用荧光法测定自然水域中总硒及其溶解硒的成分.doc

用荧光法测定自然水域中总硒及其溶解硒的成分.doc 用荧光法测定自然水域中总硒及其溶解硒形态 摘要:我们发现了一种可以在自然水域中以ng量级低含量的总硒以及水中溶解 的测定方法。通过AG2-X8离子交换树脂可以对水中的四价硒和六价硒进硒形态 行分离，经过柱子XAD-8可以达到对溶解的酸性、以及中性有机硒的分离。分离出来的样品取其50-200ml于烧杯中加入HNO(2.5ml/L)后放置于电热板上加3 热，然后再加入混合酸HNO/HCLO(2/1,V/V)。经HCL还原后与DAN复合所34 形成的绿色荧光物质可以被环己烷提取出来，通过测定其荧光便能得出样品中相关硒的含量。50ml水中，硒的回收率是97.9-104%，平均回收率为99.9%(n=20)。水中总硒的检测线是0.35ng(空白值+2标准偏差)，而且对于硒含量范围为28ng/L-115ng/L水样其精确度可以达到2.1%。对于单个溶解硒的形态，其检测线均低于1.8ng/L。 简介 在过去几十年里，有许多有关于动物和人类的硒缺乏病和硒中毒的病例报道。近年来，许多研究者集中于对环境中硒的行为尤其是水域中硒的毒性的研究。在环境中，与有关病症的硒中毒和缺乏之间的浓度范围是相当小的，尤其是在自然水域生态系统中。Lindstrom曾经报道说:在硒含量为50ng/L的水域中生物的繁殖、最终产量和藻类的繁殖是最大的。Lindstrom也曾经报道过在瑞士的Erken湖泊中，在硒含量大于20-70ng/L的系统中随着硒含量的降低藻类的生长加快，而在硒含量为大于80ng/L的系统中随着硒含量的增加反而降低了藻类的生长速度。这可能是在水域中硒含量高达3000ng/L时降低了原生动物的繁殖力。硒的生物可利用率取决于环境中硒的化学形态。进一步的有关于自然水域中硒的总含量和溶解的不同的硒的化学形态的了解将有助于帮助我们硒的环境生物地球化学过程。 自然水域中硒的含量通常是很低的，在芬兰地水、江河、湖泊中硒含量的中位值仅有60-70ng/L。有许多方法是可以达到对自然水域中总硒和溶解硒的成分进行测定的，但是他们的检测线通常很低以至于不能对低硒水域的水样进行测定，或者是由于方法要对样品进行很复杂的前处理而难以实现。因此，目前最首要的任务就是要发明一种能对自然水域中硒含量达到ng/L的水样进行简单快速和灵敏的检测方法。 在以前报道的有关四价和六价硒形态的分析中通常是往水样中加入了酸或者是可溶提取而发生的氧化还原反应，但是该方法是往样品中加入了大量的酸可能会导致检出限偏高的结果，所以该方法的准确性往往取决于操作步骤的精确性。Tanzer和Heumann将样品过AG1-X8柱子成功的实现了四价硒和六价硒的分离，但是这种方法没有达到对水溶性硒和中性有机硒的分离，这可能是由于用于浸提的甲醇在蠕动泵中浓度的逐渐降低所造成的且甲醇和水的混合在柱子中所形成的气泡可能会影响方法的准确度。Leenheer曾通过对水样的分离和溶解的有机碳分析的方法，该方法可以运用到水中硒形态的研究。该研究的目的是为了达到对自然水域中总硒和硒的形态较低检测限且具有较好的精确度和准确度的方法的 研究。 实验部分 。 铂金模型LS-5荧光分光光度计，带有ASI-5000自动进样器的TOC-5000仪器 有机碳分析仪，2000W电热板，含60孔德铝加热器(直径18mm，高度65mm)， -mm玻璃电极的701-APH计，烘箱，水浴，蠕动泵132100(海德尔堡，直径为6 德国，柱子9*300mm(砝码西亚纯化学试剂，无普萨拉，瑞士)，柱子14*100mm(美国)，玻璃振荡器(250ml)，玻璃盖子(16*125mm)，所有的玻璃仪器均为硼硅酸盐并且用酸浸泡。 试剂。用分析纯制成的硒标准储存液0.5g/L(默克，德国)，将标准硒溶液用0.1M HCL稀释为1ug/ml，硒酸钠(分析纯，BDH，英国)，硒代蛋氨酸(西格玛，美国)。 2,3-二氨基萘(DAN):将0.2g分析纯的DAN溶解于200ml 0.1M HCL所形成的0.1%的溶液用10ml环己烷萃取5次。 AG2-X阴离子交换树脂(美国伯乐，美国)200-400目，非离子聚合物吸收的离子交换树脂XAD-8(西格玛，美国)，20-60目。 所用的水是经过有机物吸收，离子交换和过滤程序的水纯化装置 EDTA，NHHCL，NaOH均为分析纯(默克，美国) 4 ， 98-100% HCOOH，要用到以下的试剂:37%HCL，65%HNO，70-72%HCLO34 30%HO，25%NHOH，乙氰，乙醚(均为默克，美国)，分析纯的甲醇(英国) 224 操作步骤 (1) 准备柱子 AG2-X8柱子. 树脂不断用1M HCOOH和3M HCL进行清洗，再用蒸馏水洗涤直至中性。然后将其加入到直径为14mm高度为100-mm的柱子中，往柱子中加入15ml的1M HCOOH过柱后再往柱子中加入30ml蒸馏水，如此连续3次并且将最后一次的洗出液作为四价硒空白值。同样的方法往柱子中加入15ml 3M HCL和15ml蒸馏水且将最后一次的洗出液作为六价硒的空白值。在进样品之前要使柱子中流出的液体的PH达到中性。 XAD-8柱子. 柱子的洗涤详见Thurman和Malcolm。柱子再用甲醇、乙醚、乙氰进行洗涤之后储存于甲醇中待用。在装柱子之前要将甲醇倒出并加之蒸馏水。将树脂加入直径为9mm高度为300-mm的柱子中后往柱子中加入50bed蒸馏水。然后用10ml 0.1M HCL和30ml蒸馏水进行过柱且将最后一次的洗出物作为腐殖酸硒的空白值。 (2) 分离四价硒和六价硒 自然水域中硒的分离步骤详见数据1。所有的水样都要先经0.45um的滤膜过滤再以约4ml/min中的速度经离子交换树脂进行过柱，等水样过完柱子后加入30ml蒸馏水于柱子中。 (3) 有机硒的分离 往XAD-8柱子中加入约200ml水样品以4ml/min的速度过柱，待过柱完后加入30ml蒸馏水。再将柱子进行倒置，往柱子中加入10ml 0.1M HCL过柱后再加入30ml0.01M HCL。 腐殖酸部分 将样品调节到PH至2，加入柱子中以4ml/min的速度过柱，再往柱子中加入30ml 0.01M HCL以去除未被树脂吸收的部分。加入10ml 0.1M NaOH让树脂解吸出腐殖酸来后再加入30ml蒸馏水。迅速将柱子调节到PH为2以防止腐殖酸的氧化。 中性硒部分 将柱子取下来取出树脂让其在室温下干燥，将干燥了的树脂用15ml 甲醇进行洗涤，再将洗出的部分加入硝酸在电热板上加热处理。 以上的不同形态的硒的成分的测定与总硒的测定步骤相同，在进行加热消解之前先取5ml出来用作TOC测定。 (4) 总硒的测定 取50-200ml水样于250ml烧杯中，加入0.25ml浓硝酸和少量的石英砂后将烧杯置于电热板上缓慢加热直至剩余2-3ml。将烧杯中剩余的部分转移到试管中并将烧杯用少量蒸馏水洗涤两次且将其转入试管中。往试管中加入少量的石英砂和1.5ml硝酸和高氯酸的混合酸(V/V，2/1)后置于110?的铝试管加热器中加热6小时或者过夜。将温度升到150?保持该温度1小时后又将温度升到180?保持该温度1小时，此时约有0.5ml剩余液体。待其冷却后加入4滴HO置于150?下加热10min。为了将所有的六价硒还原成四价硒，我们加22 ?环境下加热10min。待其冷却后加入0.5ml 入0.67ml的浓盐酸并将其于110 0.2M NaHCL，约1ml 1:1 25%NHOH(V/V)，再用4M HCL-EDTA，0.5ml 0.1%NH244 或者是NHOH将混合液的PH调节为1.5-2.0。加入0.5ml 0.1%DAN摇匀后置于4 50?水浴中加热20min，取出于冷水中冷却。再往试管中加入2.5ml环己烷手动 ，在两小时内测定环己烷层的荧光，仪器的设置为激发波长为370nm、萃取约1min 发射波长为518nm。在试验的操作中同时要有两个空白值和5,10,15,20,25,30ng 标准系列以相同的操作步骤进行实验。 结果和讨论 前富集 由于在自然水域中硒的含量通常是很低的，所以试验也通常要对水样进行前富集。简单的方法就是对水样进行加热浓缩，如生物样品和土壤样品但通常还要加入混合酸进行消解。为了减少在蒸发过程中所造成的硒的挥发损失，实验中我们测定了不同酸的加入，将0.5ml酸加入到200ml的纯水中只有加入硝酸的有最高的回收率结果如下:亚硒酸钠98.8%，硒酸钠98.1%，蛋氨酸硒87.3%。在水样有这样好的回收率已经是很好的结果了。选择纯水做回收实验是因为不同形态的硒其稳定性在纯水中要比在其他水环境中要稳定些。加入到纯水中的四价硒和蛋氨酸硒存储在聚乙烯玻璃瓶中放置在室温下其损失分别为57.1%和42.0%。在相同的环境条件下储存在井水、江河和融雪中其损失分别为3.5%、17.6%、24.6%(王，未发表数据)。然而巧合的是，很多研究者都是用硝酸来保存水样。如果加入量为2.5ml酸/L样品，那么在加热消解的过程中就不需要再加入酸了。将0.25ml亚硒酸钠加入到50ml江河水中其回收率如表2所示，其平均值?标准偏差为99.9?1.9%(n=20)。 准确度和精确度 由于没有含量为ng/L级的标准水样和参考样品，所以只能是靠测定不同水样的 回收率来确定方法的准确度了。用该方法来对河水，自来水和融雪进行样品之内和之间的测定其回收率如表3所示。在水样浓度为28-115ng/L的样品中测定8个样品得出的变异系数?2.1%。该方法测定出的样品内的准确度高于样品之间的准确度，这可能是由于水样品在存储中的损失所造成的。 用该方法测定土壤样品，沉积物和生物样品时是以加入1.5ml的硝酸和高氯酸的混合酸消解开始的。测定9个标准土壤样品得出的结果为553?12ng/g，与标准值的490ng/g相比较其变异系数为2.2%。对于另外一份由科希策的放射生态学和应用核技术机构提供的标准土壤样品和赫尔辛基大学食品化学化工提供的标准参考小麦样品，芬兰的7个不同实验室用不同的方法测定出来的结果与用该方法测定出来的结果具有可比性。 四价硒和六价硒的分离 测定总硒和硒的形态以空白值?2标准偏差得出的改方法的检出限均小于1.8ng(表5)。有一个极端例子是在芬兰一湖泊其表层水硒含量为最低值仅为25.4ng/L，然而在该处地表水硒的含量为4.1ng/L。所以该方法可以测定所有自然水域硒的含量(200ml水样品)。 将100ng的硒酸钠和亚硒酸钠加入到纯水中其分离结果如数据1所示，溶液在柱 。其中六价硒的回收率为100?3%，四价硒的回收率为98.3子中的流速为1ml/min ?4.0%(n=3)。为了证实树脂的能对硒酸钠和亚硒酸钠的分离效果，实验中我们往柱子中加入了含100ng硒酸钠100ml蒸馏水中加入了，测定结果表明有100.7ng的硒在3M HCL中即为硒酸钠的成分，而在1M HCOOH中所测得的亚硒酸钠的成分仅和四价硒的空白值一致。自然水域中硒的形态如表六所示，在两个河水中硒六价硒的含量大于或者是等于四价硒的含量，这和日本水域中报道的结果是一致的。美国曾经报道说四价硒是雨水中主要的形态，而在融雪、自来水和地表水中六价硒则是主要的形态，在湖泊中腐殖酸硒则占据到总硒的55-59%而四价硒和六价硒仅占了15-23%。 分离疏水性硒、中性硒和酸性硒。 对于疏水性硒的分离方法是采用了Leenheer对于自然水域中溶解的有机碳形态分离的方法。实验中分别测定了在25ml蒸馏水中加入硒酸钠、亚硒酸钠和疏水性硒在PH为7和2的环境下经过柱子XAD-8过柱后其各自的回收率，之所以要选择两个不同的PH环境是为了保证测定时疏水性硒和酸性硒不会过多的停留在柱子中造成很大的测定误差，实验得出了 很满意的回收结果其中3种形态的硒回收率均到达均超过了90%。作为水溶性氨基蛋白硒的硒代氨基酸在PH为7时回收率为90.9%。在PH为2时回收率为92.7%，但是其回收率均小于硒酸钠和亚硒酸钠，这可能是由于试剂在长时间的储存中的少量分解所造成的。当前所用的方法可以适用于江河水样和湖泊水样的测试。硒形态的结果和DOC含量如表8所示。疏水性硒和有机碳含量与检测限接近。有机硒部分包括疏水性和亲水性部分仅为表层水DOC的5%，因此要想对这部分硒形态进行测定就得用更加灵敏的分析方法。同样的，有机中性硒也仅占DOC的5%，而且用该方法所分离出来的疏水性的中性酸硒也有可能含有亲水性的硒成分这是由于亲水性成分的硒有可能吸附在柱子中，由于方法的回收率不可能达到 100%，因此用这种方法只能是用来对其含量的一个初步评价。用DOC来衡量的疏水性酸中的酸性有机硒在湖泊中是总溶解性硒含量的55%以上。在湖泊中藻类对腐殖酸的生物利用性和其生态功能是一个很有意义的研究方向。不同硒形态的总和是比总硒的含量少的，在河水中它们的总和只是总硒的89%，而在湖泊中却只 。这是由于在测定中没有包括亲水性的硒、中性硒和酸性硒部分。只有当有79% 这些形态的硒能够被分离且达到测定其含量才有可能达到总硒的含量。 总的来说，这个方法不仅简单准确、灵敏度也很高，而且在测定的过程中不需要特殊的仪器和试剂，可用于所有自然水域中硒的测定。