大约1cm以上。培养箱内的水盘使用超纯水，根据不同培养箱要求定期更换，换水当天培养箱不放卵子或胚胎；培养箱显示器温度与培养箱内温度计的温度应一致。不一致时应及时调整校正。消毒清洁：每隔3个月消毒培养箱。消毒时拆卸培养箱内所有钢架，以75%酒精和超纯水分别擦拭消毒，再送高压消毒。培养箱内壁以75%酒精和超纯水分别擦拭。消毒清洁完成后，需开机运行稳定前方可使用。培养用气体的质量控制使用有合法资格的气体供给厂家，气瓶使用前需检查是否有合格证标签。使用医用高纯度CO2〔99.995%以上〕培养胚胎。每天记录气瓶的压力，定期检查气瓶有无漏气并更换培养箱外气体过滤器。CO2进入培养箱之前，必须经过CODA过滤器对CO2进行过滤。CODA过滤器应定期更换，根据供气量，每3-6个月更换一次。CO2分压应与培养箱要求的压力相符，当气瓶CO2气体接近用完时，应及时更换新的气瓶，记录更换气瓶时间。UPS的质量控制重要仪器如培养箱、显微镜、冰箱等必须连接到UPS上，每日观察UPS工作状态，如有异常及时找工程师维修。液氮罐的质量控制胚胎冷冻液氮罐需每天查看外观，每周至少两次检测剩余量，按时添加液氮，使液氮深度保持在25cm以上。液氮运输罐需专人更换。液氮罐应存放于固定位置。液氮罐应每3年进行一次校验。超净工作台的质量控制超净工作台层流系统提供洁净环境，用于胚胎培养的准备工作，如培养液配制、培养皿准备、胚胎操作等，不能进行其它存有污染性的操作。超净工作台应于每天工作前提前30分钟开启，台面温度应稳定于设定的温度。超净台每年应至少检测一次洁净度。实验室层流系统的质量控制体外受精实验室温度维持在24±2℃之间，湿度在40%以上，每日观察并记录温度和湿度，如果波动过大及时进行调整，假设有异常，尽快维护和处理。在有胚胎的情况下不能关闭实验室净化空调系统。实验室净化空调系统由专业人士检测维护，新风口滤网每2-4周更换一次，回风口滤网每月更换一次，初效过滤器每1-3个月更换一次，中效过滤器每3-6个月更换一次，高效过滤器每1-2年更换一次，并做好维护检测记录。如遇特殊情况，及时更换。每日观察并记录胚胎实验室与冷冻间、缓冲间、移植手术室及取卵手术室之间的压差。如果压差＜5Pa，应查找原因，及时检修和维护。每月进行实验室空气细菌培养。冰箱的质量控制专人管理，每天检测并予以记录。1.冷藏层：28℃；2.冷冻层：-15-20℃。热台的质量控制专人管理，每天操作前检测并予以记录。要求：38℃±0.5℃。实验室仪器设备的使用和维护建立设备常规操作程序，并严格按照操作程序执行。保存各种设备的使用文件。仪器设备的维修保养应严格按照规定的程序进行，有关人员在进行保养、调校和维修工作以前，应首先熟悉仪器的性能、结构、使用方法和保养、调校方法，以及维修程序。仪器设备一旦出现异常或发生故障，使用人员应立即关机观察，防止事故扩大，及时向实验室负责人或中心负责人汇报，然后通知修理人员组织维修。定期由专业技术人员对仪器、设备进行校验，建立设备使用档案。培养基、耗材管理试剂和耗材的订购应选择国内同行公认的有资质的公司和品牌。培养基管理登记：培养基到货时需立即清点、核对、记录到货时间、试剂名称、编号、批号、数量、收货人等，并注明冷藏品到货时，包装和储存条件是否到达要求。保存：所有培养液在规定条件下保存至有效期。试剂分装后在各分装容器上做明显标志，标明名称、有效期、分装时间，并用封口膜密封容器口。使用前准备：培养液使用前必须过夜平衡。平衡方法：使用前一天下午根据需要放入37℃、6%CO2培养箱平衡备用；含MOPS的培养基放入不通CO2气体的37℃培养箱内平衡备用。保质期：矿物油及培养基在有效期内使用。耗材管理耗材到货时需立即清点、核对，记录到货时间、名称、编号、批号、数量、收货人等。使用前必须检查有效期和包装是否完好无损，不使用过期用品及包装破损用品。所有耗材送至实验室之前，必须用75%乙醇擦拭外包装，待75%乙醇挥发后放入物品柜。对产品质量有疑问时，立即停止使用并报告质控科。每季度清点各种耗材，及时补充并合理安排使用。不同批号的耗材需要通过精子存活试验前方可使用。人精子存活试验使用上游法处理精液，获得活动良好的精子，调整精子浓度为5×106/ml，取0.5ml精子混悬液，在待测物品中放置一段时间〔3－5分钟〕，如吸管、移液管、针管等在精子混悬液中反复抽吸后，再放入5ml试管内，作为实验管。另取0.5ml精子混悬液置于另一试管中，作为对照管。将实验管和对照管置于室温，每24小时用Makler计数板计数实验管及对照管内的活动精子比率，并计算48小时的生存指数。生存指数＝实验管内精子活动率/对照管内精子活动率。正常生存指数应大于85%。如果小于85%，应考虑可能有细胞毒素的存在。接触配子与胚胎的一次性耗材应经过人精子存活试验，证明无毒方可使用。实验室数据指标的定期回忆总结每月统计实验室的各种数据，进行分析和检查。实验室质量达标：受精率：IVF≥65％；ICSI≥70％；卵裂率：≥90％；优质胚胎形成率：＞50％；冷冻周期率：30-50％；卵裂期胚胎冷冻后的复苏存活率：≥90％。如没有到达上述正常标准，须查找原因，及时改正。实验室组织管理和质量监督实验室工作人员除进行配子的处理和培养外，还要进行一系列的常规质控监测，意外事件的详细记录和相应对策的结果评估。实验室管理人员必须按实验室的质量保障体系执行，明确实验室的各个环节，严格遵循质量平安程序、标准化的操作方法。应定期对实验室每位成员进行质量监督，防止由于仪器、试剂、个人操作引起的偏差。对于受主观因素影响较大工程，应该进行内部质量控制检查，对实验室工作人员的操作的准确性和精确性进行评价。此外，每个实验室工作人员应接受医学继续教育，学习最新的生殖医学知识。中心常用试剂、耗材一览表本生殖医学科目前鼠胚实验常规使用VitrolifeG5系列培养基。试剂名称作用货号VitrolifeG5系列G-MOPSTMG-MOPSTMPLUS非CO2依赖型培养液在室温、大气环境中处理、操作卵子和胚胎K021893G-IVFTMPLUS洗精、受精液上游、受精K022245G-1TMPLUS卵裂胚培养液原核期、D2、D3胚胎培养K022244G-2TMPLUS囊胚培养液囊胚培养K021890HYASETM，透明质酸酶消化、移除卵丘细胞K000627ICSITM，PVP精子制动K043116OVOILTM，培养用石蜡油防止液体挥发和污染K991351SpermRinseTM洗精液精子处理：洗精K000621SpermGradTM梯度离心液精子处理：梯度离心K023403其它试剂Quinn’s精子冷冻液精子冷冻保护剂ART-8022SIGMAEBSS缓冲液取卵、移植冲洗液E2888KITAZATO玻璃化冷冻液胚胎冷冻VT101KITAZATO玻璃化解冻液胚胎解冻VT102耗材耗材名称规格货号Falcon35mm培养皿500/case353001Falcon中心井培养皿500/case353037FalconICSI皿500/case351006Falcon5ml试管500/case352022Falcon14ml试管500/case352001Falcon15ml离心管500/case352095Falcon取精杯〔样品杯〕100/case354013Falcon1ml移液管1000/case357521Falcon2ml移液管1000/case357507Falcon10ml移液管200/case357551Falcon四孔板100/case353654NUNC四孔板120/case176740SIGMA巴氏吸管25/caseS6143德国HIGENBERG吸管26/caseParafilm封口膜1/case13-374-16Millipore针头滤器0.22um加藤冷冻叶片10个/包玻璃化冷冻载杆冷冻用铝支架MTG16965/6000冷冻套管MTG16912/0133PALL气瓶滤器0.20m4251HUMAGENinjection针10/盒MIC-35-30HUMAGENholding针10/盒MPH-MED-30COOKICSI针10/盒COOKholding针10/盒BD1ml注射器100/case300771实验室应急预案实验室火、电应急预案实验室内应配置灭火器。实验室内的主要设备，如显微镜、培养箱、冰箱等均连接UPS，保证电压稳定，并且在意外断电情况下可提供6－8小时的电力供给。设备紧急故障CO2培养箱：至少三台备用，每日监测，一旦出现故障，立即报修，并暂时以正常运行的培养箱替代故障培养箱。热台：定期检测，一旦出现故障，立即报修。显微镜：准备灯泡与保险丝的备件，出现故障时及时更换。其它故障立即报修。液氮罐：应始终备有状态良好的备用液氮罐。对现用液氮罐进行定期检测，一旦发现异常泄漏，立即转移故障罐内的胚胎或精子。CO2钢瓶：定期检测气压，及时更换。常备至少一瓶CO2。冰箱：每日监测，一旦出现故障，立即报修，并立即转移冰箱内物品。实验室环境按常规进行监测，温度由层流空调机组调控，发生故障立即报修；假设空气细菌培养结果超标，立即清洁实验室，并重新进行空气培养。一次性耗材按常规进行质控，一旦出现异常，立即更换批号。实验室新人培训方案实验室技术人员必须具备医学或生物学专业本科以上学历，并掌握系统的临床胚胎学知识和细胞培养技能。实验室技术人员应在卫生部批准的人类辅助生殖技术培训基地进修至少3个月。理论学习：卫生部【176】号文件，人类辅助生殖伦理原那么，实验室质控，根底内分泌、遗传学理论，人类卵子、精子发生生理，精子获能，IVF、ICSI适应症，卵子形态与成熟度，胚胎序贯培养系统，精子、胚胎冻融原理，ICSI平安性等。实践练习：练习拉管、装针、模拟拾卵、吹打去除颗粒细胞、少弱精子的别离处理。练习ICSI精子制动、吸打、定点停位，模拟卵子注射。独立工作：在本中心上级技师督导下完成新人培训方案，上级技师考核达标，方可独立工作。胚胎实验室操作常规精液处理操作常规精液样本采集射出精液标本的采集给患者一个明确的书面或口头有关精液采集的指导说明，标本采集时间应为禁欲至少两天，最长不超过七天。精液需经手淫法收集到一次性无菌无毒的枯燥容器内，强调样本收集必须完整，确认是否取精困难，并告诉患者如何运送精液标本。护士核对患者夫妇姓名、有效证件后，在取精杯杯身及杯盖上标记患者夫妇姓名及病历号。待患者取好精液后，护士与患者丈夫当面留取精斑样本于基因卡上，并填好相关信息，患者丈夫按指模并在?接受助孕夫妇取精认证书?签名确认后，护士把标本、基因卡及?接受助孕夫妇取精认证书?交给实验室人员。待精斑晾干后编号保存两年，在精液处理记录本上记录患者信息，编号和保存位置。中心任何工作人员发现患者身份可疑，必须停止接收，重新核实患者身份，不能同时接收2份或以上标本，如疑心标本混乱，必须停止接收。家中精液样本的采集对于除了在自家以外的环境下取精确实困难者，必须提出书面申请并签名确认，可以在家中进行样本采集。给患者以明确的书面或口头形式的有关精液样本采集和转运指导说明，应强调采集样本必须完整，将已标记患者姓名和病历号的容器交给患者，应在采集后1小时内送到实验室。精液标本不能暴露在过高或过低的温度中，运送途中样本应该保持在20℃~37℃的环境中。用避孕套采集样本对于通过手淫法采集精液困难者，那么采用特制的避孕套通过性交法获取精液。告知患者使用避孕套方法以及如何将样本转运至实验室，应记录样本采集的时间，应在采集后1小时内送到实验室。精液标本不能暴露在过高或过低的温度中，运送途中样本应该保持在20℃~37℃的环境中。报告中应注明样本的采集是在利用避孕套通过性交法获取的及采集地点一定不可以使用普通避孕套收集精液，应为它一般含有干扰精子活力的成分〔Jones等，1986〕精液标本分析精液液化精液取出后室温液化15分钟到30分钟，用吸管或者在显微镜中观察检查精液是否完全液化，在家中或利用避孕套采集的样本通常在送达实验室时已液化。精液液化延迟的处理，如果60分钟内精液仍未液化，参加等量的含有蛋白的G-IVF再机械吹打以帮助液化，至精液完全液化再进行常规分析和处理。精液外观正常精液液化后呈均质，灰白，精子密度非常低者可显得透明。如有红细胞，精液可呈现红褐色，病人如有黄疸或服用某些维生素，精液可呈现黄色。精液体积采用直接测量法测量精液的体积，精确到0.1ml显微镜镜下精液的分析完全液化的精液，取10ul滴于Makler计数板停留1分钟，显微镜评价精子的相关指标。观察精液的粘液丝，精子的凝集及非精子细胞〔包括上皮细胞，圆形细胞及断裂的精子头或尾部〕评估精子的密度评估精子的活力和活率〔WHO第5版SOP〕精液处理操作常规精液的参数和来源决定应该选择何种精子制备方法精子特征处理方法射出精液浓度≥5×106/ml且PR精子≥15%双层梯度离心+洗涤后上游法1×106/ml≤浓度≤5×106/ml浓度≥5×106/ml且PR精子≤15%双层梯度离心法附睾取出精，精子数≥1×106/ml且PR精子≥15%微量梯度离心法射出精液浓度＜1×106/ml附睾取出精＜1×106/ml睾丸精子标本直接离心洗涤法密度梯度法参数可以根据不同标本的特征来修改是方法发到最优化，如：减少梯度体液体体积即减少精子需要移动的距离从而可以提高获得正常精子的数量；对于高粘度的标本，可以增加离心和和离心时间。每一患者准备洗精培养基G-IVFPlus两管，每管3ml，提前一天配制好，置37℃、6%CO2培养箱平衡。准备90%密度梯度离心液、45%密度梯度离心液各1ml，使用前配好并在1小时内使用。巴斯德吸管在火焰上灭菌，再把吸管尖烧成圆钝，冷却后待用；15ml锥形离心管〔配置梯度离心液〕和5ml的圆底试管〔上游法〕上标上患者夫妇的姓名。根据选择的方法，准备试剂和耗材进行精液样本处理。4.1双层梯度离心法加1.0ml45%密度梯度离心液于15ml无菌的圆锥底试管中。缓慢加1.0ml90%密度梯度离心液于45%密度梯度离心液底部，保持两种液体的界面。将已液化的精液轻轻加于梯度离心液之上，300g离心15分钟。去上清，剩余精子沉淀约0.5ml，将其参加3mlG-IVFPlus中吹打混匀。200g离心5分钟。弃上清，剩余约0.2ml沉淀。参加适量G-IVFPlus重悬沉淀，计数精子浓度、活力等情况，并记录。置37℃、6%CO2培养箱待用。双层梯度离心法+上游法双层梯度离心法同前面的步骤〔1〕-〔5〕。去上清，留下最下层的精子沉淀约0.5ml，打散混匀。0.5mlG-IVFPlus参加5ml的圆底试管中，将精子沉淀物打散混匀后缓慢参加圆底试管的底部，松开盖子，45度倾斜放置在试管架上，置37℃、6%CO2培养箱中孵育上游30分钟。取上层液体，显微镜下观察并记录处理后的精子浓度、活力，松开盖子，置37℃、6%CO2培养箱待用。微量梯度离心法加0.5ml45%密度梯度离心液于15ml无菌的圆锥底试管中。缓慢加0.5ml90%密度梯度离心液于45%密度梯度离心液底部，保持两种液体的界面。参加已液化好的精液，如果精液体积较多而精子数较少时再多加一管梯度离心液别离精子。加精液时应慢慢沿着管壁滴入，精液防止与梯度离心液混合，和梯度液之间要有明显分层。后续步骤同双层梯度离心法的步骤〔3〕-〔5〕。去上层液体，参加适量G-IVFPlus重悬沉淀，显微镜下观察并记录处理后的精子浓度、活力，松开盖子，置37℃、6%CO2培养箱待用。直接离心洗涤法精液标本充分液化。以1：2〔精液：培养液〕的体积比例，稀释精液标本。把稀释的精液标本放入离心管内，每管不超过4ml。300g，离心10分钟。弃去上层液体。把精子混悬液分散在1ml的培养液中。200g，离心5分钟。再次弃去上层液体。轻轻吹打，把精子沉淀重新悬浮在适量培养液中。显微镜下观察并记录处理后的精子浓度、活力，松开盖子，置37℃、6%CO2培养箱待用。〔四〕精液冷冻操作常规对于局部取精困难，或者因其他原因未能在取卵当日取得精液患者，可采取提前冷冻精液于液氮中的方法将标本保存以作为取卵日备用，以免耽误取卵日授精时机。1.试剂和耗材准备QUEENS’精液冷冻保护剂复温至室温，精液冷冻支架，巴斯德吸管在火焰上灭菌，再把吸管尖烧成圆钝，冷却后待用；2.步骤患者按照精液样本的采集方法留取精液后，置37℃培养箱中液化。待精液充分液化后，按照WHO标准进行精液检查，包括精液量、颜色、气味、pH值、液化情况、精子密度、活动率、精子动力以及细胞等情况，并认真做好实验室记录。将精液参加试管中，按照1：1的比例缓慢参加复温的冷冻保护剂，边加边混匀，充分混匀精液与冷冻保护剂。将混匀后的液体分装至冷冻管内，在冷冻管上做好标记并将冷冻管装上已编号的冷冻支架。将冷冻支架放置在距离液氮面15cm的液氮蒸气中，保持10~20分钟。将冷冻支架投入液氮，冻存。将精液冷冻患者的信息，精液分析结果，及冷冻位置及编号详细记录于精液冷冻登记本。精液复苏操作常规试剂和耗材准备精液处理的常规试剂盒耗材，37摄氏度水浴锅，温度计等步骤查找需要复苏的精液标本，从液氮罐中取出标本，核对冻存管上的信息。将精液标本放置于提前加热的37摄氏度水浴锅中15分钟左右。将标本管翻开，取10l样本涂片，生物显微镜观察并记录。根据复苏后精子的活动力和精子密度，选择相应的处理方法。复苏后的精液信息需在精液冷冻登记本中进行标记，包括复苏时间，精子的活力，密度及用途。〔六〕逆行射精病人的尿液处理操作常规一些患者在射精过程中精子会逆行到膀胱里，从而导致了无精子症或者没有明显射精现象。射精后尿液检查中发现精子就可以确诊逆行射精。当药物治疗不能到达目的时，有必要从尿液中提取精子。患者在取精24小时之前服用小苏打片。常用剂量是每天4次，每次4片〔1g/片〕。其作用使尿液呈碱性，精子更易存活。在取卵的当天早上，患者应该在起床排空尿后，在取精的前2-3小时，再服用小苏打片2片〔1g/片〕喝500-1000ml水，如此能够最大限度降低尿液的渗透压。标本采集和接收按照?精液标本采集与接收操作规程?执行。用手淫的方法往精液杯子内射精。射精后，患者及时排尿于无菌的取精杯中，并将射出的精液和尿液同时送精液处理室。精液和尿液样本都需要进行分析。由于尿量很多，所以需要500g离心10分钟。离心后的逆行射精样本假设有精子，按照?射出精液处理操作规程?进行。PESA精子处理操作常规每一患者准备洗精培养基G-IVFPlus两管，每管3ml，提前一天配制好，置37℃、6%CO2培养箱平衡。准备90%密度梯度离心液、45%密度梯度离心液各1ml，使用前配好并在1小时内使用。术前，实验室为男医科生准备1管预平衡的G-IVFPlus和2-4支5ml圆底试管。把巴斯德吸管在酒精灯上灭菌，再把吸管尖烧成圆钝，冷却后待用，并连同15ml锥形离心管、5ml圆底试管一起标上患者的姓名。实验室人员和临床医生同时核对患者姓名及其妻子姓名，在附睾、睾丸取精/活检手术记录上签名。附睾穿刺手术中，实验室人员用移液器吸取少量送检的附睾抽吸液涂于无菌Falcon3001培养皿，在显微镜下观察是否有精子；如发现有活精子，精子数目足够ICSI，通知男科医生结束手术；如未见足量精子，重复上述操作。反复穿刺未果，由临床医生决定是否改行TESA。精子数目≥1×106，PR精子≥15%的附睾穿刺液，可以用微量梯度离心法进行处理。精子数目少的附睾穿刺液可以用直接离心洗涤法进行处理，处理好的精子在镜下观察并记录，松开盖子，置37℃、6%CO2培养箱待用。完成相应的实验室记录和病历。TESA精子处理操作常规术前一天准备4管G-IVFPlus，每管3ml，置37℃、6%CO2培养箱平衡。术前，为临床医生准备2个加3mlG-IVFPlus的Falcon3001皿，2个1ml的注射器。实验室人员和临床医生同时核对患者姓名及其妻子姓名，在附睾、睾丸取精/活检手术记录上签名。用无菌巴斯德吸管在火焰上灭菌，再把吸管尖烧成圆炖，冷却后待用，并连同15ml、5ml的圆底试管标上患者的姓名。睾丸穿刺前准备一个小皿，参加2mlG-IVFPlus给医生。准备两个1ml的注射器和两个小皿，参加2ml的G-IVFPlus。临床医生从睾丸中抽吸出曲细精管放于盛有G-IVFPlus的Falcon3001皿中，送实验室。用平衡好的G-IVFPlus至少洗涤一次后，将曲细精管移在另一有G-IVFPlus的Falcon3001皿中，在体视镜下，用两个注射器针头，划开曲细精管，在倒置显微镜下观察是否有精子。假设精子数量能够满足临床应用，通知男科医生结束手术。将有精子标本的Falcon3001皿置室温培养箱孵育2h。将睾丸组织混悬液转移至离心管中，静置2分钟，用巴斯德吸管将大块组织移走，300g离心5分钟，去上清，留取0.1~0.2ml沉渣，混匀松盖后置37℃、6%CO2培养箱，备用。完成相应实验室记录和病历。捡卵操作常规捡卵前配液准备配液在取卵前一天进行。卵泡冲洗培养液〔G-MOPSTM〕：取G-MOPSTM10ml放入圆底试管〔Falcon2001〕中，参加肝素300IU/100ml，紧盖后置37℃培养箱中平衡过夜，备用。捡卵皿的准备：吸取G-MOPSPlus3ml培养液参加培养皿〔Falcon3001〕内盖矿物油2ml，每个患者准备2个，放在不通CO2气体、37℃培养箱内过夜平衡。洗卵液的准备：吸取3mlG-IVFPlus培养基放入圆底试管〔Falcon2001〕中，每个患者准备2管，置37℃、6%CO2培养箱平衡。受精皿的准备：准备四孔板，每孔参加受精培养液〔G-IVFPlus〕800l，盖矿物油0.5ml，准备的四孔板个数依据各个患者的卵泡数估算，≤8个准备一块四孔板，8-16个准备2块四孔板，依此类推，放置37℃、6%CO2培养箱平衡。如为ICSI授精方式，准备卵裂液培养皿：用G1Plus做成10个微滴，每滴25l，盖矿物油3.0ml，每个患者准备数目参照四孔板数，置于37℃、6%CO2培养箱内平衡。捡卵根据患者卵泡数目，在IVF工作站台面上预热一定数量Falcon3003培养皿。检查实验室记录单上患者的姓名，并与患者和临床医生当面核对，确保无误。检查已平衡好的培养液，包括冲管液，洗卵培养液和受精培养液。收集在试管内的卵泡液倒入Falcon3003培养皿内，形成一薄层液体，轻轻振荡，迅速扫描卵冠丘复合物〔OCCC〕的存在，用巴斯德吸管吸起后在解剖显微镜下确认。典型的OCCC用肉眼可看到，为灰色透亮的粘液团，中央见到的小的白点为卵母细胞和放射冠，通常直径在2-4mm大小。在体视镜下〔20-50倍〕观察，确诊粘液团内是否有卵母细胞存在，如有OCCC附于血凝块上，可直接用巴斯德吸管别离。将选出的卵子先置于捡卵皿中暂存。取出平衡好的洗卵液参加已预温的小培养皿中〔Falcon3001〕；更换巴氏吸管，将捡卵皿中的卵子转入洗卵皿中洗涤2次，再转移至受精皿中，每孔不超过3枚卵子，立即将受精皿置于培养箱内培养。在记录表上记录取卵情况及卵子所放置培养箱编号，并在培养箱贴上标签。为保持卵母细胞的活性，应尽可能缩短卵子暴露在培养箱外的时间，要求整个操作过程必须无菌、快速，并注意避光，温度维持于37℃，以尽量减少培养液的pH值和渗透压变化。取卵过程如发现异常，如未见卵母细胞，获取数明显少于卵泡数，及时与医生沟通。捡卵结束后，粗略评估卵母细胞的质量和成熟度，确定适宜的授精时间，通常需培养3-6小时。体外授精操作常规体外授精授精前提前30分钟翻开恒温操作台进行预热，将圆底加热试管架放置于台面同时加热，使温度稳定在37℃左右。hCG后39-40小时，取卵后4-6小时进行IVF授精。从培养箱中拿出处理后孵育的精子悬液的小圆底试管，轻轻摇晃混匀，放置于圆底加热试管架上，用移液器取10l滴于Marker计数板，生物显微镜下观察精子的浓度、活动力。根据受精前的精子活力和精子形态决定是否增加或减少所加精子的量。通常用于授精的精子终浓度为1×105/ml。从培养箱拿出受精皿，双人核对皿上标记的姓名和小圆底试管上所标记的名字是否一致，在显微镜下观察卵子的情况和核对卵子的数目。用移液器吸出适量精子，在远离卵子处将精子悬液参加受精皿。将受精皿置37℃、6%CO2培养箱中继续培养。及时完善实验室记录。IVF受精卵脱颗粒细胞卵子脱颗粒细胞的前一日，根据取卵数目准备卵裂液培养皿。卵裂液培养皿：用G1Plus在Falcon300l小皿中做10个液滴，中间两滴用于清洗，每滴25l，盖上矿物油3.0ml，置于37℃、6%CO2培养箱内平衡过夜。提前30分钟翻开恒温操作台预热，将圆底加热试管架放置于台面同时加热，使温度稳定在37℃左右。脱颗粒针的拉制：取两根巴期德吸管煅烧拉细成微吸管，一根稍粗，口径约为200m；另一根稍细，口径约为140m。要求端口平齐并钝化。用稍粗的巴斯德吸管将卵子转移到剥卵皿液滴，再用稍细的巴斯德吸管吹吸受精卵数次，尽量除去颗粒细胞直至可清晰观察受精卵。把卵子转移到剥卵皿液滴，先用微吸管吹吸受精卵2-3次，尽量除去颗粒细胞直至可清晰观察受精卵。从培养箱内取出准备好的卵裂培养液微滴的皿，标记患者姓名和皿号，和另一个工作人员核对无误。用另一根微吸管将所有已脱颗粒的受精卵转移到卵裂皿中央液滴洗涤2-3次后转移至周围的液滴中。受精观察：将装有受精卵的培养皿放在倒置显微镜下，观察原核。卵胞浆内单精子注射〔ICSI〕ICSI实验室指征严重的少、弱、畸形精子症重度少精子症：1×106/ml≤射出的精液中精子密度≤5×106/ml；重度弱精子症：1%≤前向运动精子〔PR〕≤10%；重度畸形精子症：1%≤正常形态精子＜2%；极度少精子症：精子密度＜1×106/ml；极度弱精子症：前向运动精子〔PR〕＜1%；极度畸形精子症：正常形态精子＜1%。PESA/TESA获得的精子；常规IVF受精失败〔成熟卵子受精率低于30%〕。培养液准备：按每个剥卵用培养皿处理8个左右卵子，每个培养皿需要4mlG-MOPSPlus。取卵前一天下午根据卵泡数量准备剥卵用培养液G-MOPSPlus，参加Falcon2001圆底试管中，盖紧盖子，放在37℃培养箱内平衡。另准备2个卵裂液培养皿：用G1Plus做成10个微滴，每滴25l，中间两个滴用于清洗，盖矿物油，置37℃、6%CO2培养箱内平衡。提前30分钟翻开恒温操作台，将圆底加热试管架放置于台面同时加热，使温度稳定在37℃左右。取卵后2-4小时对卵子进行脱颗粒细胞操作。准备一个四孔皿，在第一孔中参加配制好的透明质酸酶0.5ml，其余三孔参加平衡好的G-MOPSPlus各1ml，在37℃培养箱孵育15分钟。脱颗粒针的拉制：取1根巴斯德吸管，保持原口径，煅烧钝化端口。再取3根巴期德吸管煅烧拉细成微吸管，2根稍粗，口径约为200m；第3根稍细，口径约为140m。要求端口平齐并钝化。用原口径巴斯德吸管将不多于8个OCCC移入含透明质酸酶的孔中冲洗吸打30-60秒，至外层颗粒细胞脱去后，用稍粗口径吸管将卵子移入G-MOPSPlus中。换稍细口径吸管继续吹打，以去除剩余的颗粒细胞层，再改换新的稍粗口径吸管将卵子移入G-MOPSPlus中洗涤，再转移至已预平衡过的G-1Plus微滴皿中，置37℃、6%CO2培养箱中备用。准备ICSI操作皿〔Falcon1006〕：在皿底和皿盖标记好患者姓名。中间做三个圆形的PVP滴，每滴7l；左方用7lPVP划写一个椭圆；右方用平衡后的G-MOPSTMPlus做数个7l的液滴；如下列图所示。在双人核对下，在椭圆的PVP边缘参加微量处理过的精子，覆盖已平衡过的矿物油，置37℃培养箱内备用。安装、调节显微注射系统：翻开显微镜、显微操作系统及载物台热台，确保所有操作控制都恢复至原有的可控操作内，可以平稳、舒适地进行操作。安装持卵针和注射针时，应防止注射针管道系统中有气泡。在×4物镜下调整持卵针和注射针，依次调节其角度与位置，使两者针头相对并与载物台平行，前后左右移动操作针，×10、×20物镜下检查所操作针的移动范围。将持卵针和注射针升高，确保操作台与热台之间的高度能够轻松放置操作皿而不碰及操作针。在双人核对下，将已选好的MⅡ卵转入ICSI操作皿的G-MOPSTMPlus微滴内，每滴1个。将盛有卵子的操作皿放置于调好的显微镜操作仪的热台上；×10物镜下调节显微镜焦距使操作皿内微滴的边缘清晰可见。将注射针降入ICSI操作皿的PVP液滴中，调节显微镜使注射针清晰可见，同时吸入少量PVP进入注射针。精子制动：将注射针移入含有精子的条形PVP液滴中，在微滴上端选择形态、活力正常的精子吸入注射针，转入另一PVP微滴，将精子放置于操作皿底部。将注射针在精子尾部中段或下段轻压，迅速回拉注射针，划过精子，使其制动。将精子先尾后头吸入注射针内，然后将注射针转入卵子的G-MOPSTMPlus微滴中。卵胞浆内单精子注射：降下持卵针，并轻拨动卵子，使第一极体位于12点或6点位置，固定卵子。调节显微操作针和卵膜至同一水平面，将精子推至注射针尖处，于3点钟处垂直穿过透明带并继续进针，至卵中心或越过中心位置〔卵母细胞直径的50-75%〕，轻微回吸注射针，当胞浆和精子出现快速返流的过程，指示卵膜已破，停止回吸，将精子缓慢注入卵子胞质内，缓慢退出注射针。退出注射针后，调节持卵针负压，释放卵子。重复上述步骤至所有的成熟卵子都注射完毕，将ICSI皿从显微镜热板转移至解剖镜下，从培养箱取出卵裂培养皿，每个卵子在培养皿中央两个液滴中漂洗数次，再转移至旁边微滴中放回培养箱。考前须知将精子和卵子参加操作皿中都必须双人核对皿上的患者姓名、精子、卵子的标记，并签名确认。ICSI操作皿制备要快速，同一时间只能准备1个皿，要防止微滴蒸发脱水，临近ICSI操作时准备。尽量减少PVP注射入卵子中。用注射针制动精子要避开其颈部。精子注射进入胞浆的深度约为卵子直径的50-75%。ICSI操作时动作要轻柔快速，从制动精子至精子被注入一枚卵子胞质中的时间宜控制在3分钟内。卵子与胚胎评分系统卵子评分卵－冠－丘复合物评分：Ⅰ级：这级卵子通常为不成熟或退化的卵子，有的是异常卵子。卵细胞呈浅透明状，放射冠完全没有分开，卵丘细胞紧密排列，颜色偏浅或卵丘细胞团很小。Ⅱ级：这级卵子通常为接近成熟的卵子。卵细胞外观颜色较深，放射冠已呈不同程度的分散，卵丘细胞排列变稀松，颜色变浅。Ⅲ级：这级卵子通常为成熟卵。卵细胞外观颜色偏深，形态为规那么的圆形，放射冠呈完全分散状，卵丘细胞团通常较大，排列松散，颜色很淡。Ⅳ级：这级卵子通常为过熟卵子。卵细胞颜色变深，放射冠分散，但外周的卵丘细胞团很小或缺失。卵细胞成熟度的判断MII期卵子：细胞核的结构消失，第一极体已排出。此时胞浆中看不到细胞核的结构，在卵黄间隙中可见第一极体。MI期卵子：细胞核的结构消失，但第一极体尚未排出。在此阶段的卵子中既看不到细胞核也看不到第一极体。GV期卵子：外观颜色清淡，细胞核的结构尚未消失，在此阶段的卵子胞浆中可看见细胞核结构。ICSI破膜方式A：破膜顺利。胞质回吸后在透明带附近破膜。B：破膜困难。胞质回吸后明显超过透明带才发生破膜。C：无弹性。注射针刺入卵子后，卵子无明显变形，破膜感觉不明显。受精卵评分正常受精卵〔2PN〕：表现为胞质内有两个原核，可见第二极体。根据两原核的大小、形态、核仁数目、大小和分布等，分为Z1-Z4级。Z1级：每个原核核仁数3-7个，核仁在原核相交处排列成线；Z2级：原核大小相等，但核仁不成线排列在原核相交处；Z3级：两原核特征不同，核仁的大小、数目不等，不排列在原核相接处；Z4级：原核大小明显不等，原核相离。异常受精卵多PN、1PN或者卵质内没有原核，此类受精卵不适合进行移植。原核的出现和消失是一个动态过程，不同的时间评估可能会有不同的结果。应在相对固定的时间授精〔取卵后3-6小时〕，相对固定的时间观察原核〔授精后16-20小时〕，并记录好这两个时间。卵裂期胚胎评分I级：细胞大小均匀，形状规那么；胞质均匀清晰，没有颗粒现象；碎片在0－5％之间。II级：细胞大小略不均匀，形状略不规那么；胞质可有颗粒现象；碎片在6－20％之间。III级：细胞大小明显不均匀，可有形状的明显不规那么；胞质可有明显颗粒现象；碎片在21－50％之间。IV级：细胞大小严重不均匀，胞质可有严重颗粒现象；碎片在50％以上。囊胚的评分分期1期：早期囊胚，囊胚腔不到整个胚胎的1/2。2期：囊胚腔超过了胚胎体积的1/2。3期：扩张囊胚，囊胚腔完全占据胚胎的总体积。4期：囊胚腔完全充满胚胎，胚胎总体积变大。5期：正在孵出囊胚，滋养外胚层通过透明带向外凸出。6期：孵出囊胚完全从透明带孵出。3-6期囊胚再评估工程内细胞团：A：包裹紧密，大量细胞B：结构松散，少量细胞C：极少量细胞滋养外胚层：A：许多细胞形成紧密结合的上皮B：少量细胞形成结构松散的上皮C：极少量细胞解冻胚胎的评分解冻后所有卵裂球存活的胚胎，按新鲜胚胎的评分标准进行评分；解冻后如有卵裂球死亡，那么仅记录存活的卵裂球数，不再进行评分；冻融胚胎一半以上卵裂球存活，胚胎可判断为存活，可用于移植。考前须知观察过程应迅速，尽量减少胚胎在培养箱外暴露的时间。在实验室记录上记录每个胚胎的情况。原核的观察在受精后的16-20小时进行，D2胚胎观察在受精后的40-44小时进行，D3胚胎观察在受精后的64-68小时进行，D5胚胎观察在受精后112-116小时进行。优质胚胎定义Day1为2pn；Day2〔授精后40-44小时〕：2－5细胞，碎片20％，大小比拟均匀；Day3〔授精后64-68小时〕：6-10细胞，碎片20％，大小比拟均匀；Day5-6〔授精后112-140小时〕：3BB及以上。胚胎移植实验室操作常规移植前一天根据需要进行胚胎移植的患者个数准备移植皿，在Falcon3037胚胎移植皿外圈参加G1Plus或G2Plus3ml，置37℃、6%CO2培养箱内过夜平衡。将移植液根据每例移植500l的量参加Falcon2001圆底试管中，置37℃、6%CO2培养箱内过夜平衡。在使用的当天早上，准备当天移植用的皿〔Falcon3037〕，将移植皿写上患者的姓名，皿中内孔加500l已平衡好的G1Plus或G2Plus培养液，置37℃、6%CO2培养箱平衡30分钟后才能移入胚胎。选择移植胚胎的原那么移植胚胎的数量严格执行卫生部规定，35岁以下患者不超过2个，35岁及以上患者以及屡次IVF失败的患者可以一次移植3个胚胎。移植囊胚不超过2个。胚胎移植后假设有剩余胚胎，应征求患者对剩余胚胎的处理意见并签署?配子与胚胎去向知情同意书?。对于适合冷冻的剩余胚胎，鼓励患者作胚胎冷冻保存。采用连续评分法挑选，即综合原核评分和胚胎形态评分，挑选形原核评分高、形态好、碎片少、无空泡的优质胚胎进行移植。通常D2选择2-5细胞，D3选择6-10细胞。在D5-6，选择囊腔扩张充满，内细胞团致密、细胞数多，滋养层细胞数目多的胚胎。卵裂球数和质量相同的胚胎中，选择透明带薄、色泽正常的胚胎进行移植。ET操作步骤核对好患者姓名，将待移植胚胎转入已准备好的ET皿中。从培养箱中取出ET皿，将ET管接上1ml注射器，来回抽吸空气，润滑注射器，然后回吸至注射器0.03ml整刻度处吸取0.5cm长的移植液，再将移植内管抬出液面，再吸取0.5cm长的空气，然后在显微镜下将移植内管伸入移植皿胚胎旁边，吸取少量移植液后再吸取胚胎，此段约长2cm〔约10l〕,确认胚胎装入移植管中，再吸取0.2cm长的空气，最后把移植管头在移植液中轻点封管，即装管完毕。将装好胚胎的移植管平稳的拿到临床手术室，再次核对患者夫妇姓名，确认无误后缓慢的插入外管内，配合临床医生在B超引导下调整内管尖位置使之距离宫底1-1.5cm处，调整好后，缓慢平稳的推动注射器，将内管内胚胎及移植液注入患者子宫，注射器推至末端，停留30秒后退出内外管。a：0.1cm培养基；b：0.2cm空气；c：约2cm含胚胎的培养基；d：0.5cm空气；f：0.5cm培养基在显微镜下检查胚胎残留情况，假设无胚胎残留，尽快通知临床医生，同时告知护士移植管黏液和血块情况。如果有胚胎残留，必须用一根干净的移植管重新装入，重新移植。填写移植单的移植情况，移植者和核对者签名。考前须知如果在移植过程出现困难移植导致时间过长，需将胚胎重新放回移植皿中，直至临床医生确认能够平安的将胚胎移入子宫后再行移植。实验室胚胎移植者和核对者必须双人核对，认真检查胚胎、培养皿的标记、记录情况和移植患者的一致性。囊胚培养囊胚培养皿准备：受精后第2天准备囊胚培养皿，使用G-2Plus在培养皿〔Falcon300l〕中制作10个微滴，每个微滴25l，盖矿物油3ml。D3当天，提前30分钟翻开恒温操作台，将圆底加热试管架放置于台面同时加热，使温度稳定在37℃左右。拉针：取一根巴斯德吸管煅烧拉细成微吸管。用微吸管将用于囊胚培养的胚胎移入已经过夜平衡的囊胚培养液滴中，每滴放入一个胚胎。将装入胚胎的培养皿放入37℃、6%CO2培养箱中继续培养。完成实验室记录。D5检查囊胚形成率并进行评分，选择可供移植或冷冻的胚胎。如果在D5未形成囊胚，换同样的囊胚培养液后继续培养胚胎1天，在D6评估能否用于移植或冷冻。迟于D7上午形成囊胚者不再继续培养。完成实验室记录。胚胎的玻璃化冷冻以下操作流程为卵裂期胚胎为例，卵子与囊胚的玻璃化冷冻操作可参考此流程。提前30分钟翻开超净工作台。取1个四孔板，在盖子上标记ES、VS液，每孔各加400l。填写冷冻单。标记：准备载体、剪刀、标签。按冷冻登记本上的编号在标签上标记冷冻管编号、病人名字、冷冻日期，并将其贴在冷冻载杆柄上；在另一标签上写下丈夫名字，贴于套管上。液氮准备：准备一个小液氮容器，装满液氮，并准备两根长镊子。从培养箱内拿出培养皿，用拉制的巴氏德管将胚胎转入四孔板。注意以下操作均为室温下进行。在ES液外表参加胚胎，使其自然下沉，静置5-15分钟〔注意：绝对不能超过15分钟〕。在此过程中，胚胎会出现皱缩并随即膨胀，当其复膨到最大程度〔至少80%〕时，即到达平衡状态，此时迅速将胚胎移入VS孔中〔注意：400l微滴可在等待胚胎平衡时制作〕。胚胎在VS中放置30秒，期间将胚胎移动1-3次。将胚胎装入冷冻载体上，插入液氮中时应轻晃一下，这样可以使胚胎加速降温。胚胎进入VS到放入液氮的操作必须在60秒内完成〔因VS含有毒性，操作时间拖长可能会对胚胎产生不良影响〕。在液氮中，将载杆尖细端套入套管中，并装入冷冻支架内迅速将其投入液氮罐中保存。登记病人名字、冷冻时间、冷冻胚胎数目、冷冻载体数、储存位置、胚胎情况等。完成相应的实验室记录。玻璃化冷冻后的胚胎复苏以下操作流程为卵裂期胚胎为例，卵子与囊胚的复苏操作可参考此流程。培养液准备：冷冻胚胎复苏的前一日，用囊胚培养液准备胚胎培养皿，置37℃、6%CO2培养箱内平衡过夜。取1个四孔板，在盖子上标记TS、DS、WS1、WS2液，先在两个孔中参加TS、DS液各400l。〔注意：TS液必须先预热至37℃〕在液氮中将冷冻载杆从套管中取出。迅速将冷冻载杆尖细端浸入四孔板TS液中〔37℃〕静置1分钟。用准备好的巴氏德吸管将胚胎转移至DS液中〔室温〕，停留3分钟，在此期间将胚胎移动1~3次。在剩下的两孔中分别参加400l的WS1、WS2液。将胚胎移入WS1、WS2各放置5分钟〔室温〕。将胚胎转移至囊胚培养皿液滴中洗涤数次〔37℃〕。将洗涤后的胚胎转入另一囊胚培养液滴中培养，在皿盖上标记患者姓名，另一实验室人员核对，显微镜下观察后放回培养箱内继续培养。登记病人名字、复苏时间、复苏胚胎数目、管数、胚胎情况等。完成相应的实验室记录。辅助孵化辅助孵化是通过对于透明带的操作，帮助囊胚从透明带中孵化，以利于胚胎种植于子宫内膜。本中心使用非接触性激光对透明带进行局部削薄，而不影响透明带内层的完整性。指征女方年龄≥37岁：随着女方年龄的增长，卵子的质量也较差，胚胎透明带常会变硬，失去正常弹性，高龄不孕者的低妊娠率与透明带变硬有关。同时此类助孕者的胚胎质量往往不如年轻者；IVF治疗史：有IVF治疗失败史，在排除子宫内膜，胚胎质量等明显影响其植入的因素后，在再次IVF时应做辅助孵化，因为囊胚不能孵出可能是植入失败的原因；透明带异常：当出现胚胎透明带异常，如形态不规那么，呈椭圆形，或透明带着色深，或透明带厚度增厚〔≥15m〕，均提示透明带异常，或有某种功能上的缺陷需做辅助孵化；胚胎碎片率＞20％：在没有优质胚胎可供选择的前提下，当胚胎出现较多碎片时，通过辅助孵化使碎片流出，可能有助于胚胎发育和孵化；根底FSH升高〔≥15mIU/ml〕：FSH根底水平升高常提示卵巢功能较差，卵子的透明带可能出现异常；胚胎或卵子冷冻复苏后。操作步骤翻开激光破膜仪的控制软件，解锁激光。把装有胚胎的培养皿放在倒置显微镜载物台上，将焦距调节清晰。在40倍物镜下，把胚胎的透明带对准预设的激光焦点。选择卵周隙较大的位置对透明带进行削薄操作，以免激光的热效应影响透明带下的卵裂球。发射激光，对胚胎透明带周长的1/6至1/4进行削薄。对需要行辅助孵化的所有胚胎完成削薄操作。在实验室记录单上记录辅助孵化操作。清洁操作区域。