反胶团萃取

反胶团萃取 萃取补充材料 5(5反胶团萃取 ,反胶团(reversed micelles)是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。 ,反胶团的微小界面和微小水相具有两个特异性功能: ?具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能; ?在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性的功能。 ,因此，反胶团可作为: ,生物膜的简化模型; ,作为显示酶类性质的一种模型进行基础性研究; ,作为具有新型功能的疏水性反应场; ,作为酶和微生物的一种新型的固定化方法; ,作为微小型的生物反应器; ,在生物技术领域中作为生理活性物质以及生物活性大分子的特异性分离场(分离、浓缩等方法)。 5.5.1 反胶团萃取技术的特点 ,反胶团萃取技术的突出优点 ?有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性; ?分离、浓缩可同时进行，过程简便; ?能解决蛋白质(如胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题; ?表面活性剂往往具有细胞破壁功效，可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶; ?成本低，溶剂可反复使用等。 .5.2 反胶团的形成 5 ,反胶团的构造 ,当向水溶剂中加入表面活性剂时，如表面活性剂的浓度超过一定的数值时，形成正胶团(normal micelle)。 1 ,当向非极性溶剂中加入一定量的表面活性剂时，会形成反胶团或反向胶团(reversed micelles)。 ,在反胶团中有一个极性核心，它包括由表面活性剂极性端组成的内表面、平衡离子和水，被称之为“水池”(water pool)。这个“水池”具有极性，可以溶解具有极性的分子和亲水性的生物大分子。 ,常用的表面活性剂 ,AOT(Aerosol OT)，其化学名称是琥珀酸二(2-乙基己基)酯磺酸钠(Sodium di-2-ethyl-hexylsulfosuccinate)，结构式下 ,CTAB(溴代十六烷基三甲铵)、TOMAC(氯化三辛基甲铵)、PTEA(磷脂酰乙醇胺)。 ,常用的非极性有机溶剂 ,有环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油等。 ,反胶团的物理化学特性 ,CMC (critical micelle concentration) 0.1,1.0 mmol/L的范围内。 ,反胶团含水率W ,W用水和表面活性剂的浓度之比来定义，即 W,c,c 水表 ,W是个非常重要的参数，W越大，反胶团的半径越大。 ,反胶团“水池”中的水与普通水差异大。当W,6,8时，微水相中的水分子被表面活性剂亲水性基团强烈地束缚，其表观粘度可增大到普通水粘度的50倍，且疏水性非常强。另外， 2 其冰点通常低于0?。这一部分水实际上起着使表面活性剂的亲水性基团水合化的作用。因为这一部分水被牢固地束缚着，所以粘度很大，流动性很差。 ,在AOT反胶团中，水合化一分子AOT需要6,8个水分子，而其他水分子则不受束缚，可与普通水一样自由流动，所以当W,16时，“水池”中的水逐渐接近主体水相粘度，胶团内也形成双电层。 ,反胶团的制备 1.液液接触法 ,即将含蛋白质的水相与含表面活性剂的有机相接触。 2.注入法 ,将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有表面活性剂的非极性有机溶剂中去。这种方法的过程较快并可控制反胶团的平均直径和含水量。 3.溶解法 ,对非水溶性蛋白质可用该法。将含有反胶团(W,3,30)的有机溶液与蛋白质固体粉末一起搅拌，使蛋白质进入反胶团中，该法所需时间较长。含蛋白质的反胶团也是稳定的。 5.5.3 反胶团萃取蛋白质的基本原理 ,反胶团萃取是有机相-水相间的分配萃取。 ,是从主体水相向溶解于有机溶剂相中反胶团微水相中的分配萃取。 ,同时也是一个浓缩操作。 ,改变水相条件可实现反萃取。 图 反胶团萃取蛋白质的示意图 “水壳”模型(water-shell mode)) 3 蛋白质向非极性溶剂中反胶团的纳米级水池中的溶解，有图所示的四种可能。 ?大分子蛋白质被封闭在“水池”中 ?蛋白质中的亲脂部分直接与非极性溶剂的碳氢化合物相接触 ?蛋白质被吸附在微胶团的“内壁”上 ?蛋白质被几个微胶团所溶解， ,酶、蛋白质萃取特性 ,分离场(胶团)-分离目标物质(蛋白质))间的相互作用及其影响因素等见下表。 表5 决定分配系数K的分离场-分离物质间相互作用 相互作用 分离场 分离物质 静电性相互作用 pH、盐的种类和离子强度 pI、表面电荷 液状离子交换体浓度、胶团内双重电荷层 立体性相互作用 胶团尺度、含水率W、表面活性剂浓度 分子量 疏水性相互作用 溶剂、胶团亲水疏水基 亲水疏水残基含水率 特异性相互作用 亲和配体 构象 ,下面以研究得较多的AOT,异辛烷体系为对象，以立体性、静电性、疏水性相互作用的分离特性及效果作以下的归纳。 ,酶、蛋白质等生物大分子的空间尺度与反胶团的大小相接近。因而包括立体性相互作用在内，表5中所有的相互作用关系虽都很重要，但在多数场合下，是它们之间的复合作用 4 占主导地位。有些蛋白质其构象很小的变化就可能对这些相互作用的结果产生很大的影响。 1.静电性相互作用 ,以细胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶a为例，考察它们从主体水相向反胶团内微水相中的萃取或反方向的反萃取时静电性相互作用以及pH对这种作用的影响。 ?对于Mr,20000小分子蛋白质，pH,pI时，蛋白质不能溶入胶团内，但在等电点附近，急速变为可溶。当pH,pI时，即在蛋白质带正电荷的pH范围内，它们几乎完全溶入胶团内。 ?蛋白质相对分子质量增大到一定程度，即使将pH向酸性一侧偏离pI，萃取率也会降低(即立体性相互作用效果增大)。 ?相对分子质量更大的BSA，全pH范围内几乎都不能萃取(即静电相互作用效果无限小，可忽略不计)。此时，AOT浓度如较通常条件(50,100mmol/L)增加到200,500mmol/L，逐渐变为可萃取。 ?降低pH，正电荷量增加，似乎有利于萃取率的提高。事实上，缓慢减小pH，萃取率从某一pH开始，急速减小。这被认为是蛋白质的pH变性所造成的。蛋白质和微量的AOT在静电、疏水性等的相互作用下，在水相中生成了复合体而变性。 ?添加KCl等无机盐，萃取率下降(图)。 5 盐浓度对蛋白质溶解率的影响 而且，它对有机相具有脱水作用(W减小，见下图)，使立体性相互(排斥)作用增大。 AOT(mmol,L),(?)50 ?)100，(?)200，(?)300 盐浓度对反胶团含水率的影响 2.立体性相互作用 ,随着蛋白质分子量的增大，蛋白质分子和胶团间的立体性相互作用增加，萃取率有下降趋势。用动态光散射法测定，发现反胶团粒径存在一粒径分布，胶团的粒径分布(分离场)随盐浓度和AOT浓度的增加而发生显著的变化。与蛋白质溶入与否没有关系。 ,分离场不受蛋白质种类的影响，可通过控制反胶团粒径，高效分离纯化蛋白质。 ,随着蛋白质分子量的增加，分配系数K迅速下降，相对分子质量20000左右的蛋白质的pI 高效分离是可能的。 ,萃取溶入胶团的蛋白质的种类和相对分子质量不同，分离场的特性(胶团平均直径和含水率)几乎不变。 3.其他的相互作用 ,疏水性相互作用对蛋白质分配特性的影响不大 6 5.5.4 反胶团萃取过程 ,多步间歇混合,澄清萃取过程 ,下图是在pH 9时，核糖核酸酶的溶解率很小，保留在水相而与其他两种蛋白质分离;相分离得到的反胶团相(含细胞色素C和溶菌酶)与0.5 mol/L的KCl水溶液接触后，细胞色素C被反萃到水相，而溶菌酶的保留在反胶团相。此后，含有溶菌酶的反胶团相与2.0 mol/L KCl，pH 11.5的水相接触，将溶菌酶反萃回收到水相中。 图2-21 反胶团萃取分离蛋白质的工艺过程 ,连续循环萃取-反萃取过程 7 图为连续循环萃取-反萃取过程，该过程由两个混合,澄清单元构成，左侧单元用于反胶团萃取，经沉降澄清器后反胶团相进入右侧单元的混合器进行反萃取。 5.6 超临界流体萃取 ,超临界流体萃取supercritical fluid extraction，SCFE，也叫气体萃取gas extraction、流体萃取fluid extraction、稠密气体萃取(dense gas extraction)或蒸馏萃取(destraction)，由于萃取中的一个重要因素是压力，有效的溶剂萃取过程也可以在非临界状态下实现，因此广义地也称之为压力流体萃取pressure fluid extraction。它是利用超临界流体(supercritical fluid，SCF)，即其温度和压力略超过或靠近临界温度(T)和临界压力(p)，介于气体和液体之cc 间的流体作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某种高沸点或热敏性成分，以达到分离和提纯的目的。 ,作为一个分离过程，超临界流体萃取过程介于蒸馏和液-液萃取过程之间。即此过程同时利用了蒸馏和萃取的现象——蒸汽压和相分离均在起作用。 ,超临界流体萃取，是适用面很广的一门新型分离技术。超临界流体萃取的操作需在高压下运行，但因萃取溶剂是“气体”，操作中可以方便地改变其压力和温度，还可改变超临界流体的组成，因此能自由地改变它对物质的溶解能力。萃取、分离和溶剂回收都能在很低的温度下进行。 5.6.1 超临界CO的溶剂特征 2 ,超临界CO的相图 2 ,利用不同密度下的 CO对物质溶解能 2 力的差异就可以实 现萃取和分离的操 8 作，即通过压力或 温度的改变就可能 有效地萃取和分离 溶质。 CO2的相图 萃取溶剂CO的性质 2 ,CO在工业上应用广泛。它无毒，无腐蚀性，不可燃烧，纯度高且价格低。又有优良的传2 质性能，扩散系数大，粘度低，而且和其他用做超临界流体的溶剂相比，CO具有相对较2低的临界压力和临界温度，适合于处理某些热敏性生物制品和天然物产品。 ,在超临界流体萃取技术的应用中，某些场合的目的是得到萃取物，而在另一些场合下，是为获得萃取后的余留物质，萃取物则为其次。超临界CO(supercritical carbon dioxide，2 SC-CO)萃取技术适用于上述两种情况。 2 ,将1?T?1.4， r 1,p,5的区 r 域作为SC-CO2 的工作区。 SC-CO2对比压力、对比温度、对比密度关系 9 ,溶质在SC-CO中的分配平衡及萃取动力学与溶质在SC-CO中的扩散系数及SC-CO的222粘度有关。如图所示，SC-CO中溶质的扩散系数为温度和压力的函数。溶质在SC-CO中22的扩散系数比在通常液体中高出50,100倍。因此，对动物或植物组织中有效成分进行萃取时，具有相当高的质量传递速率。 SC-CO2中溶质的扩散系数 -3,SC-CO的粘度在(0.03,0.09)×10 Pa?s的范围内，与通常的有机溶剂粘度(0.2,3.0)2-3×10 Pa?s相比，仅为后者的几十分之一。这使得SC-CO萃取有可能在相对较短的时间内2 完成。 5.6.2 SC-CO萃取以及拖带剂的作用 2 ,添加拖带剂即辅助溶剂(entrainer)以增加物质的溶解度和萃取选择性，是实际运行中常用的方法之一。 ,如在CO中添加约14%的丙酮后，甘油酯的溶解度增加了22倍。 2 ,纯CO几乎不能从咖啡豆中萃取咖啡因，但在加湿(水)的SC-CO中，因为生成了具有22 极性的HCO，在一定的条件下，能选择性地溶解萃取极性的咖啡因。 23 5.6.3 SC-CO萃取 2 10 ,SC-CO萃取基本工艺流程 2 ,超临界萃取工艺过程主要由萃取釜和分离釜二部分组成，并适当配合压缩装置和热交换设备所构成。对于原料为固体的萃取过程可归纳为3种基本工艺流程——等温法、等压法和吸附法。 超临界CO流体萃取的三种基本流程 2 (a)等温法 T,T p,p 1—萃取釜;2—减压阀;3—分离釜;4—压缩机 1212 (b)等压法 T,T p,p 1—萃取釜;2—加热器;3—分离釜;4—高压泵; 1212 5—冷却器 (c)吸附法 T,T p,p 1—萃取釜;2—吸附剂;3—分离釜;4—高压泵 1212 ,对比等温、等压和吸附3种基本流程的能耗可见，吸附法理论上不需压缩能耗和热交换能耗，应是最省能的过程。但该法只适用于可使用选择性吸附方法分离目标组分的体系，绝大多数天然产物分离过程很难通过吸附剂来收集产品，所以吸附法只能用于少量杂质脱除过程。 ,温度变化对CO流体的溶解度影响远小于压力变化的影响。等压法实用价值较少。 2 ,通常超临界CO萃取过程大多采用改变压力的等温法流程。 2 ,固相物料超临界CO萃取工艺过程 2 1. 固相物料的萃取过程 2.超临界CO萃取与其他分离技术的联用 2 ,超临界萃取工艺流程可通过多级分离釜将产品分成若干部分。但传统分离釜只是一个空的高压容器，利用不同分离压力来达到分步解析结果，所以产品往往是不同馏分的混合物。由于天然产物组成复杂，近似化合组分多，因此单独采用超临界萃取(SFE)技术常常满足不了对产品纯度。为此，人们开发了SFE与其他分离手段的联用工艺技术。 ?超临界萃取和精馏联用 ,是将超临界萃取与精密分馏相结合，在萃取的同时将产物按其性质和沸程分成若干不同的产品。具体工艺流程是将填有多孔不锈钢填料的高压精馏塔代替分离釜，沿精馏塔高度 11 有不同控温段(见图2-29)。萃取产物在分离解析的同时，利用塔中的温度梯度，改变CO2流体的溶解度，使较重组分凝析而形成内回流，产品各馏分沿塔高进行气—液平衡交换，分馏成不同性质和沸程的化合物。 ,通过这种联用技术，可大大提高分离效率，如在鱼油精制中，采用该技术可得二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)纯度达到90,以上的产品。在日本该联用技术应用于辛香料的萃取—分离也有多篇专利技术。 ?超临界萃取与尿素包合技术联用 ,又称超临界萃取结晶法。利用尿素可与脂肪酸化合物形成包合物，而且分子结构和不饱和度不同的化合物与尿素的包合程度不同这一特性来实现组分的分离，可用于从鱼油中提纯EPA和DHA。 ?超临界萃取与色谱分离联用 ,如从向日葵种子中提取维生素E时同硅胶吸附柱联用; ,从美丽猪屎豆种子中萃取单猪屎豆碱时同离子交换柱联用。 ,液相物料的超临界CO流体萃取 2 ,固相物料的超临界CO萃取只能采用间歇式操作，即萃取过程中萃取釜需要不断重复装2 料-充气，升压-运转-降压，放气-卸料-再装料的操作。因此，装置处理量少，萃取过程中能耗和CO气耗较大，以至产品成本较高。 2 ,液相物料超临界CO萃取有下列特点。 2 ?萃取过程可以连续操作 ?实现萃取过程和精馏过程一体化，可以连续获得高纯度和高附加值的产品。 5.6.4 SC-CO萃取技术的应用 2 ,生物活性物质和生物制品的提取 ,SC-CO萃取技术主要应用于有害成分成分的脱除、有效成分的提取、食品原料的处理等2 几个方面。例如:用SFE从咖啡、茶中脱咖啡因;啤酒花萃取;从植物中萃取风味物质;从各种动植物中萃取各种脂肪酸、提取色素;从奶油和鸡蛋中去除胆固醇等。 ,自1978年德国HAG公司第一套超临界CO萃取咖啡因工业化装置问世以来，世界各国2 3纷纷推出各具特色的实用化装置，萃取釜规模从200L到7m不等，主要以食品工业的应 12 用为主。 1. 脱咖啡因 ,超临界流体萃取技术得到最早大规模的工业化应用的是天然咖啡豆的脱咖啡因。 2.啤酒花萃取 ,图2-32为啤酒花萃取流程。普通的有机溶剂萃取法制取的啤酒花萃取液为暗绿色膏状(即啤酒花浸膏)，含有许多不纯物质，而且还残留有机溶剂。液体CO和SC-CO抽提的酒花22萃取物颜色为微榄绿，在20,25MPa，40?萃取4h，浸膏得率可14,，α-酸提取率近99%，硬树脂萃取率仅为5.2%，而且不萃取农药，芳香成分不氧化。 3. 其他 ,从工业性应用的萃取分离角度，SC-CO萃取技术在医药、食品、化妆品等工业领域中有2 较宽的应用面 ?医药工业 ,酶、维生素等的精制回收 ,动植物中药效成分的萃取(生物碱、生育酚、EPA、DHA、鸦片、吗啡、精油等) ,医药品原料的浓缩、精炼、脱溶剂 ,脂质棍合物的分离、精制(甘抽酯、脂肪酸、卵磷脂) ,酵母、菌体产物的萃 ?食品工业 ,植物油脂的萃取(大豆、向日葵、棕榈、可可豆、咖啡豆等) ,动物油脂的萃取(鱼油、肝油等) ,奶脂中脱除胆固醇等 ,食品脱脂(炸土豆片、油炸食品、无脂淀粉) ,咖啡、红茶脱咖啡因、酒花萃取 ,香辛料萃取(胡椒、肉豆蔻、肉桂等) ,植物色素的萃取(辣椒、栀子等) ,共沸混合物分离，含醇饮料的软化 ,脱色、脱臭，烟草脱尼古丁 13 ?化妆品及香料工业 ,天然香料萃取，合成香料的分离和精制 ,化妆品原料萃取，精制(界面活性剂、脂肪酸脂、甘油单酯等) ,超临界状态下的酶促反应 除了用SC-CO作萃取剂外，作为特殊的非水相的酶反应溶剂，近年来受到越来越多的关2 注。许多酶蛋白在SC-CO中不失去活性，且有催化功能。由于在自然界中酶的催化反应2 是在水相介质中进行的，所以酶在SC-CO介质中的催化行为，引起人们的强烈兴趣。根2 据目前的工作，SC-CO作为酶催化反应的介质有以下优点: 2 ?脂溶性底物和产物可溶于SC-CO中，酶蛋白不溶解，有利于三者的分离。 2 ?产品回收时，不需要处理大量的稀水溶液，因而不产生废水污染问题。 ?与其他非水相有机溶剂中的酶催化反应相比，SC-CO更适合与生物、食品相关的产品体2系，产物分离简单。 ?与萃取一样，SO-CO中的质量传递速度快，在临界点附近，溶解能力和介电常数对温2 度和压力敏感，可控制反应速度和反应平衡。 目前研究的有酯化反应、酯水解反应等。反应条件温和。 ,SC-CO的细胞破壁技术 2 SC-CO渗透力强，能快速渗入细胞内并达到细胞内外压力平衡。此时如突然降压，由于细2 胞内外压差较大，细胞剧烈膨大而发生胀裂。SC-CO的以下一些性质有利于细胞破碎: 2?在近临界点，SC-CO的微小压力变化导致其体积变化很大，其能量变化很大，所以2 SC-CO可破坏较厚的细胞壁，如常见的酵母等。 2 ?SC-CO对细胞壁中的少量脂类有萃取作用，会破坏细胞壁的化学结构，造成细胞壁在某2 些位置上的损坏。这种方式破坏的细胞壁碎片较大，使下游分离过程易于进行。 ?CO节流膨胀是吸热降温过程，这个性质可防止通常破碎过程的升温而引起的热敏性物2 质的破坏。 14