pda培养基

pda培养基 gus基因存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。可作为GUS基因 检测方法 根据gus基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法:组织化学法、分光光度法和荧光法(灵感度为分光光度检测法最高)，其中最为常用的是组织化学法。 组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞发生了解gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。 CTAB法的全称是十六烷基三甲基溴化铵法(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide)。 主要用于提取生物DNA 步骤(1) 2%CTAB抽提缓冲液在65?水浴中预热。 (2)取少量实验材料(约300mg)置于研钵中，用液氮磨至粉状; (3) 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动; (4) 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二; (5)置于65?的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，30~60min后取出; (6)冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇(24:1)至满管，剧烈振荡2~3 min(若提取的是总基因组，则不能剧烈震荡。)，使两者混合均匀; (7)放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 ul的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中; (8) 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物; (9)10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上; (10)60 sec后，直立离心管，加入720ul的75%乙醇及80 ul 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中; (11)放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解; (12)10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 ul 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min; (13)10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上;数分钟后，直立离心管，干燥DNA(自然风干或用风筒吹干); (14)加入50 ul 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37?恒温箱约15 h，使RNA消解; 以上为通用CTAB法,实验时可根据不同材料加以改进,以获得最佳实验结果. TE Buffer 配制: 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0) 1 mmol/L EDTA(pH 8.0) 因为含有以上两种物质，所以称为TE。 作用:TE缓冲液是弱碱性,对DNA的碱基有保护性,(DNA在它是的稳定性较好,不易破坏其完整性或产生开环及断裂),包括提取好的DNA也要放在TE缓冲液是保存. MD板上生长速度明显快于MM板的克隆为His+Muts, 而MD板上生长速度与MM 板上生长速度相当的克隆为His+Mut+甲醇利用正常型 His+Mut+和His+Muts的菌的生长状态不同的根本原因。如果没有记错的话只是对甲醇的利用能力不同，所以，在MD板子上，由于加入的是葡萄糖，所有的菌生长状态应该是一样，为什么你有三个菌长的慢可能是你再转接的时候点上去的菌量少。对于MM板，由于加入甲醇作为碳源，所以利用能力强的菌His+Mut+会先长出来，理论上就是和在MD板子上涨的速度一致，实际上MM上的菌总体都会比MD上的长的慢。而His+Muts型的菌长得非常慢，有时候甚至几乎在MM板上好像就没长。所以，你要好好观察MM板上的菌，长得比较大的应该就是His+Mut+。 处方药 所谓处方药是指需经过医生处方才能从药房或药店得到并要在医生监控或指导下使用的药物。国际上通常用Prescription Drug.表示，简称R(即医生处方左上角常见到的R)。 处方药一般包括:刚上市的新药:对其活性、副作用还要进一步观察; 可产生依赖性的某些药物:如吗啡类镇痛药及某些催眠安定药物等;药物本身毒性较大:如抗癌药物等;某些疾病必须由医生和实验室进行确诊，使用药物需医生处方，并在医生指导下使用，如心血管疾病药物等。 非处方药 与处方药相对，非处方药是指那些消费者不需要持有医生处方就可直接从药房或药店购买的药物。国际常用的术语有:Nonprescription Drug, Over the Counter Drug，简称为OTC Drug，现已经成为国际上非处方药简称的习惯用语。这些药 物大都属于如下情况:感冒、发烧、咳嗽;消化系统疾病;头痛;关节疾病;鼻炎等过敏症;营养补剂，如维生素、某些中药补剂等。 如何区别处方药和非处方药 品牌、标识物、标签及含有OTC指导的用语 在国际上，非处方药在品牌和标识物上有着自己独特的象征，如品牌应尽力统一，同时重视不断创新的提高知名度，以便在连锁店销售，同时也以品牌作为保护自己产品的措施。标识物应能明显区分该药是作为处方药还是非处方药使用，如美国的处方药均要注明"联邦法无医生处方禁止调配"(Federal Law Prohibits Dispensing Without Prescription)，而非处方药标签上应有"适应的用药指导"(Adequate Direction foruse)，英国、德国、日本等国也有类似的字样或标识。检签应以正常人能理解的文字表述，甚至加以图解，以便消费者凭标签便能正确使用非处方药。美国食品与药品监督管理局提出非处方药标签的7项内容有:(1)产品名称;(2)生产商、包装商或分发商的名称、地址;(3)包装内容物;(4)所有有效成份的INN(国际非专利药物通用名)名称;(5)某些其它组分如乙醇、生物碱等的含量;(6)保护消费者的注意事项及忠告性内容;(7)安全、正确使用该药品适当的用药指导。因此，人们在识别非处方药时一般可从其品牌、标识物、标签及含有OTC指导的用语中得以辩认。 沙保氏培养基 Sabouraud's smedium 含4%葡萄糖 1.0%蛋白胨 pH4.0,6.0，用于真菌培养。 大多数真菌营养要求不高，在沙保氏培养基，22,28?生长良好。大多于1,2周出现典型菌落。 A.巧克力培养基:脑膜炎球菌 B.伊红一美蓝培养基:鉴别大肠杆菌 C.亚碲酸钾培养基:白喉杆菌 D.沙保培养基:真菌 E.疱肉培养基:厌氧细菌 PDA培养基是人们对马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即Potato Dextrose Agar (Medium)，依次对应马铃薯、葡萄糖、琼脂的英文。 一种常用的培养基，宜培养酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌。 按物理性状划分:固体培养基 按培养基成分划分:半合成培养基 配方 马铃薯 200克 葡萄糖 20克 琼脂 15~20克 自来水 1000毫升 自然PH 配制步骤 其做法是称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂(煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用四层纱布过滤，再据实际实验需要加葡萄糖和琼脂，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管，加塞、包扎，(121?)灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 其他事项 1.培养基经灭菌后，必须放在37C温箱培养24h，无菌生长者方可使用。 2.PDA培养基一般不需要调pH。对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时，可用lmol,LNaOH或lmol,LHCL溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。 3.培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基，用于菌类的震荡培养。 4.培养基也可以加入氯霉素或土霉素，加入量为0.1g/L培养基，主要是为了抑制细菌的生长，减少干扰性 干燥培养基的制造方法 申请号/专利号: 93104723 本发明涉及用于培养真菌类微生物的马铃薯葡萄糖琼脂干燥培养基的制造方法。马铃薯经匀浆、浸提、液化、糖化、胰酶消化、煮沸过滤、浓缩及喷雾干燥等生产工艺得到马铃薯营养提取粉，配以适量的葡萄糖和琼脂粉，就可制成,,,干燥培养基。本发明从马铃薯中提取的营养物质数量是常规方法的,,,倍。本发明生产的,,,干燥培养基具有使用方便、营养丰富、更宜于微生物生长发育、节省原料、便于贮运、适合工业化生产等优点 划线法 获得单菌落 菌落接种 平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。 方式 划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线,第一区(A区)面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区(B、C区) 是逐级稀释的过渡区，第四区(D区)，则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。为了得到较多的典型单菌落,平板上四区面积的分配应是D,C,B,A。 编辑本段步骤 用接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到纯化分离微生物的一种方法。是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。用于目的微生物的分离。 编辑本段特点 快捷、方便、便于得到目的性状的单克隆。 编辑本段示例 对大肠杆菌的分离 实验器材 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合菌悬液 牛肉膏蛋白胨培养基 无菌培养皿，水浴锅，接种环等。 实验步骤 1(融化培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。 2(倒平板:待培养基冷却至50?左右，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15m1)，平置，待凝固。 倒平板的方法:右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰;然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 3(作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120?左右(平板转动一定角度约60?)，以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。 4(划线操作 (1) 挑取他含菌样品:选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。 (2) 划A区:将平板倒置于煤气(酒精)灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。 (3) 划其他区:将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区(菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。 5(恒温培养:将划线平板倒置，于37?(或28?)培养，24hr后观察。 基因组DNA提取方法 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式:异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤: 1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混匀。 4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50?水浴3h, 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的(酚，氯仿，异戊醇)混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相 6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min.。 7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。 2500rpm,离心10min。弃上清。 8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20?预冷无水乙醇。-20?20min。 9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。 外周血DNA提取技术 分离外周血白细胞提取方法: 试验步骤: 1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。 2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。 4、2500rpm离心10min，弃上清。 5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。 6、3000rpm离心10min，弃上清。 7、倒置离心管，去掉残液。 8、得白细胞，,80?C冻存。 试验要求: 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4?放置不超过5h，以防白细胞自溶。 氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA: 试验试剂: Ligsisbuffer: 133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5 mMEDTA0.2ml;最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。 ACD抗凝剂:柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g;最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。 提取缓冲液(Extractionbuffer): 10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDT A(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml;最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌 试验步骤: 1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。 3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl(裂解细胞)，混匀置于37?，水溶1h。 4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37?过夜(或55?，3h，但是37?效果要好些)。 5、每管加入450μl饱和酚(取溶液下层)缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。 6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿,异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 7、取上清，每管加入500μl氯仿,异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC，，适量无水乙醇(预冷)至满，摇匀放入-20?保存2h以上。 9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70,乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50,60?干燥。 10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。 NaI提取法提取外周血白细胞基因组: 实验步骤: 1、取外周抗凝血(全血)100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。 2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。 3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。 4、加入氯仿/异戊醇(24:1)400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。 5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。 6、弃异丙醇，加70,乙醇1ml(不振动)，以15000rpm离心12min。 7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干(37?恒温箱)后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA,12h以上，制成的DNA液-20?冰箱保存备用。 常用的外周血白细胞基因提取方法: 试验原理: 苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两 相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。 试验步骤: 1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)，混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37?水浴温育1h。 2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37?水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50?水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。 3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。 4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20?冰箱保存备用。 真核细胞DNA的制备 一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的、文库构建等实验。 根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则: 1、防止和抑制DNase对DNA的降解。 2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。 试剂准备: 1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。 2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。 3、裂解缓冲液:250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。 4、20%SDS 5、2mg/ml蛋白酶K 6、Tris饱和酚(pH8.0)、酚/氯仿(酚?氯仿=1?1)、氯仿 7、无水乙醇、75%乙醇 试验步骤: 材料处理: 1、新鲜或冰冻组织处理: 1)取组织块0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。 2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中。 3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。 4)60?C水浴1-3hr。 2、培养细胞处理: 1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。 2)离心4000g×5min，去除上清液。 3)加10倍体积的裂解缓冲液。 4)50-55?C水浴1-2hr。 DNA提取: 1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。 2、离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。 3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。 4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。 5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。 6、加1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。 7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。 8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。 9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。 植物组织中DNA的提取 试验原理: 脱氧核糖核酸(deoxribonucleicacid，DNA)是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15,的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿,异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95,的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。 植物DNA的SDS提取法: 试验试剂: 1、研磨缓冲液:称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA,Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。 2、10×SSC溶液:称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。 3、1×SSC溶液:用10×SSC溶液稀释10倍。 4、0.1×SSC溶液:用1×SSC溶液稀释10倍。 5、Rnase溶液:用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80?水浴处理5min(以破坏可能存在的Dnase)。 6、氯仿,异戊醇:按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。 7、5mol/L高氯酸钠溶液:称取NaClO4(H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。 8、SDS(十二烷基硫酸钠)化学试剂的重结晶:将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70,80?的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。 9、1mol,LHCl。 10、0.2mol/LNaOH。 11、二苯胺乙醛试剂:1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液〔浓乙醛:H2O,1:50(V,V)〕。 12、1.0mol/L高酸溶液(HClO4)。 13、0.05mol/LNaOH。 14、DNA液:取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。 实验步骤: 1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。 2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿,异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。 3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。 4、将试管置72?水浴中保温3min(不超过4min)，以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液:高氯酸钠溶液,4:1(V,V)〕，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。 5、再次加入等体积氯仿,异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心(4000rpm)5min，取上清液置小烧杯中。 6、用滴管吸95,的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。 7、然后加入0.5ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。 8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。 9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50,70μg/ml，并在37?水浴中保温30min，以除去RNA。 10、加入等体积的氯仿,异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。 11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。 植物DNA的CTAB提取法: 试验步骤: 1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。 2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65?水浴中，温育30min。 3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。 4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。 5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。 6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56?水浴中过夜。 7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4?预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。 8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。 9、将风干的DNA直接在4?保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20?保存。 细菌DNA的提取方法 针对一些不易于提取的细菌的方法: 试验试剂: 抽提缓冲液:2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)(去色素)100mMTris-HCl(pH8.0) 25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MLiCl 2MLiCl DEPC-water(抑制RNA酶活性) 3MNaAc(pH5.2) 96%乙醇 70%乙醇 试验步骤: 1、抽提缓冲液65?预热。 2、加菌体到已经预热的缓冲液(700ul)中混匀，65?，10min。 3、加酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，振荡，以12,000rpm，离心10min。 4、取上清，加氯仿/异戊醇(24:1)振荡，以12,000rpm，离心10min。 5、重复再作一次步骤4。 6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇(或加入等体积的异丙醇)，,20C下沉淀。 7、以2,000rpm，离心10min。 8、弃上清，以70,乙醇条洗沉淀，也可以再用100,乙醇洗，然后溶解于100ml水中。 较为常用的细菌DNA提取方法: 实验步骤: 1、将菌株接种于液体LB培养基，37?震荡培养过夜。 2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。 3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37?温育1h. 4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65?温育10min。 5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。 6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇 真菌DNA提取的两种方法: 第一种方法: 试验步骤: 1、取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。 2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。 3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3,5min(此处是粗提没有加酚)。 4、以4?，1000rpm，离心5min。 5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4?，10,000rpm，离心5min。 6、取上清，加入2/3倍体积的-20?预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。 7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。 8、加入1ulRNaseA(10mg/mL)，37?下处理1h。 9、用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4?，10,000rpm，离心5min。 10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,2.5倍体积的无水乙醇,-70?沉淀30min以上。 11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20?保存备用。 DNA提取液:0.2MTris-HCl(pH7.5)，0.5MNaCl，0.01MEDTA，1,SDS，3MNaAc。 第二种方法: 试验步骤: 1、真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。 2、加入3mL65?预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65?水浴30min,期间混匀2-3次。 3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。 4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm，4?离心5min)。 5、取上清，加入2/3倍体积的-20?预冷异丙醇,混匀,静置约30min。 6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。 7、加入1ulRNaseA(10mg/mL)，37?处理1h。 8、用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4?，10,000rpm，离心5min。 9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70?沉淀30min以上。 10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20?保存备用。 植物基因组提取(CATB法) 一、实验目的 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验材料 水稻幼叶 四、主要配方 2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭 菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 (400ul) 氯仿-异戊醇(24:1):先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。 五、实验步骤 1. DNA的提取 (1) 2%CTAB抽提缓冲液在65?水浴中预热。 (2)取少量叶片(约1g)置于研钵中，用液氮磨至粉状; (3) 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动; (4) 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌中，磨碎液的高度约占管的三分之二; (5)置于65?的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出; (6)冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇(24:1)至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀; (7)放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌中; (8) 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物; (9)10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上; (10)60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中; (11)放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解; (12)10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min; (13)10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上;数分钟后，直立离心管，干燥DNA(自然风干或用风筒吹干); (14)加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37?恒温箱约15 h，使RNA消解; (15)置于-20?保存、备用。 2. DNA质量检测 琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。 六、 注意事项 (1)叶片磨得越细越好。 (2)移液器的使用。 (3)由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。 .乙醇,醋酸铵缓冲液(pH3.7) 取5mol/L醋酸溶液15.0ml，加乙醇60ml和水20ml,用10mol/L氢氧化铵溶液调节pH值至3.7，用水稀释至1000ml，即得。 2.三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0) 取三羟甲基氨基甲烷12.14g,加水800ml,搅拌溶解，并稀释至1000ml,用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0,即得。 3.三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.1) 取氯化钙0.294g,加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液40ml使溶解，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1，加水稀释至100ml，即得。 4.三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH9.0) 取三羟甲基氨基甲烷6.06g,加盐酸赖氨酸3.65g、氯化钠5.8g、乙二胺四醋酸二钠0.37g，再加水溶解使成1000ml，调节pH值至9.0，即得。 5.乌洛托品缓冲液 取乌洛托品75g，加水溶解后，加浓氨溶液4.2ml，再用水稀释至250ml,即得。 6.巴比妥缓冲液(pH7.4) 取巴比妥钠4.42g,加水使溶解并稀释至400ml，用2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.4，滤过，即得。 7.巴比妥缓冲液(pH8.6) 取巴比妥5.52g与巴比妥钠30.9g,加水使溶解成2000ml，即得。 8.巴比妥,氯化钠缓冲液(pH7.8) 取巴比妥钠5.05g,加氯化钠3.7g及水适量使溶解,另取明胶0.5g加水适量，加热溶解后并入上述溶液中。然后用0.2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.8，再用水稀释至500ml，即得。 9.甲酸钠缓冲液(pH3.3) 取2mol/L甲酸溶液25ml，加酚酞指示液1滴，用2mol/L氢氧化钠溶液中和，再加入2mol/L甲酸溶液75ml,用水稀释至200ml,调节pH值至3.25,3.30,即得。 10.邻苯二甲酸盐缓冲液(pH5.6) 取邻苯二甲酸氢钾10g，加水900ml,搅拌使溶解，用氢氧化钠试液(必要时用稀盐酸)调节pH值至5.6,加水稀释至1000ml，混匀，即得。 11.枸橼酸盐缓冲液 取枸橼酸4.2g,加1mol/L的20,乙醇制氢氧化钠溶液40ml使溶解,再用20,乙醇稀释至100ml，即得。 12.枸橼酸盐缓冲液(pH6.2) 取2.1,枸橼酸水溶液，用50,氢氧化钠溶液调节pH值至6.2，即得。 13.枸橼酸,磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0) 甲液:取枸橼酸21g或无水枸橼酸19.2g,加水使溶解成1000ml，置冰箱内保存。乙液:取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000ml。取上述甲液61.45ml与乙液38.55ml混合，摇匀，即得。 14.氨,氯化铵缓冲液(pH8.0) 取氯化铵1.07g，加水使溶解成100ml，再加稀氨溶液(1?30)调节pH值至8.0，即得。 15.氨,氯化铵缓冲液(pH10.0) 取氯化铵5.4g，加水20ml溶解后，加浓氯溶液35ml，再加水稀释至100ml，即得。 16.硼砂,氯化钙缓冲液(pH8.0) 取硼砂0.572g与氯化钙2.94g，加水约800ml溶解后,用1mol/L盐酸溶液约2.5ml调节pH值至8.0，加水稀释至1000ml，即得。 17.硼砂,碳酸钠缓冲液(pH10.8,11.2) 取无水碳酸钠5.30g,加水使溶解成1000ml;另取硼砂1.91g，加水使溶解成100ml。临用前取碳酸钠溶液973ml 与硼砂溶液27ml，混匀，即得。 18.硼酸,氯化钾缓冲液(pH9.0) 取硼酸3.09g,加0.1mol/L氯化钾 溶液500ml使溶解，再加0.1mol/L氢氧化钠溶液210ml，即得。 19.醋酸盐缓冲液(pH3.5) 取醋酸铵25g，加水25ml溶解后，加7mol/L盐酸溶液38ml，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节pH值至3.5(电位法指示),用水稀释至100ml,即得。 20.醋酸,锂盐缓冲液(pH3.0) 取冰醋酸50ml，加水800ml混合后，用氢氧化锂调节pH值至3.0，再加水稀释至1000ml，即得。 21.醋酸,醋酸钠缓冲液(pH3.6) 取醋酸钠5.1g,加冰醋酸20ml，再加水稀释至250ml,即得。 22.醋酸,醋酸钠缓冲液(pH3.7) 取无水醋酸钠20g,加水300ml溶解后，加溴酚蓝指示液1ml及冰醋酸60,80ml，至溶液从蓝色转变为纯绿色，再加水稀释至1000ml，即得。 23.醋酸,醋酸钠缓冲液(pH3.8) 取2mol/L醋酸钠溶液13ml与2mol/L醋酸溶液87ml,加每1ml含铜1mg的硫酸铜溶液0.5ml,再加水稀释至1000ml，即得。 24.醋酸,醋酸钠缓冲液(pH4.5) 取醋酸钠18g,加冰醋酸9.8ml,再加水稀释至1000ml,即得。 25.醋酸,醋酸钠缓冲液(pH4.6) 取醋酸钠5.4g,加水50ml使溶解，用冰醋酸调节pH值至4.6，再加水稀释至100ml，即得。 26.醋酸,醋酸钠缓冲液(pH6.0) 取醋酸钠54.6g，加1mol/L醋酸溶液20ml溶解后，加水稀释至500ml，即得。 27.醋酸,醋酸钾缓冲液(pH4.3) 取醋酸钾14g，加冰醋酸20.5ml，再加水稀释至1000ml，即得。 28.醋酸,醋酸铵缓冲液(pH4.5) 取醋酸铵7.7g，加水50ml溶解后，加冰醋酸6ml与适量的水使成100ml，即得。 29.醋酸,醋酸铵缓冲液(pH6.0) 取醋酸铵100g，加水300ml使溶解，加冰醋酸7ml,摇匀，即得。 30.磷酸,三乙胺缓冲液 取磷酸约4ml与三乙胺约7ml，加50,甲醇稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至3.2，即得。 31.磷酸盐缓冲液 取磷酸二氢钠38.0g，与磷酸氢二钠5.04g,加水使成1000ml,即得。 32.磷酸盐缓冲液(pH2.0) 甲液:取磷酸16.6ml，加水至1000ml，摇匀。乙液:取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000ml。取上述甲液72.5ml与乙液27.5ml混合，摇匀，即得。 33.磷酸盐缓冲液(pH2.5) 取磷酸二氢钾100g，加水800ml，用盐酸调节pH至2.5,用水稀释至1000ml。 34.磷酸盐缓冲液(pH5.0) 取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液一定量,用氢氧化钠试液调节pH值至5.0，即得。 35.磷酸盐缓冲液(pH5.8) 取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g,加水使溶解成1000ml，即得。 36.磷酸盐缓冲液(pH6.5) 取磷酸二氢钾0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液15.2ml，用水稀释至100ml，即得。 37.磷酸盐缓冲液(pH6.6) 取磷酸二氢钠1.74g、磷酸氢二钠2.7g与氯化钠1.7g，加水使溶解成400ml，即得。 38.磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8) 取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml 使溶解,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8;另取胰酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后,加水稀释至1000ml，即得。 39.磷酸盐缓冲液(pH6.8) 取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。 40.磷酸盐缓冲液(pH7.0) 取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释至100ml，即得。 41.磷酸盐缓冲液(pH7.2) 取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液50ml与0.2mol/L氢氧化钠溶液35ml，加新沸过的冷水稀释至200ml，摇匀，即得。 42.磷酸盐缓冲液(pH7.3) 取磷酸氢二钠1.9734g与磷酸二氢钾0.2245g,加水使溶解成1000ml，调节pH值至7.3，即得。 43.磷酸盐缓冲液(pH7.4) 取磷酸二氢钾1.36g， 加0.1mol/L氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml，即得。 44.磷酸盐缓冲液(pH7.6) 取磷酸二氢钾27.22g，加水使溶解成1000ml，取50ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液42.4ml，再加水稀释至200ml，即得。 45.磷酸盐缓冲液(pH7.8) 甲液:取磷酸氢二钠35.9g，加水溶解，并稀释至500ml。乙液:取磷酸二氢钠2.76g，加水溶解，并稀释至100ml。取上述甲液91.5ml与乙液8.5ml混合，摇匀，即得。 46.磷酸盐缓冲液(pH7.8,8.0) 取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使溶解成1000ml，即得