速效止泻胶囊的有效物质基础及夏枯草中二萜类化学成分研究

速效止泻胶囊的有效物质基础及夏枯草中二萜类化学成分研究 密 级 分类号 学校代码 鱼鲤 学位论文 速效止泻胶囊的有效物质基础及 夏枯草中二萜类化学成分研究 资助课题四号宋体居中 指导老师姓名四号黑体: 渣 里 丕 申请学位级别: 亟? .专业名称: 虫药堂 论文提交日期: ?.生.;旦.论文答辩日期:圣生鱼旦 学位授予单位和日期: 贵旦史医堂随三生鱼旦 ‘ 贵阳中医学院硕士学位论文相关声明 原创性声明 本文声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的地方外,论文 中不包含其他人已经发表论文中撰写过的研究成果,也不包含为获得贵阳中 医学院或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本 研究所作的贡献均已在论文中作了明确说明。 弋 日期:。多年 』月,日 储:伤 关于学位论文使用授权说明 本文了解贵阳中医学院有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权 保留学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部 或部分内容,可以采用复印、缩印或其他手段保存学位论文;学校可根据国 家或贵州省有关部门规定送交学位论文。 毛月工日 储鹕呜觋剔嗽:贵阳中医学院硕士学位论文 目 录 摘 要?. 关键词:? .?.......?。...?..??.??....??...?..... 前言第一章速效止泻胶囊有效物质基础的研究一 速效止泻胶囊的研究背景? . 拳参 .拳参化学成分研究进展.拳参的药理作用..止泻作用??一 ..治疗十二指肠炎和溃疡 ..中枢抑制作用? ..抗心律失常..保护心肌的作用 ..镇痛作用 ..抗菌作用 研究的立题依据实验内容.实验仪器与材料??. .。实验仪器 ..实验药材??一 .实验与方法??. ..】实验设计一?.. ..实验设计二。 本章小结?。 第二章夏枯草中二萜类化合物的研究?一贵阳中医学院硕士学位论文 研究的立题依据与意义?一 实验内容与结果?一 .实验仪器与材料..仪器??. ..实验药材.实验方法与步骤.结构鉴定与波谱解析 ..化合物结构鉴定?.? ..波谱解析??. . 法检测夏枯草中二萜类化合物?.. 本章小结?一 第三章实验结果与讨论?一 速效止泻胶囊有效物质基础研究的实验结果与讨论?一 .结果 .讨论 夏枯草部分实验结果与讨论 .结果 .讨论 至谢?. 参考文献??一 附录附录缩写列表附录夏枯草综述?. 附录?化合物图谱? 附录?个人简历贵阳中医学院硕士学位论文 摘要 本论文主要由两部分组成;第一部分:对贵州省科辉制药厂生产的速效止 泻胶囊中有效物质基础进行研究。因中拳参含有的大量鞣质有可能会与 盐 酸小檗碱结合生成络合物,从而会降低其止泻功效;通过两种实验设计方案, 可以发现没食子酸和鞣花酸均为拳参主要鞣质成分之一,并考察没食子酸、 鞣 花酸分别与盐酸小檗碱、明胶溶液结合前后的变化情况,可知没食子酸结合 前 后变化均不明显,而鞣花酸结合后有沉淀生成,且含量会降低。本研究结果可 以考虑向速效止泻胶囊中加入适量的明胶进行改进,同时将采用拳参有效部 位 来代替拳参的全粉以实现降低药量增加药效的作用,并通过药理实验对改进前 后的速效止泻胶囊进行药理实验。 第二部分:本课题组前期从夏枯草石油醚层分离得到一个新骨架二萜化合物 .,为了对其相似化合物的研究,本课题对夏枯草进行再研究,期望得到 更多二萜类化合物。通过对夏枯草进行提取分离,应用硅胶、葡聚糖凝胶 .、等分离纯化方法和技术,经反复柱层析和梯度洗脱、高 效液相色谱正相系统、高效液相色谱反相系统多次分离得到个二萜类化合物, 分别为.、.、.和.,其中.为新骨架二萜化合物本 课题组前期从夏枯草中已分离得到过,.、.和.为与. 结构类似的二萜类新化合物。并以.、.为对照品,用高效液相色谱 、 、 、 、 、 、 法对 、 、 、 、 等多地夏枯草进行定性研究;结果 发现均可能含有.和.。为黔产夏枯草中二萜化合物的研究提供了一 定的科学依据。 关键词:速效止泻胶囊;物质基础;夏枯草;提取分离;含量测定贵阳中医学院硕士学位论文 .、耐也 .. . .、析 , . . . .、析, . 堰 一, , , ,, 一., ,: .. . ? ,,, .,, . ; 【 ; 】 ; ;. 贵阳中医学院硕士学位论文 ?. ??.? 刖舌 第一章速效止泻胶囊有效物质基础的研究 速效止泻胶囊的研究背景 .拳参 括幻,.触.的根茎,多 拳参,蓼科蓼属植物拳参 年生草本,别名紫参、牡蒙、山是、草河车、倒根草,一般春、秋季挖取根茎, 除去须根,洗净,晒干。主产华北、西北及山东、江苏、湖北等地。 形状特征:根茎呈扁长条形或圆柱形,常弯曲成小虾状,表面褐紫色至紫黑 色,稍粗糙,一面隆起,另一面有凹槽,整体通显密粗环纹,有很多残留须根, 须根稍用力易掰断甚至粉碎,全草高通常达到~厘米;外皮红紫色,茎直 立,不分枝。 苦、涩,微寒。归肺、肝、大肠经。中药拳参主要用于治疗清热消肿,镇惊 理湿,?血止血;解毒散结;痔疮出血;痈肿疮毒等病症;西医中常用其来治疗 慢性气管炎、肺结核和痢疾、肠炎等,其中对痢疾和肠炎效果显著,还用其来 辅 助治疗婴儿腹泻、婴幼儿秋冬腹泻等,效果均显著‘】。 .拳参化学成分研究进展 目前,对拳参的化学成分的研究报道比较多,但由于其主要含有的化学成分 为鞣质一类,导致对其进行细致的研究报道比较少。 据文献报道【棚,拳参主要含有化合物为绿原酸 、丁二酸 、没食子酸 、槲皮素等。 刘晓秋‘等从拳参乙酸乙酯萃取层分离得到个化合物,分别是没食子 酸 、丁二酸 、槲皮素和原儿茶素 ,一 等; 刘晓秋】等从拳参正丁醇萃取部分分离得到个化合物,经理化测定和波谱 数据解析,确定为丁香苷、儿茶素、芦血和黄烷木 质素类化合物。 肖凯等?从拳参丙酮提取物中得到个化合物,经理化测定和波谱数贵阳中医 学院硕士学位论文 据分析,确定为没食子酸 、色氨酸、,.二羟基苯 甲酸,? 、儿茶素一】等。 竺叶青等‘对通过生药学鉴别拳参和拳参类似品,结果发现拳参中含有没食 等,并高锰酸钾法和皮粉法对其拳参 子酸 、鞣花酸 中鞣质的含量进行测定,为蓼科拳参类生药品的鉴别与质量的提供 了科 学依据。 .拳参的药理作用 ..止泻作用 戚懋材等‘利用拳参治疗婴幼儿秋冬腹泻,结果表明效果良好,且缩短了婴幼 儿的疗程,服用方便,治疗剂量无副作用。 ..治疗十二指肠炎和溃疡 曲良烈等利用复方拳参片治疗胃十二指肠炎和溃疡,结果表明,在治疗剂 量内效果明显,无副作用。 .中枢抑制作用 曾靖等【利用拳参的正丁醇提取物进行药理活性研究,通过观察拳参的正丁 醇提取物对小鼠的药理学活性试验,发现拳参正丁醇提取物具有明显的中枢抑制 作用。 ..抗心律失常 曾靖等四利用拳参的正丁醇提取物进行药理活性研究,通过观察拳参的正丁 醇提取物对小鼠的药理学活性试验,发现拳参正丁醇提取物具有明显的抗心律失 常作用。 ..保护心肌的作用 叶和杨等【刀利用拳参的正丁醇提取物进行药理活性研究,通过观察拳参的正 丁醇提取物对大鼠的药理学活性试验,发现拳参正丁醇提取物对大鼠结扎冠状动 脉的损伤有明显的保护作用,并且通过提高心肌组织的超氧化物歧化酶降低丙二 醛,降低血清乳酸脱氢酶和磷酸肌酸激酶,清除自由基,防止脂质过氧化而保护 心肌的作用,据试验表明,该保护作用随着拳参正丁醇提取物的剂量增大而增强。 ..镇痛作用 黄玉珊等四利用拳参的正丁醇提取物进行药理活性研究,通过观察拳参的正 贵阳中医学院硕士学位论文 丁醇提取物对小鼠的药理学活性试验,通过醋酸扭体法、热板致痛法、电刺激致 痛法,发现拳参正丁醇提取物具有明显的镇痛作用。 ..抗菌作用 刘春棋等【】通过滤纸片对拳参提取物进行抑菌试验,结果发现不同浓度的拳 参提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有一定的抑制作用,其抑菌作用与其浓度 呈正相关关系,但有一定的剂量依赖性。 研究的立题依据 腹泻或称腹泻病,是由多病因、多因素引起的以腹泻为主的一种综合征,是 因幼儿常见病,为世界性公共卫生问题。腹泻主要分为两种,一种是感染性腹泻, 另一种则是非感染性腹泻。其主要临床表现为腹泻和呕吐,严重者可引起脱水和 电解质紊乱。本症为婴幼儿时期的常见病,近年来本病的发病率已明显降低,但 仍是婴幼儿时期的重要死亡原因,因为小儿年龄较少,体内的各种器官都还没有 完全发育,第二个是因为小儿成长发育比较快,有丰富的营养物质会使得消化功 能发生作用的时候导致紊乱。还有其他很多导致腹泻的病因正在研究中,比如: 气候的变化,也可造成腹泻,如受?可以使肠道功能紊乱;气候炎热或穿着过热 可以使胃酸及消化酶分泌减少,而造成消化不良,形成腹泻。 腹泻是临床上常见的肠道传染性疾病,随着我国城乡居民生活水平和饮食结 构的改变,消化系统疾病的发生率一直呈上升趋势。对于腹泻病的治疗原则,主 要有提早纠正体液不足及电解质失衡、提倡不禁食、预防脱水、合理使用药物、 使自身肠道菌群得以平衡稳定。对此,目前市面上对于治疗腹泻的常用药物是氟 哌酸等以西药见效快为主的药物,但其缺点是毒副作用较大、赖药性叫强,相对 目前常用的抗生素类药物而言,“速效止泄胶囊毒副作用更小,同时考虑到本 品简单,原料价廉易得,产品价格相对便宜,因此,对“速效止泻胶囊”进 行二次改进后特别是在小儿腹泻药物市场上的前景尤为看好。使其在为腹泻患者 解除病痛的同时,也能带来良好的经济效益。 贵州省科辉制药厂生产的“速效止泻胶囊由盐酸小檗碱黄连素和中药 拳参组成。经文献报道,拳参中含有大量鞣质,考虑到鞣质可能与盐酸小檗碱反 应成为不溶或难溶于水的生物碱鞣酸盐,从而会影响该药的体内药效。为了避免 上述问题的产生,结合中药化学知识,本课题对速效止泻胶囊的物质作用基础进贵阳中医学院硕士学位论文 行研究,并设想向本药方中加入适量明胶进行改进,考虑到明胶中的大量蛋白质 有可能与中药拳参中的鞣质生成缔合物??鞣酸蛋白,而鞣酸蛋白也同样具有收 敛、止血、止泻的作用,口服后对胃无刺激,在胃内不分解,至小肠遇碱性肠液, 经某些蛋白酶分解,缓慢释放出鞣酸,与肠黏膜表层内的蛋白质反应、凝固,形 成一层保护膜,减轻刺激,而分解出来的少量鞣酸还能起到使肠黏膜血管收缩, 降低炎症渗出物,减少肠蠕动的作用,从而有助于收敛、止血,起到止泻作用。 而由于鞣酸蛋白的特殊性质,这也可能避免鞣质与小檗碱的相互作用,进而有助 于更好的发挥小檗碱对肠道内的痢疾杆菌、大肠杆菌等致病菌的杀灭作用,达到 标本兼治的疗效。通过对拳参中所含鞣质的有效部位进行研究,并对拳参、明胶 和黄连素的配伍比例进行系统的疗效考查,使“速效止泄胶囊”能更大限度 地发 挥其止泄效果。 实验内容 .实验仪器与材料 ..实验仪器 旋光仪美国;安捷伦高效液相色谱仪; 安捷伦高效液相色谱仪;低速台式离心机.上海安亭科学仪器厂; 质谱仪美国唧.型质谱仪。核磁共振谱,咖,及 均在一核磁共振仪上测定为内标;柱层析用硅胶 .、、?目,硅胶、薄层层析用硅胶及薄 ?/.为 层层析板均为青岛海洋化工厂分厂产品。 公司产品。薄层层析板通过一和. 观察色谱行为,薄层层析板通过%硫酸.乙醇溶液显色观察其斑点。除做 高液所需甲醇、乙腈为色谱级外,其余化学溶剂均为工业级重蒸,水为哇哈哈 矿 泉水,氘代试剂购买于武汉中兴科技公司,中压制备色谱仪由江苏利穗科技 有限 公司提供。 ..实验药材 拳参粉末、盐酸小檗碱粉末均由贵州省科辉制药厂提供。鞣花酸纯品、没食 子酸纯品均购置于上海源叶生物科技有限公司。贵阳中医学院硕士学位论文 .实验设计与方法 考虑到拳参中的鞣质可能与配方中的盐酸小檗碱反应生成络合物,为了阻断 这一步骤的发生,据文献报道,鞣质还能与蛋白质结合生成络合物,这种络合物 在一定条件和一定温度下可以还原为相应的鞣质与蛋白质。本课题组前期做过这 样一部分工作:对比拳参粗提物加入明胶溶液前后,借助高效液相色谱法分析其 色谱图的变化,结果加入明胶溶液的拳参提取物有一部分峰明显消失或减少,根 据蛋白质的性质,推测这一部分消失或减少的峰主要成分应该是鞣质类化合物。 为了探索拳参中与明胶结合消失的那部分组分的化学结构以及这些化合物在速 效止泻胶囊中的作用基础,现设计如下实验:一、对拳参进行提取,分离纯化其 中的鞣质类单体化合物;二、对上述分离纯化的鞣质类化合物进行研究,主要考 察其分别与盐酸小檗碱和明胶溶液的结合情况。 ..实验设计一 用食用乙醇提取拳参粉末,对乙酸乙酯层进行分离纯化: 提取:取拳参干燥粉末 ,分别用%、%的乙醇回流提取. 小时,过滤,合并滤液,减压浓缩至浸膏约 ,加适量水溶解,分别用石 、乙酸乙酯层浸 油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,减压回收得石油醚层浸膏 膏约 、正丁醇层浸膏约 ,流程图如下图..。贵阳中医学院硕士学位论文 拳参总提取分离流程图 拳参的干燥粉末约蝇 %、%酒精回流提取次,每次合并浓 缩成浸膏 粗提物浸膏 分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇 萃取并浓缩 石油醚层浸膏 乙酸乙酯层浸膏 正丁醇层浸膏 图..提取流程图 ... . .、 取乙酸乙酯层浸膏进行分离纯化,借助硅胶、葡聚糖凝胶 . 反相硅胶、等分离纯化方法和技术,经反复重结晶、反复柱层析和梯 度洗脱分离得个化合物,其中鉴别结构的有个,分别为:酸类两个油酸、 亚油酸、甾体类一个.谷甾醇、三萜类个表木栓醇、一亚乙基环木 菠萝烷..醇、环木菠萝烷.,一二酮、.亚乙基环木菠萝烷?酎、..垒圣酰氧 基达玛烷墨皿丝:二垄劾;结构式如下: 吣/\/\/\/\入/\/\/ 亚油酸 油酸贵阳中医学院硕士学位论文 表木栓醇 .谷甾醇 亚乙基环木菠萝烷一酮 .亚乙基环木菠萝烷一.醇 八。 隆互酰氧基嘏为垂独丝三艟 环木菠萝烷,酮 据大量文献报道,拳参中主要含有的鞣质是没食子酸和鞣花酸,因此,本课 题接下来转向直接用没食子酸和鞣花酸的纯品代替拳参中的鞣质类成分,借 助高 效液相色谱法对拳参中没食子酸和鞣花酸进行定性分析‘之,并分别考察没 食子 酸、鞣花酸与盐酸小檗碱结合的具体情况,结果如下: 、拳参提取物中没食子酸与鞣花酸的定性考察 色谱条件:苯基色谱柱 .,流动相:甲醇: 水:冰醋酸::.;进样量,检测波长: .;流速: /。取没食 子酸对照品、鞣花酸对照品与拳参提取物各此,进样,结果如下图..、图 ..。贵阳中医学院硕士学位论文 拳社取物 删,、 一 一一、贯 图..拳参提取物与鞣花酸的对照色谱图 从上述两张图谱可知,拳参提取物中含有量较大的没食子酸和鞣花酸。 、考察没食子酸纯品、鞣花酸纯品分别与盐酸小檗碱溶液结合后的变化情况 的容量瓶 分别精密称取没食子酸纯品 、鞣花酸纯品 于 中,加甲醇适量,超声溶解,并用甲醇定容到刻度,即为没食子酸对照品母液、 鞣花酸对照品母液。 的容量瓶中,加甲醇适量,超声 分别精密称取盐酸小檗碱 于 溶解,用甲醇定容至刻度,即为盐酸小檗碱对照品;分别取没食子酸对照品 于两个 的容量瓶中,向其中一个容量瓶加入 的盐酸小檗碱对照品, 并用甲醇将两个容量瓶定容到刻度。 分别取鞣花酸对照品 于 的容量瓶中,并用甲醇定容到刻度; 为模拟人体内温度,均放置与的水浴中小时,结果如下图..。贵阳中医学院硕 士学位论文 ?????一 ? 图..左边为没食子酸与盐酸小檗碱的混合溶液,中间为鞣花酸与盐酸小檗碱 的混合 溶液;右边为盐酸小檗碱溶液。 从上述三张图可知,没食子酸与盐酸小檗碱的混合溶液较盐酸小檗碱其颜色 有加深,但没有明显沉淀生成,而鞣花酸与盐酸小檗碱的混合溶液有明显的淡黄 色絮状沉淀产生。 、考察没食子酸、鞣花酸分别与盐酸小檗碱结合后含量的变化情况 取上述没食子酸对照品、没食子酸与盐酸小檗碱的混合溶液、鞣花酸对照品、 鞣花酸与盐酸小檗碱的混合溶液、盐酸小檗碱对照品溶液及阴性对照溶液经高速 离心,取上清液经微孔滤膜虑过,借助高效液相色谱仪定量分析,条件与结果如 下: 没食子酸色谱条件:苯基色谱柱 ×.,流动相: /。 ;流速: 乙腈:水:磷酸::.;进样量此,检测波长: 取没食子酸对照品溶液、没食子酸与盐酸小檗碱混合溶液、盐酸小檗碱混合溶液 以及阴性对照此,进样高效液相色谱仪,结果如下图.....。 图..没食子酸对照品贵阳中医学院硕士学位论文 图.. 盐酸小檗碱 图..没食子酸与盐酸小檗碱的混合溶液 图..阴性对照 从以上色谱图可知,没食子酸与盐酸小檗碱结合前后,两者的量没有明显变 化。 鞣花酸色谱条件:苯基色谱柱 .,流动相: ;流速: 甲醇:水:冰醋酸::.;进样量此,检测波长: /。取鞣花酸纯品溶液、鞣花酸与盐酸小檗碱的混合溶液、盐酸小檗碱溶液 和 阴性对照经高速离心,取上清液各止,进样高效液相色谱仪,结果如下图 ... 。 贵阳中医学院硕士学位论文 图..鞣花酸纯品 图..盐酸小檗碱 啦溽 孽 谲 。 馐嚣 一 ? 辂 塞 \ 嚣 良 .肛擘 . \一 。 图..鞣花酸与盐酸小檗碱的混合溶液 三耗 矗; 嚣 ? 拷 强 苎 图..阴性对照 从以上图谱可知,鞣花酸纯品与盐酸小檗碱纯品混合之后,两者的量均明显 减少。 贵阳中医学院硕士学位论文 通过实验设计可以得出结论,拳参中含有没食子酸和鞣花酸,当没食子酸与 盐酸小檗碱结合后没有明显的变化,鞣花酸与盐酸小檗碱结合后,有明显的 淡黄 色絮状沉淀产生,且两者的量均会减少。 ..实验设计二 考察没食子酸、鞣花酸分别与明胶溶液结合所产生的现象,实验步骤与方法: 的容量 分别精密称取没食子酸对照品 于 、鞣花酸对照品 瓶中,加甲醇适量,超声溶解,并用甲醇定容到刻度,即为没食子酸对照品母 液、 鞣花酸对照瓶母液。 称取 明胶于放有 热水的烧杯中,继续加热,边搅拌边加明胶, 直至完全溶解,过滤,滤液即为明胶溶液。 、甲醇溶液 量取没食子酸对照品溶液 、鞣花酸对照品溶液 于 的容量瓶中,分别向里边加 的明胶溶液,再加甲醇至刻度,为 模拟人体内温度,均放置于?水浴中后,观察结果如下图..。 图.. 左边是没食子酸与明胶的混合溶液;中间是鞣花酸与明胶的混合溶液: 右边是明胶溶液。 从上图可知,没食子酸与明胶溶液结合后,颜色会变深,但没有明显的沉淀 生成,而鞣花酸与明胶溶液结合后,有明显的沉淀物质。 本章小结 本课题从理论知识着手,通过对速效止泻胶囊配方的分析,结合中药化学知 识,初步判断方中的某些物质基础的变化可能会导致其止泻疗效的变化,为 了对 贵阳中医学院硕士学位论文 速效止泻胶囊进行改进,期望在减少有效剂量的同时增加其止泻疗效,通过基础 实验研究将理论知识结合与实践,发现拳参中的鞣花酸等某些鞣质能与盐酸小檗 碱结合成一种淡黄色的絮状沉淀,再通过考察鞣花酸纯品与%明胶溶液结合前 后的变化,发现鞣花酸与明胶溶液结合后也有沉淀产生。 通过上述物质基础的研究结果,得出了一条向速效止泻胶囊中加入适量明胶 的方法进行改进的思路,并进一步通过药理学和药效学实验来进行验证。贵阳中医学院硕士学位论文 第二章夏枯草中二萜类化合物的研究 研究的立题依据与意义 二萜类化合物是天然产物化学中研究最为活跃的领域之一,具有多种生物活 性,甚至有国外大型的医药研究所对大量不同种类的植物进行筛选后发现,二萜 类化合物是五类最有希望的抗癌活性成分之一,尤其是二十世纪推出的治疗晚期 肿瘤的药物??二萜类化合物紫杉醇被开发以来,从天然产物中寻找有抗肿瘤活 性的二萜类化合物掀起了一波高潮。 据文献报道,二萜类化合物除了有抗肿瘤活性之外,还有许多其他的生理活 性,主要有抗病毒活性、抗结核活性、抗溃疡活性、松弛血管活性,还有降血压、 降血脂、降血糖等作用。 二十世纪对二萜类化合物的研究,主要是从大戟科植物进行提取分离,因为 其结构变化多样,类型繁多,都具有丰富的二萜类化合物。但随着研究团队的扩 大、研究人员水平的提高以及研究技术和仪器的不断更新,对于二萜的研究已经 普及到其他许多科、属、种植物中去,并且效果显著,许多含二萜类化合物的新 药不断被研发问世,并给今后对于二萜的开发研究提供了有用的参考和一定科学 依据。 本课题组前期从夏枯草中首次分离得到一个二萜化合物,并且是一个全新的 骨架结构,结合二萜化合物以及夏枯草的药理活性,本课题期望能从夏枯草中分 离到与此结构类似的一系萜类新化合物,再对分离的新化合物进行结构修饰 并进一步活性筛选,期望得到有一定药理活性的二萜化合物。本课题还分别选取 贵州进几年不同年份、不同产地的夏枯草,借助高效液相色谱法对其中的二萜类 化合物进行生源考察。为夏枯草中二萜类化合物的研究提供了一定的参考价 值和 科学依据。 实验内容与结果 .实验仪器与材料 ..仪器 紫外光谱为惠普皿.紫外分光光度测定仪;安捷伦高效液 相色谱仪;质谱仪美国肿一型质谱仪。核磁共振谱,贵阳中医学院硕士学位论 文 及均在核磁共振仪上测定为内标;柱层析 用硅胶、?、?目,硅胶、薄层层析用硅胶及 薄层层析板均为青岛海洋化工厂分厂产品。反相材料一.‖及 冲.薄层板为公司产品; 公司产品;购置于成都科普生物有 为 限公司。薄层层析板通过一和. /观察色谱行为,薄层层析板通过 碘蒸气、%硫酸.乙醇溶液显色观察其斑点。除做高液所需甲醇、乙腈为色谱 级外,其余化学溶剂均为工业级重蒸,氘代试剂购于武汉中兴科技公司。 ..实验药材 实验所用夏枯草干燥全草,购买于万东桥药材市场,由贵阳中医学院陈德媛 教授鉴定为夏枯草衅. .。标本保存于贵州省、中国科学院天然产物 化学重点实验室。 .实验方法与步骤 取夏枯草干燥全草 曲,分别用%、%、%的乙醇回流提取三 次,每次.小时,冷却过滤,合并滤液,减压浓缩至浸膏,加适量水溶解,用 石油醚萃取.次,减压回收得石油醚层浸膏约 ,经过各种分离材料反 复柱层析,借助半制备高液分离,共得到个二萜类化合物,其具体提取萃取过 程见下面的流程图..。贵阳中医学院硕士学位论文 夏枯草总提取分离流程图 夏枯草的干燥粉末约埏 %、%、%酒精回流提取 次,每次.后浓缩成浸膏 ? 粗提物浸膏 分别用石油醚、乙酸乙酯萃取并浓缩 石油醚层浸膏 乙酸乙酯层浸膏 图..提取流程图 ... . 取夏枯草石油醚萃取部分的浸膏约 ,加石油醚和少量乙酸乙酯溶 剂溶解,用硅胶.目拌样。将拌好的样品采用硅胶?目柱层析 分离,用石油醚.乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱石油醚:乙酸乙酯:至:, 洗脱组分极性在石油醚:乙酸乙酯在:到:范围内的组分经硅胶 目,石油醚一乙酸乙酯梯度洗脱柱层析,通过薄层色谱展开后,在紫外 分析仪下的荧光显色情况,对%浓硫酸.乙醇溶液、%磷钼酸的显色情况, 合并相似部分后共分成段.、.、.。将第一段.经甲醇. .氯仿:甲醇:凝胶柱层析和反复硅胶柱层析 水梯度洗脱, 进行分离纯化得到化合物.约 ;第二段.经甲醇水 梯度洗脱,反复硅胶柱层析,借助高效半制备色谱仪进行分离纯化,用正相系 统 环己烷一异丙醇分离纯化得到化合物.;笫三段.经 .氯仿:甲醇:凝胶柱层析、硅胶柱 甲醇一水梯度洗脱, 层析,借助高效液相半制备色谱仪用反相系统甲醇.水、乙腈.水反复分离纯 化得到化合物.,剩下部分用反相系统重复使用高效液相半制备色 谱仪,再用硅胶柱石油醚:甲苯反复分离纯化得到化合物 。 夏枯草石油醚层分离纯化部分流程图见下图..。贵阳中医学院硕士学位论文 夏枯草石油醚分离纯化流程图‘图..夏枯草石油醚层部分分离流程图 ... . 注:.石油醚:.乙酸乙酯;.氯仿;.甲醇 .结构鉴定与波谱解析 ..化合物结构鉴定 ,% 化合物:无色块状晶体石油醚.乙酸乙酯, 硫酸乙醇溶液显暗紫色。?谱图显示/:、确 定其分子量为。结合碳谱、氢谱确定其分子式为,同时可以判定该 分子具有个不饱和度。由和谱图数据得知其结构中含有个 碳,分别为个甲基,个亚甲基,个次甲基,个季碳。在谱中, 茈.和 .处的两个季碳信号显示该分子内含有两个羰基结构单元,另 外,可以确定该分子内应该含有个饱和脂肪环结构单元。再由和 谱图数据表明该化合物分子内含有个含氧取代的碳原子,其中有个季碳菇 .,个次甲基茈.,函.;磊.,晶.和个亚甲基茈.,国 贵阳中医学院硕士学位论文 .和.。从碳谱、氢谱的数据中可以发现,该化合物和课题组前期分离出 的新结构化合物 基本一致,经薄层对照,在.?.范围内, 。 两个斑点完全重合,故确定该化合物为 化合物.:无色块状晶体石油醚一乙酸乙酯,%硫酸乙醇溶液显暗 紫色,?谱图显示/:、确定其分子量为。 结合核磁共振碳谱、氢谱确定其分子式为?,同时可以判定该分子具有 个不饱和度。由核磁共振碳谱、氢谱可以确定该化合物与.有相同的母核, 即一个四环二萜类母核。由和谱图数据得知其包含片段有个 甲基,个亚甲基,个次甲基,个季碳。在谱中,有一个典型的单 取代苯环特征峰函.和晶.和函.,在谱中,反.和 茈.处的两个季碳信号显示该分子内含有两个酯羰基结构单元。进而由 谱图发现,与、和上的碳原子均有耦合信号的氢应该是位 上的氢,且该氢和蠡.分别与一个酯羰基有耦合信号,说明酯羰基连在苯环 和之间;与、均有耦合信号的应为上的氢,根据其峰形,应该是 连一个羟基,另外,与和一个甲基有耦合信号且与另外一个酯羰基也有耦合 信号应该为】上的氢,其酯羰基与】相连,通过酯键相连,综上解析 的结构如下,其为一个和.骨架相似的二萜类新化合物。 贵阳中医学院硕士学位论文 . 化合物.:无定形粉末,%硫酸乙醇溶液显暗紫色,.谱图显 示./:、【确定其分子量为。结合碳谱、氢谱确 定其分子式为,同时可以判定该分子具有个不饱和度。由核磁共振碳 谱、氢谱可以确定该化合物与.有相同的母核,即一个四环二萜类母核。 在谱中,根据晶.,的峰形可以推测与羟基相连。在 .处的两个季碳信号显示该分子内含有两个酯羰基结 谱中,况.和 构单元。由和谱图数据得知其结构中包含的片段分别为个甲 基,个亚甲基,个次甲基,个季碳。结合.母核和图谱可知, 与、和上的碳原子均有耦合信号的氢应该是位上的氢,该氢与一 个酯羰基也有耦合信号,说明酯羰基与通过酯键相连,、和均有耦 合信号的氢应为位上的氢,且该氢还与一个酯羰基有耦合信号,说明与 酯羰基通过酯键相连,则剩下与羰基相连的应为位,综上解析.的结构 应为如下,其为一个和.相似的二萜新化合物。 . 贵阳中医学院硕士学位论文 化合物.:无色块状晶体石油醚.乙酸乙酯,%硫酸乙醇溶液显暗 紫色,?谱图显示/:【】、确定其分子量为。 结合碳谱、氢谱确定其分子式为,同时可以判定该分子具有个不饱和 度。由核磁共振碳谱、氢谱可以确定该化合物与.有相同的母核,即一个 四环二萜类母核。由和谱图数据得知其结构中包含片段分别为 个甲基,个亚甲基,个次甲基,个季碳。在谱中,有一个典型 的单取代苯环特征峰函.、晶.和函.,在.谱中,菇.和 茈.处的两个季碳信号显示该分子内含有两个酯羰基结构单元。结合. 母核和图谱可知,与、和上的碳原子均有耦合信号的氢应该 是位上的氢,且与一个酯羰基有耦合信号,说明其与酯羰基通过酯键相连, 与、和上的碳原子均有耦合信号的氢应该是位上的氢,且该氢和 函.分别与一个酯羰基有耦合信号,说明酯羰基连在苯环和之间;另外, 与和一个甲基有耦合信号且与另外一个酯羰基也有耦合信号应该为上的 氢,根据其峰形和氢的数目,可知其与羟基相连,综上解析.的结构如下, 其为一个和.相似的二萜新化合物。 ..波谱解析 。,% 化合物.:无色块状结晶石油醚一乙酸乙酯, 硫酸乙醇溶液显暗紫色。. /:】,. ,:.,,. ,,.,,. ,,., ,一,.,,一,?,. ,,. ,,一,.,, ,,一,.,,,.,一,.,,. ,,.,, ,贵阳中医学院硕士学位论文 一,.,,,.,,?,.,,一,.,, ?,.,,,.,,,。,止. ,一, .,,. ,一,.,,,.,,,.,, ,,.,. ,一,,.,,. ,,,.,, ”,.,,了. ,一”,.,文. ”,.,, 一,.,,,. ,?.? ,:.一, .,.,.,.一,.,.一,.一,. 一,.,.,.,.?,.一,.一, .一,.一,.,.一,.,.,,. ,, .一,, .,, .一”,.一”, .’,, . ”. 化合物.:无色块状结晶石油醚.乙酸乙酯,%硫酸乙醇溶液显 暗紫色。. /:,. : .,,. ,?,.,,. ,,.,,一,. ,,,.,,?一,.,,一,一,. ,,一, .,也.,?,.,,. ,,.,,,. ,,一,.,,,.,’一,.,,,. ,,.,, ,,一,.,,,.,,. . 一,.,,,.,,一,.,,一,,. ,,. ,,,.,,. ,’,.,,一”,., ,. ’,,.,,. ,”,.,,?,.,, . ?.? ,:.,.一,.一, .,.,。一,。一,。一,. 一,.一,. 一,.一,.一,.一,.?,.一,.一, .?,.,.,.?,,.一’,.一,. ,,.一,.一,,.一 .?’,,.一”,. ”,.’,. /: 化合物.:无色油状,%硫酸乙醇溶液显暗紫色。? 【】?,. ,:.,,. , ,.,,. ,一,.,,一,. ,,,., ,一 ,,.,,,一,.,,,.,,.,, 贵阳中医学院硕士学位论文 一,.,,. ,一,.,,一,.,,,. ,,一,.,,,.,,一,.,,,. ,一,.,,. ,, ,,一,.,,. .,, ,.,,,.,,,一’,.,,’, .,,,.,’一’,.,,一,.,,’,,., ,. ,一 ,,.,,,. ,一’,.,,?,.,, . ,?.” ,:.,.一,., .一,.?,.,.一, .,. 一,.?,. ,.,.一,.,.,.,.一, .,.,.,.,,.一,.,,. ,,.?”,.’,,.一’,,.. 化合物.:无色针状状结晶石油醚一乙酸乙酯,%硫酸乙醇溶液 显暗紫色。? /:,【. :.,,. ,.,,,. ,一,.,,一, .,,,.,,置一,.,,一,一,.,, 一,.,,.,,.,也. ,一,.,,一, .,,一,.,,,.,,一,.,,, ,., .,,一,.,,一,.,,. ,. ,,.,,一,.,,?,.,,一, , .,,. ,.,,. ,’,.,,’,,. ,. ’,,.,,. ’,,.,,?,. ,,. ,. ,:.,.一, .,.,.,.一,.一,.,. 一,. 一,.?,.,.,.,.一,.一, .一,.一,.一,.,.,,.,. ,.一,.一’,.一”,.’,, ,,. ,. .一’,.”. . 法检测夏枯草中二萜类化合物取一定量的 夏枯草、 夏枯草、 夏枯草、 贵阳中医学院硕士学位论文 夏枯草、 夏枯草、 夏枯草、 夏枯草、 夏枯草、 夏枯草、 夏枯草、 夏枯草,用%、%的乙醇回流 提取三次,冷却、过滤,合并滤液,减压回收至无醇味,分别用石油醚萃取得各 石油醚层。 取适量的.、.纯品,加适量乙腈溶解,作为对照品溶液;经紫 外一可见分光光度计在 波长范围扫描,化合物在 .处有最大吸 收,故确定该波长为样品检测波长。 经过反复的条件摸索,选择最佳高效液相色谱分离条件为: 色谱柱: ?, ×.衄;流动相:乙腈?水:;检 测波长: ,进样量此;流速:/;实验结果如图....。 ‘???????????????????? ??????????????’ ???????????????? ??‘ 一’????’’\????????.一?????? 竺 一 ’’ :二,::二?二?? 二二?二 ? 二二:二。?? 二:二 观 .. 叼 .一 图.. 对照品 ?? ????一一蟊丽而币顽丽丽萌而面丁:石广~?? ? 一。 ??~一??一????一????图.. 对照品贵阳中医学院硕士学位论文 崎 、 ?”.口孙 ?口.归一亿一 苍 ? 嗣 矗 ?????百而面丽而面丽互丽弦丽?丽丽面面行;丽丽而丽丽西『?????????一 一 ? 为一 二 :二::二二二: :::.二::::二二二三::::三三兰二三;主釜三三竺三型 二:?..。.????。?。二??二????????;;?????;.;;????;?;?:?。;;;::二??,。‘???’生一 ?? .。:?????,?????.????,?????.。????.??????????.????.?????.?????,?.? ?..???...??????????.?????,???.?.????????????????,??????.???,????..??? ????..?.?????,?????.????.?????,?????,?????,????,?????,?????.?????.??? ? ?????????????主??????一??立???????量????????????』??????????????一????????由????????????豇??????????咧 图.. 、.、 夏枯草 : 。 \ 归 丛煦 一 一?一一 图.. .、.、 夏枯草 . ?\ 铲‘ 莹华勇、如 、. 丸 鼍华冉??一“、 人 ?告毕日、? 归一化 ? ” , : : : : ?二 : 一、~、 、~’ ’一、 一\‘ \, \, 。三?????????????二二?二二?二二二二二二二?二?二二乏?二?;蛊?昌匕 宣??一 图.. .、、 夏枯草贵阳中医学院硕士学位论文“”\ ,.”\ 《. 、 . 归一.匕 “ 川.; ;七 , ” : ? 二?。????一 ??????卫?? 舆 图.. .、一、 夏枯草 :怒;全器:嚣:::::器霪拳霉器:器:。。。。。。,。 ,:一:。、。,器器器‘曷 扫一.匕: 。 : ;【 : :. ”引 :: ::::。...一 图.. 、、 夏枯草 ???需爵震需雾熏需葛鬻霜露爵露黧霖霖蒙需需霖嬲???????一??一 口 忙 .、 归一亿 ?八: 一’ ; 川;; 州 镑,、 二 。型:. 皂?????????????垫?? 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