重金属胁迫诱导水稻发生可遗传的表观遗传变异及其可能作用于水稻提高抗重金属能力的机制研究

重金属胁迫诱导水稻发生可遗传的表观遗传变异及其可能作用于水稻提高抗重金属能力的机制研究 重金属胁迫诱导水稻发生可遗传的表观遗传变异及其 可能作用于水稻提高抗重金属能力的机制研究 东北师范大学 博士学位 重金属胁迫诱导水稻发生可遗传的表观遗传变异及其可能作用 于水稻提高抗重金属能力的机制的研究 姓名:欧秀芳 申请学位级别:博士 专业:遗传学 指导教师:刘宝 20090601 摘 要 重金属胁迫作为非生物胁迫的一种可引起植物的胁迫应答。这里我发现重金属胁迫 后水稻表现出明显的生长抑制，并且呈现一个剂量依赖的抑制效应，即浓度越高，抑制 作用越大。由于表观遗传修饰具有可应答于生物体内在胁迫和外部胁迫的特点，我相信 重金属胁迫可诱导表观遗传修饰如DNA甲基化变异和基因表达变异的发生。在研究中 我发现重金属胁迫可诱导水稻在一些特定的序列上发生DNA甲基化的变异和基因表达 的变异。这些变异具有以下的特点: 1 变异主要为CNG位点的去甲基化变异; 2 改变的甲基化类型在自交的一代中发生新的去甲基化变异，在自交二代中基 本可遗传一 代的甲基化类型; 3 那些负责建立和维持胞嘧啶的甲基化类型和,或染色质结构的基因 被重金属胁迫诱导发生表达的变异，在一定程度上可能是导致DNA甲基化变异的原因 之一; 4 特定序列 转座子和基因 的表达改变主要为表达的上调，偶尔的表达下调 也存在，改变的基因表达可不同程度的遗传给自交一代和二代植株。基因表达的改变和 自身序列的甲基化改变不存在一一对应的关系，但是大体上序列的去甲基化变异对应着 基因表达的上调。此外，重金属胁迫后的植株表现出一定程度的剂量依赖的重金属抗性 应答，这可能与水稻重金属转运蛋白OsHMAs基因的表达增强有关。根据以上几方面的 研究我认为重金属胁迫诱导的表观遗传变异可为研究植物抗重金属胁迫的 机制和培育 抗重金属水稻新品种提供一定的理论依据和参考。 关键词: 重金属;甲基化变异;基因表达;表观遗传;水稻 Abstract Asa of kindabiotic metalstress stress this stress，heavy mayprovokeresponse(In thesisIfoundthat metalstressinduced inhibitioninrice(which heavy significantgrowth showeda extentofinhibition dose-dependentresponse，the increasedwithincreasedmetal concentrations(Giventheinherent of modificationsto to property epigenetic response intrinsicaswellasexternal is stress，itconceivablet11at markerslikeDNA epigenetic and alterationsin to metalstress( methylationgeneexpressionmayundergo responseheavy In deedI foundherethat metalstresscouldinduce heavy extensivealterationinbothDNA and inrice asetofcharacterized methylationgeneexpressionplants，revealedby sequences andcellular I foundthatseveralfeaturescharacterizethe includingtranspoSOIls genes( alteration: are CNG 1 Alterationspredominanthypomethylation indicated couldbeinheritedtonext in most analysis demethylatedpanems generation plants， tomoreintensive couldinheritthe leading hypomethylation，andsubsequent generation altered inmost metalstressinducedthe methylationpatterns progenyplants; 3 Heavy the of of statethese forthe perturbation enzymaticmachinery expression genesencoding for and and, orchromatin responsibleestablishingmaintainingcytosinemethylationpatterns structuresuchasDNA andSWl7sNF。 methytransferases，5-methylcytosine glycosylase chromatin bea causefor the ofDNA remodeller DDM1 ，whichmay major high(incidence in occurredin andcellular methylationalterations; 4 Alterations expression transpOSOIls are andoccasional the genespredominantup-regulations down-regulationsevents，and alterationstatecouldinheritto atvariable Alterationin progenies fi'equencies( expression didnotshowa correlationwithalterationsin I foundthat general methylation,but mostelementsexhibited hypomethylationspecificallyoccurred，and up-regulatedexpression metal the inDNA influencethe uponheavy stress，SO changes methylationmay expression levelofanumberof tosomeextent( found Furthermore。Ithat oftreated genes progenies showedenhancedresistanceina manner。 andoSHMASshowed plants dose(dependent significant mighttometaleffluxandcontributetoenhanced up-regulatedexpressionhelp to resistancemetalin oftreatedrice discuss of heavy progenies plants(I implicationsheavy metalstress-inducedvariatiOIlSwith tothe epigenetic regard resistancemechanismtoheavy metal and for inrice ofplantspotentialitymutagenesisbreeding( words:Heavymetal;DNAmethylationalteration;Gene Key inheritance;Rice U 英文缩略词 英文缩写词 英文全名 Cu Copper Cd Cadmium Cr Chromium Hg hydrargyrum DNMT DNA methytransferase SAM S-adenosyl-L-methionine CMT3 3 Chromomethylase METl l Methyltransferase DRM2 Domains 2 RearrangedMethylase DDMl DeleteinDNA 1 Methylation interferenceRNA siRNA Small DME Demeter Rosl Of 1 RepressorSilencing TGS Gene Silencing Transcriptional RT Reverse-transcriptase Mu Mutator ORF frdme Openreading T瓜 Terminalinverted repeat RNAdirectedDNA RdDM methylation LTR terminal Long repeat Spm Suppressor―mutator MBP protein Methyl-binding M? methylationinduced-premeiotically HDA Histone deacetylase MBD domain Methyl??―CpG--binding 1 LHPl LikeHeterochromation preotein Of 1 MOMl Maintenance Methylation Tam elementofAntirrhinum transposable majus V ROS Reactive OxygenSpecies GSH Reduced glutathione ASA ascorbicacid SOD dismutase Superoxide POD peroxidase CAT Catalase GR Glutathionereductase shock HSP heat protein PC in CadystinsSchizosaccharomycespombe MT Metallothionein Naturalresistanceassociated Nramps macrophageproteins ZIP ZI盯，?汀-like protein H?队 metalATPase Heavy ABC cassette transporters ATP-binding MI冲 resistance-associated Multidrug protein PDR resistance Pleiotropicdrug protein VI 独创性声明 本人郑重声明:所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究 工作所取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人 承担。 学位论文作者签名: 盘歪茎 日期: 盟:兰』三 学位论文使用授权 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即:东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的 复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其它复制手段保存、汇编本学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 瓣ii 9绺;蒜i: 学位论文作者签名: 垒歪杰 指导教师签名:。鳖遂垂 日 期: 垒?:!乡 日 期: 乜鱼:壶:l罩 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 电话:―― 通讯地址: 邮编:―― 东北师范大学博士学位论文 引 言 1 DNA甲基化的分子生物学研究进展 CH提出的。它通过DNA的甲基 表观遗传学 Epigenetics 是1957年#tWaddington 化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA调控4种方式来控制表观遗传的沉默。表观 遗传学主要研究在DNA序列没有发生变异的情况下，基因功能发生改变，并 且这种改变 又可随细胞的有丝分裂和,或减数分裂遗传下去的现象，它不仅对基因表达、调控、遗传 有重要作用，而且在肿瘤、免疫等许多疾病的发生和防治中亦具有十分重要的意义llJ。 DNA甲基化是真核细胞基因组重要修饰方式，是表观遗传学重要的研究内容之一，这一 修饰现象广泛存在于多种生物体中。DNA基化主要形成5(甲基胞嘧啶 5(mC 和少量的 而真核生物中较少。真核生物中，DNA甲基化主要是以5(甲基胞嘧啶的形式存在lZJ。机 体有建立和维持DNAqj基化的机制。DNA甲基化通过与反式因子相互作用或通过改变 染色体结构而影响基因的表达，在胚胎发育、X染色体失活、基因组印记等方面起着重 要作用。DNA甲基化为哺乳动物的发育、遗传性疾病和肿瘤的发生、生物进化、性状的 遗传控制等的研究提供了新的途型玉4J。 1(1植物基因组中的DNA甲基化 的胞嘧啶上，由DNA甲基转移酶 DNA ,(8,的核基因组DNA胞嘧啶处于种反应【3??51，在脊椎动物中大约有3 甲基化状态。在植 物中约有5,(30,的胞嘧啶是甲基化的【61。不论是植物还是动物中，胞嘧啶都首先在对称 的CG双核苷酸上被甲基化，这是最保守的表观遗传修饰，然而，在一些植物种中发现 的高数量的5(甲基胞嘧啶就暗示着甲基化不只是局限在CG位点，因此发现甲基化也发生 o】。尽管甲基化通常只发生在DNA双链上，但在模 在CNG位点，少量发生在CNN位剧7。1 式植物拟南芥中有报道有些甲基化偏向于一条链„】。植物中，DNA甲基化的含量从拟南 芥的约5,到烟草中的约30,的巨大差异很大程度是由于物种间重复DNA的含量不同造 成的【12以41，拟南芥在重复元件的最高密度区，如近着丝粒区和染色体浓缩的染色质区是 高甲基化的【15??16】。对拟南芥全基因组范围内甲基化图谱的研究表明，DNA甲基化在转 座子和基因区的分布不同，转座子在它们的全长都是高度甲基化的，遍及整个基因组的 转座子显示出CG和非CG序列的高度甲基化，而基因的DNA甲基化则分布在远离基因的 末端，大约有l,3的基因在它们的转录区是甲基化的，而它们的启动子区很少甲基化的， 东北师范大学博士学位论文 这说明启动子的甲基化并不适合基因的表达，启动子区甲基化的基因比在中间区域甲基 化的基因表达水平低【15-171。 1(2植物基因组中DNA甲基化的建立和保持 高等植物的DNA甲基化状态受两种类型甲基转移酶 DNA 头”甲基转移酶和“维持”型甲基转移酶的调节。“从头”甲基转移酶 detlOVO 基化模式;“维持”型甲基转移酶 maintenance 甲基化的双链DNA为底物，在未甲基化的DNA链的对称位点上完成甲基化【6】。“从头”甲 基转移酶DRM Domains Rearranged 性要由小的干涉RNA smallinterference RNA 3 ，RNA聚合酶 聚合酶2 RNA(dependentpolymerase2，RDR2 ，DCL3 Dicer-Like 4 的作用，RNA介导的DNA甲基化 DI RNApolymeraseD1，RPDl 和AG04 Argonaute 可以以顺式或反式发生【18。20】0 1 ，负责维持CG位点的甲基化，它在孢子形成和配子形成过程中，对重复序列和单拷贝 序列的甲基化类型的如实维持是必需的【2h22】，METl不能响应RNA信号， 也不能起始 3 ，主要负责维持CNG 和保持非CG位点的甲基化【231。另一种是CMT3 Chromomethylase 位点的甲基化，该甲基化也可少量的由DRMs来维持，CMT3是植物特有的甲基转移酶， 在体外可结合到赖氨酸9和27三甲基的组蛋白H3的尾上来特异的甲基化CNG位点，但这 种靶向结合的模式在体内还没有被证实。CMT3除了保持CNG的甲基化外，还在一定程 度上保持其他序列的甲基化，也能够起始一些序列的从头甲基化【24-27]。另外，DNA甲基 化与染色质的形态密切相关，除胞嘧啶甲基转移酶以外，植物中染色质重塑酶 chromatinremodeling inDNA 1 基因编码一个类似SWl2,SNF2的染色质重塑酶 DDMl DecreaseMethylation DDMl，它虽然不直接作用于甲基基团的转移，但与其他甲基化调控因子协同作用使埋 藏在异染色质中的靶DNA易于甲基化，或者将染色质重塑为后续甲基化因子作用的易受 体从而影响植物基因组的甲基化水平【28’291。有研究表明，拟南芥的ddml突变体会引起 基因组范围内的去甲基化【30】，可见其对于维持基因组DNA甲基化的稳定起重要作用。 1(3植物基因组中DNA去甲基化作用 植物基因组内DNA甲基化的可逆调节是由DNA去甲基化作用来完成的。 植物中胞 嘧啶甲基化的去除过程有主动和被动两种方式。主动的去甲基化过程是由糖基化酶DME Of 1 作用来完成的【3h Demeter 和ROSl RepressorSilencing excision site 常称为AP位点。DNA糖苷酶以碱基切除修复 base repair，BER 方式进 2 东北9币范大学博士学位论文 胞嘧啶，DNA连接酶将链连上。依赖于DME的去甲基化作用是在拟南芥胚乳发育过程 中建立基因组择亲表达 genomic 子发育调控方面，DME与METl的功能是相互拮抗的关系 antagonistic 种子发育时期，FWA在胚乳中表达，这个功能是通过DME基因在雌配子体中的特异表 达，并伴随着FWA的去甲基化获得的【35】。ROSl在植物整个发育过程中都有广泛表达， 它是从一个低温调节基因 COLDREGULATED78，COR78 启动子一荧光素蛋白作为报 告的基因筛选中发现的【321，这个转基因的启动子与内源COR78基因的启动子同源，并 DNA超甲基化过程和转基因的转录水平的基因沉默 transc邱tionalgenesilencing，TGS 起抑制作用【32。34]。DNA被动去甲基化 passive 维持型DNA甲基化酶被抑制或缺乏所造成胞嘧啶不能及时的加上甲基化造成的。DNA 也可以是被动过程，也有可能主动和被动作用共同存在[361。 1(4DNA甲基化的生物学功能 1(4(1 DNA甲基化与基因组防御 DNA甲基化作为基因组防御系统能够维护基因组的完整性，不仅是在植物中，而 是在所有生物中，DNA甲基化的首要功能是沉默转座元件的转录和移动来保护宿主基 因组免受它们的有害的影响m381。拟南芥有一个自身存在的低的转座水平，在ddml 变异下转座水平提高，在该背景下，元件插入到其它的基因能产生不利的表型”’加1。 在ddml变异下，不仅DNA甲基化发生改变，其它的染色质结构也发生改变，使得从 染色质结构改变中分离出去甲基化的效果是很难的。在ddml变异中许多类型的转座子 的甲基化在抑制转座子移动上都起作用【4h421。DNA甲基化对元件的沉默是由元件的转 录和转座酶结合的水平控制的，这两个水平都受DNA甲基化的影响。最近在了解玉米 是玉米中能被诱导高频变异的转座子，Mu存在一个自主转座元件，编码自身转座所需 的所有信息和一个非自主转座元件，它要依赖于自主转座元件才能移动。自主转座元件 DNA转座子，它表现出低温依赖的转座，在温度降低时转座酶基因的编码序列和元件 的末端都发生了甲基化的改变，甲基化改变最大的区域位于元件的3’端与TPase结合位 点相对应的序列，TPase的结合受到靶位点的甲基化和高温的双重抑制。Spm是一种玉 3 东北师范大学博士学位论文 米中的DNA转座子，它在DNA甲基化丢失时活跃，而它的甲基化丢失是一个主动的 而不是被动的去甲基化过程。与Tam3不同，Spin的转座是由元件的转录控制的。Spm 元件在其全长8kb都是甲基化的，但与活性对应的不同的甲基化是在5’端，不活跃的 Spin元件在它们的5’端200bp启动子区和相邻的与第一个不翻译的外显子部分重叠的富 含CG的重复的下游控制区是甲基化的，活跃的转座子在这两个区域是相对低甲基化的。 不活跃的元件在有活跃元件存在时可被激活，这是一个伴随着甲基化降低和转录增加的 过程【。M8】。另外对水稻渐渗系的研究同样发现了转座因子激活和甲基化水平变化的相关 性【491，说明DNA甲基化调控模式是真核生物基因组一种对外来遗传物质防御和本身基 因组稳定性维持的机制。 1(4(2 DNA甲基化与基因表达 在真核生物基因组中，基因仅仅占一小部分，在大量非编码DNA存在的情况下，如 何精确控制基因的表达，降低周围的转录噪音对生物体至关重要。多数研究 结果表明， DNA甲基化可以调控基因的表达，基因本身 cis 或基因组其他位置的甲基化都能够控 并将其转染Nd,鼠细胞中RNA表达水平或由基因编码的酶的活性而首次被探究的 [51-53】。许多研究表明，完全甲基化的基因是不表达的，并且在体外特定位点的甲基化表 明基因的5’区甲基化 包括启动子和部分转录区 和3’区甲基化 包括部分转录区和3’ 侧翼序列 都可以抑制特定基因的表达。然而，对于许多基因，其5’启动子区的甲基化 对于表达有更显著的影响【5卜，不。另外，在一些实验中已经很清楚的是要达到沉默仅仅是 甲基化的改变是不够的，还需要染色质的信剧56’58J。关于DNA甲基化参与基因表达调 控的机理【59】一种是直接模型，就是DNA在复制后甲基化改变了DNA的构象，阻止了转 录因子和基因的相互作用，从而保持基因的无表达活性状态，而有转录活性的基因则利 用非甲基化的启动子来进行转录表达【帆611;另外，DNA甲基化也可以通过抑制RNA聚 合酶的活性来控制基因的表达。另一种是间接模型，细胞内存在一些专门与甲基化序列 结合的蛋白质，称甲基化结合蛋白MBPs methyl(bindingproteins ，它与其它转录复合 因子相互作用或招募组蛋白修饰酶改变染色质结构，从而抑制了转录因子的正常结合 [62】。另外，染色质结构的凝集也阻止了转录因子和调控序列的结合【63】，而某些重要调控 元件的甲基化也会招致转录的中途停止p?。 现在普遍被人们接受的观点是植物基因启动子区甲基化通常抑制基因表达，但基因 编码区甲基化一般对基因表达的影响不大【叫。拟南芥的甲基化图谱清楚的表明,般地与 基因内部相比，基因的5’区有很低的甲基化水平，这表明，大体上启动子区的甲基化并 不适合基因的表达，启动子区甲基化的基因比在中间甲基化的基因表达水平低。拟南芥 全基因组DNA甲基化研究中发现基因内部存在广泛的甲基化修饰，大约有三分之一的拟 南芥基因是甲基化的，内部甲基化的基因通常中等或高水平表达，其平均表达水平显著 高于其它启动子区甲基化或完全未甲基化的基因【l五161。由5’甲基化引起的基因表达抑 制最明显的肛WA基因，它是一个野生型植物的营养生长的同源域蛋白编码基因。FWA 启动子含有正向重复序列，这些重复序列在CG位点是高度甲基化的，非CG位点也有一 4 东北师范大学博士学位论文 定程度的甲基化，在metl变异背景下重复序列的甲基化被降低导致晚花的发生165’66]。 许多报道发现即使在启动子未甲基化的情况下，基因自身的甲基化也能抑制基因的表达 【52(67t 681。在丝状真菌中有一个被称为MIP methylation 能引起重复序列上的胞嘧啶的甲基化，而编码区的甲基化导致正常转录产物 的降低和转 录起始位点与甲基化开始位点之间对应的区域的小的转录产物的产生，这说明甲基化能 阻止转录延伸【671。在植物的原生质体中有一个报道转基因的靠近5’端的编码区的甲基化 也能阻塞表达，尤其当这个表达是由一个弱的启动子来推动时郴J。然而，在这些实验中 所诱导的甲基化包括了一个序列上的所有胞嘧啶的甲基化，这点与拟南芥中发现的甲基 化优先发生在CG双核苷酸上并且有时涵盖很短的距离的情况不同。另外，甲基化的区 域对应着一个相对紧密的染色质结构，并且减少了RNA聚合酶II的浓度【69】。也有的实验 和野生型的总体转录水平进行了比较，研究了基因内部甲基化是否影响基因转录。结果 表明虽然metl突变体的甲基化或未甲基化的基因的表达都比野生型增加，但metl突变体 和野生型之间表达差异越显著的基因在野生型中甲基化程度越高。消除基因内部甲基化 超甲基化，从而引起异常的基因沉默，这可能是由于基因内部的甲基化抑制了不适当的 ”。综上所述，目前还没有发现DNA甲基化和基因表达机制转录起始【15(7 之间的直接联 系，DNA甲基化调控植物基因表达的详细机制还有待于深入的研究。 2非生物胁迫和表观遗传学 植物由于其静止不动的特点，就会受到各种环境的刺激，我们称之为胁迫，为了生 存下去，机体必须发展出复杂的保护和适应机制来面对胁迫以生存下去。胁迫最明显的 负面作用就是抑制植株的发育和繁殖【73’741，它可以决定植物种群的分布，更重要的是 可以为一个特定的群体提供重要的选择进化压力【J75】。根据其特点，胁迫分为内部胁迫和 外部胁迫。内部胁迫如基因变异或异常的细胞分裂导致对代谢和基因调控的不良影响。 植物所受到的外部胁迫进而又分为生物胁迫和非生物胁迫【_74】。生物胁迫包括病原体的攻 击等。非生物胁迫包括不适的温度、水、营养的缺失、干旱、重金属的污染等。机体有 三种不同的策略可用于最大限度地减少胁迫的影响力，他们是耐受、抗性、逃避或最终 逃脱，因为植物的生长的特点，只限于耐受、抗性、逃避机制。植物适应性的选择后产 生新的性状代表了长期生存的策略。植物利用其现有的遗传信息而需要一个短期的策 略。这些策略包括:在体细胞生长中植物自身内环境的改变【_76’77】，遗传或基因表达的 世代的修饰【78】，后者修饰可通过不改变原来的DNA序列而发生，就是我们知道的表观遗 传学。胁迫应答的可能机制是通过不同的染色质修饰来完成的，表观修饰允许不改变编 码DNA序列可逆的产生基因表达的新的遗传状态，并推出三个不同的水平包括DNA甲 基化，组蛋白修饰和染色质重型79’801。一些外部的和内部的刺激通过影响DNA甲基转 5 东北师范大学博士学位论文 始从常染色质到异染色质的转化。这些改变的可逆的特点是要么由一个在 DNA合成过程 中的被动去甲基化调节，或由DNA糖基酶DME和ROSl作用的一个主动去甲 基化过程调 酶的可逆的修饰，从而导致异染色质结构的增强。与此同时，甲基化的DNA 可作为一个 domain， DDMl控制的MBD Methyl(CpG-bindingMBD 蛋白结合的一个底物，这进一 Heterochromation 1 步启动异染色质信息并导致基因沉默。同样的，LHPl Like preotein OfMethylation1 ，可以以未知的机制在独立于DNA甲基化的方式上控制基 因沉默。DNA 序列的表观修饰代表了植物适应新环境和基因组进化的一个灵活而敏感的机制【8l】 图 1 。 胁迫条件下基因组表观遗传稳定性 包括DNA甲基化状态和染色质结构的稳定性 是反映基因组适应能力的一个重要标志。大量研究表明，植物对非生物胁迫在分子水平 上的响应是通过调节胁迫相关基因的转录活性来实现，是包括转录后修饰和翻译后修饰 共同参与的复杂过程【821。环境因子 如生物和非生物胁迫 和遗传因子 如杂交和突变 可促进新的表观遗传变异的产生。例如，有些作物尽管具有相对狭窄的驯化起源却能适 应各种生长环境，说明在环境胁迫中产生的新的表观遗传变异可能有助于植物的适应性 及表型上的多样性【83。删。在植物上，各种非生物胁迫 如低温、高压、航天等 可诱 导发生DNA甲基化变异和,或基因表达的变异，而且这种变异状态可以遗传给后代【85埘】。 Choi等研究表明，烟草NtGPDL基因可被非生物胁迫 重金属、低温和盐 所诱导表达， 而生物胁迫不能诱导其表达【88】。另外，非生物胁迫也可诱导转座子激活。Tam elementofAntirrhinum transposable majus 是在金鱼草中发现的温度敏感转座子，它在 致DNA去甲基化，他们认为这种温度敏感转座子Tam3的转座活性可能是通过调节对温 度敏感的DNA甲基转移酶的表达来实现的【451。我们最近的研究表明，各种非生物胁迫 包 括干旱、盐碱、低温、NO供体等 均可以诱导植物 水稻、高梁、玉米 发生可遗传 的DNA甲基化变异和基因表达的变异 未发表资料 。 对于重金属胁迫类来说，过量的必需元素和有毒重金属离子都能诱导细胞产生胁迫 应答并对细胞结构造成伤害，如细胞膜，蛋白质和DNA。植物拥有在毒性甚至是致死的 水平下快速的适应进而提高其抗性的能力，而一些植物即使在很低的重金属剂量下也很 敏感。重金属胁迫所诱导的表观遗传变异也有相关的报道，如重金属胁迫可诱导不同的 植物发生DNA的高甲基化或者一个剂量依赖的特异的低甲基化【蚍91】，可 诱导大量的基 因发生上调或者下调的表达的改变【92】，也可诱导特定的基因位点区域发生去甲基化的变 异并伴随着转录的激活【8引。 可见，非生物胁迫可导致基因组范围内许多位点的甲基化的变异，胁迫诱导的基因 、蛋白质编码基因的转录活性组响应变化包括转座子激活 主要在转录水平 变化甚至 基因组结构变异等，而这些变化可能与对胁迫的适应和耐受有关。 6 东北师范大学博士学位论文 cations Chr?mI继n Remodeling ??C^ (土盅||器盘 一cG一镰c^感一 NewSr州cesor TransmissionEstablishmentof I l Transgener鑫tionalI I Gene of Modifications NeW ExpressionI l Epigenefic I I EpiaJleles ofGenome RatesofEvolution Regulation Rearrangementsl I Changing and ofGenome TransposonActiv旧 l I Sequences and EnvironmentOil Geneticl evels Adaptation协New Epigenetic andKovalchuk，2007 图1(植物胁迫应答的表观遗传学机制 引自Boyko mechanism tostress F远1(Possible ofplantresponse 3本研究的背景、目的和意义 重金属是指密度大于59??cm3的一类金属元素，大约有40种，主要包 括镉、铬、汞、 铅、铜、锌、银、锡等。从环境污染方面所说的重金属，实际上主要是指汞、镉、铅、 铬以及类金属砷等生物毒性显著的重金属，也指具有一定毒性的,般重金属如锌、铜、 的微量元素，可是如果它们过量则具有相当的毒性【931。重金属污染是一个世界性的环境 问题，由于人类生产活动和全球工业化进程的加剧，如汽车尾气的大量排放、城市污水 及垃圾处理不当、工业生产所产生的三废的不合理排放以及现代农业中各种农药化肥的 大量使用导致土壤中重金属含量急剧增加，导致土壤植物系统中的重金属污染问题日趋 严重。重金属污染范围广、持续时间长、不易在生物物质循环和能量交换中分解，以及 其具有长期性、隐蔽性和不可逆的特点，使其在生物体内的累积可以破坏正常的细胞活 东北师范大学博士学位论文 动，可能影响从种子萌发到生长发育等多个生理过程，严重影响作物的产量和品质，更 重要的是可通过食物链严重的危害人类的生命和健康【94’95】。因此植物土壤的重金属污 染问题受到国际社会的普遍关注。我国在一些金属冶炼厂周围和长期污染的农地形成了 十几个典型的重金属污染地区，如江西的大余矿区、珠海冶炼厂和沈阳冶炼厂附近、东 北的沈抚灌区和北京的东南郊灌区等【96】。土壤中重金属的污染和植物的解毒和耐受之间 的作用一直是国际上研究的难点和热点。一些普通植物在金属胁迫下的分子 机理的研究 已经在进展中，有些植物在长期的进化过程中获得的独特的控制机制可以在对其他植物 而言是有毒的情况下生存。 目前，关于植物在重金属胁迫条件下的解毒和耐受机制研究进展包括以下几点， 1 植物根部和根系分泌物的功能研究进展。首先，植物根部表皮细胞的细胞壁、细胞分泌 物以及与植物共生的真菌的外生菌根对驱避重金属、限制重金属进入体内发挥着重要作 用。在土壤溶液中，根部表皮细胞的细胞壁与重金属直接接触，细胞壁作为第一道天然 屏障对重金属离子进入细胞起着重要的限制作用，还对重金属在质膜表面的活性具有一 定的抑制作用。另外，植物根系分泌物在控制重金属进入植物体中起着重要的作用。植 物根系分泌物种类繁多、成分复杂，其中研究较多的是有机酸、氨基酸和糖类等可溶性 的有机小分子及高分子，以及不溶性的粘胶类物质。最明确的关于根的分泌物在金属耐 受性中的作用的例子是有机酸和Al的解毒过程，荞麦通过从根部分泌草酸对舢胁迫作出 反应，并在叶中积累非毒性的朋(草酸盐，从而在内部和外部都发生解毒作用【97。1021。 2 植物的重金属胁迫和抗氧化系统。重金属胁迫与其它形式的氧化胁迫相似，能导致大量 的ROS 活性氧自由基 产生，ROS对植物细胞膜有伤害作用，植物体自身产生一种保 护系统来清除产生的自由基，以减轻危害。这套保护系统由非酶抗氧化保护 剂 还原型 染的严重化，增强植物抗氧化能力可能对提高作物的产量有很大的作用【l03’104]。 3 shock 热激蛋白 HSPs，heat proteins 在重金属胁迫中的作用。在正常的蛋白折叠和组 装过程中HSPs可以作为分子伴侣，在逆境条件下也可以通过修复被胁迫伤害的蛋白而发 挥作用。目前已有多个植物响应重金属胁迫提高HSP表达的报道，Tseng等证明热胁迫和 指出当植物海石竹 Armeria 反应，抗体定位表明HSP70存在于细胞核和细胞质中，也存在于细胞膜上，说明HSP70 可以保护细胞膜不受cd破坏【107】;最近研究表明，水稻rHsp90基因在对酵母以及烟草在 逆境环境中的生存发挥着重要的作用，然而，rHsp90基因在逆境环境中真正的作用机制 还不清楚，这还需要我们通过研究它作为分子伴侣与其它功能蛋白的互作关系来做进一 步解释【lo引。 in 化合成的、由长度不同的肽链构成的、富含Cys的多肽。其作用概括起来主要有两方面: 8 东北师范大学博士学位论文 一是与毒性重金属络合形成配体复合物而保护植株免受毒害，另外调节并维持植物体内 金属离子的平衡。目前在植物中分离到的PC多是镉离子结合物，很多证据表明植物络合 素在Cd解毒过程中具有重要作用。PCs还可能在As的解毒机制中发挥主要作用，实验表 明砷酸盐离子和亚砷酸盐离子都可以有效的诱导PCs的合成。还有多种重金属可以诱导 植物合成PCs，而且在体外实验中都可以与PCs结合形成复合物。目前在小麦和拟南芥中 它是一类低分子量、富含Cys残基的金属结合蛋白。由于巯基含量高，对重金属的亲和 子的毒害、维持组织中金属离子的稳态以及调节金属离子向特定组织的运输等方面起重 表达，作用可能是将必需的金属离子从老叶运输到年轻的、生长旺盛的组织以维持正常 的生长发育以及螯合有毒金属维持重金属内环境平衡以阻止重金属通过产生ROSzJI起 的高表达可适应环境胁迫，如OsMT-1(2c在幼叶中不表达，在重金属胁迫处理后表达， Ctr 它在根的发育和种子萌发中起作用【118。1231。?铜转运蛋白家族 Coppertransport， resistance 其他4种在叶片和茎中的表达均高于根部【l肄126】。@Nramps家族 Natural associatedmacrophageproteins 也位于液泡中，是自然抵抗相关巨噬细胞蛋白类，是一 128]。 个高度保守的膜主要组成蛋白的家族，参与大多数有机体的金属离子运输过程【12L 该家族基因目前已在很多高等植物中发现，在拟南芥中表达纯化得到了6种蛋白，在水 ATPases 位于叶绿体中，是一种通过水解进行跨膜运输的运转 P型ATPases P ? type ATPase是与多种重金属离子的传 蛋白。根据其底物特异性可以分为5类，其qhPl咖e metalATPase cassette 它基因具体的功能还有待于深入的研究【1加】。?ABC载体 ATP(binding 咖sporters 位于植物体液泡膜上，是一种种类繁多、分布广泛、运转物质类型多样的 9 东北师范大学博士学位论文 resistance(associated resistance 141’14zJ。目前水 proteins 和PDRs Pleiotropicdrug proteins 1 也位于植物体液泡膜上，它们参与细胞液中Ca2+和Na-浓度调节，在拟南芥中，CAXl、 伽C觚，口在所有的器官中都表达，OsCAXlb和伽C觚，c只在特定的器官中表达并且表达 量特别的低，OsCAX2和OsCAX3的表达量存在着器官的差异。进一步的研究表明， 要的作用【15m1521。 由于植物的重金属毒害是多方面的，其抗性机理也十分复杂，植物的重金属毒害及 其适应性是多种生理过程的综合反应，因此其中何为关键因子至今还不明白，在植物细 胞中是否还存在其他的解毒机制还需继续探索。本研究的目的就是研究水稻在重金属胁 迫下所发生的表观遗传学变异与其抗逆性之间的关系。希望通过本研究阐明表观遗传稳 定性对水稻提高抗重金属胁迫能力方面的可能的作用和贡献，从表观遗传学角度探讨水 稻应对重金属伤害和提高抗性的分子基础，为更深入的研究植物抗重金属胁迫的机制和 培育抗重金属水稻新品种提供一定的理论依据和参考。 10 东北师范大学博士学位论文 材料与方法 1(实验材料 sativa 水稻 OryzaL( 粳稻品种(松前 ( 2(实验方法 2(1植物材料的重金属胁迫处理 松前种子用双蒸馏水清洗后放在28oC的暗培养箱中，2天后将萌发的 种子转到温 度为260C，每天光照12小时的温室中生长到一叶一心期时选取长势一致的植株对其进 行连续处理7天，处理过程中每天都换新鲜的重金属处理液以保证其有效的处理浓度。 对照植株只在Hoagland营养液中生长。7天后对照植株和处理植株都有一部分转到大田 生长，还有一部分植株的叶片被剪下来后立即冻在液氮中，然后于(800C保存待用。重 ，当代对照植株记为CO，一些M0和CO的植株金属处理的当代植株记为M0 的后代记 为MI和Cl，同样，一些MI和C1植株的后代记为M2和C2。 2(2植物基因组DNA的提取与纯化 用改良的CTAB法【”3】提取各种植物材料的叶片的基因组DNA。将植株在液氮中研 Sorbitol， 磨成粉，转入50ml离心管内。加入等体积DNA提取缓冲液 A液:0(35mol,L 0(1mol,LTris(HCl ris―HCl EDTA;B液:0(2mol,L'I ，0(5mmol,L pH7(5， pH7(5 0(05mol,L EDTA，2mol,L rain。然后加入等体积的氯仿:异戊醇 24:1 ，轻轻 浴摇床上，于40(50rpm下振摇90 集，收集的DNA于70,乙醇中过夜。然后将弃去乙醇，风干后的DNA加lmlTE使其 溶解。 TE中。待DNA完全溶解后进行1,琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据 200(500I-tl 已知的DNAMarker估计其浓度。调整浓度后的DNA置於(20?备用。 东北师范大学博士学位论文 2(3Southern杂交分析 2(3(1 DNA酶切: I 购于NewBiolabs 采用甲基化敏感同裂酶HpaII、Msp EnglandIne( 消化水稻基因 组DNA，HpaII酶切3嵋DNA，MspI酶切4嵋，50I(tL反应体系，在37。C条件下酶切 12小时。采取过量及过夜酶切以保证酶切完全。 2(3(2 Southern印迹 取出自然干燥，常温保存备用。 2(3(3探针的分离 制备探针的引物是根据NCBI上提供的水稻基因组序列的，所用引物如下表1。 PCR产物通过测序验证。 表1(用于扩增水稻的低拷贝的转座子和基因的探针的引物 to of6 and active Table1(Pl'inlel苫usedthe fragmentlow―copypotentially amplifyprobe mobileelementsand10 cellularinrice low―copy genes 12 东北师范大学博士学位论文 2(3(4探针标记、Southern杂交及杂交信号的检测 Pharmacia公司生产的Gene Direct 探针的标记使用Amersham Images Alkphos LabellingSystem试剂盒进行，具体操作见试剂盒说明书。 探针的检测包括以下步骤: SSC、 将膜和标记好的变性探针加入杂交液在60?杂交过夜。 杂交液成份包括:5X block 试剂盒提供 。 0(1, w,v SDS、5,硫酸葡聚糖、1,20体积的Liquid 60。C条件下洗脱液I 成份:1X 份:O(5XSSC、O(1, w,v SDS 40分钟。 block 将膜放入溶液I BufferA稀释10倍的Liquidregent 中，室温洗涤l 小时; 溶液II中 成分:anti--fluorescein--AP 每次15分钟;最后取适量的检测液检测。 暗室内进行压片、显影、停影和定影。 2(4亚硫酸盐测序 用ZYMORESEARCH生物科技公司生产的“EZDNA甲基化试剂盒(Gold'’试剂盒来 处理松前的基因组DNA，使未甲基化的胞嘧啶全部转换为尿嘧啶。具体如下: 2(4(1 C-T转换试剂使用前的制备 Conversion 试剂盒中所提供的CT Reagent是固体混合物并且一 定要在首次使用前制 M-DilutionBuffer到一管的 Buffer和300p,l 备好。通过添加900肛l水，50 tl的M(Dissolving CTConversion Conversion 看到没有溶解的试剂是很正常的，因为在溶液中的CT Reagent已经达到饱和 Conversion 状态。在使用之前将CT 的CTConversion Conversion Conversion Reagent应当在制备后立即使用。如果不立刻使用的话，CT Conversion Reagent溶液 。C存储1星期。而且在使用之前存储的CT Reagent溶液可以在-20 Conversion 一定要在室温下解冻并且通过震动或颠倒2分钟来混合。CT Reagent对光很敏 感，所以要尽量减少在光下的暴露。 2(4(2 C(T转换的操作过程 每次制备的DNA范围在500pg到2pg之间。最佳量为200-500ng。 Conversion 1(在PCR管中添加130?l的CT 品的体积小于20pl，则用水来弥补差量。通过轻弹试管或移液器操作来混 合样品。例如: CT 4“lDNA样品，加入1681水补充至U20p,1，再加入 1301(dConversionReagent。 Conversion 注意:对于DNA体积 20p1，就要调整CTReagent的制备过程。对于每 增 DNA样品，就 要添 加10J(tlDNA样品体积来说，水的量就要随之减少100肛1。例如，40I_tl Conversion ul。不 加700ul来制备CT Reagent。DNA样品的最大体积为每次转化反应50 Buffer或M―DilutionBuffer的体积。 (Dissolving 要调整M 东北师范大学博士学位论文 2(将样品管放到循环变温器并按以下步骤操作: 1 98?放置lO分钟 2 64?放置2(5小时 3 立刻进行下述操作或者在4"C下存储 最多20t]、时 。 ICTM 3(添JJH600肛I的M-Binding Column中，并将柱放入试剂盒所 Buffer至UZymo(Spin 提供的CollectionTube中。 ICTM 4(装填样品 从步骤2 到zyIno(SpinColumn含有M(BindingBuffer。盖上盖将柱 颠倒数次来混合样品。 5(全速 10，000X曲离心30秒。去除流出液。 Bu仃er到柱中。全速离,L,30秒。 6(添JJIll001上l的M(Wash 7(添加2001上1的M(Desulphonation l5(20分钟。在培养后，全速离,L、30秒。 8(添加200“l的M(Wash Buffer并且离心30秒。 9(直接添]JI]101xl的M(ElutionBu位r到柱基质中。将柱放置在1(5ml的管中。全速离心 来洗脱DNA。 的DNA。 2(4(3序列的PCR扩增及纯化和回收 sequencing 的引 物，对于正向引物 P1 ，将原始序列中是C的碱基改为兼并碱基Y，可以扩增C和T; 对于反向引物 P2 ，将原始序列中是G的碱基改为兼并碱基R，可以扩增G 和A。 表2(用于亚硫酸盐测序的扩增引物 Table2(Primersfor bisulfite sequencing 14 东北师范大学博士学位论文 PCR反应条件如下: 201(d的反应体系包括: 模板DNA 2?l 10xPCRbuffer 2Ixl 2(5mMdNTPs 21xl P1 101xM 11(d P2 101xM 11(tl DNA Taq polymease 0(20(1 8肛l Water 11( 35个循 环，最后再72?延伸10分钟。 PCR Purification PCR产物的纯化回收使Promega公司生产的WizardPreps System 试剂盒，操作按说明书进行。 Vector