原代细胞培养步骤

原代细胞培养步骤 原代培养(primary culture)，准备工作: A玻璃用品清洁，灭局步骤: 1， 洗涤剂正常洗刷干净 2， 放入托盘中，200度烤1-2h(烘干) 3， 泡酸(过夜)，吸管捆好，做好记录 4， 捞酸，冲洗干净(注意安全) 5， 放入托盘中，200度烤1-2h(烘干) 6， 包瓶，吸管用棉花塞好，报纸包好，烧杯和配液的瓶子，瓶口内层用硫酸纸，外层用牛 皮纸，包好，用线系好 7， 放入托盘中，200度烤2h(灭菌) 8， 收集放好 B塑料，瓶盖，胶塞清洁处理步骤 1， 用洗涤剂正常刷洗干净 2， 晾干，放入酸中，过夜(胶塞除外) 3， 次日捞出，冲洗干净，过三水(蒸馏水，三蒸水，去离子水) 4， 放入饭盒中，高压锅，烘干箱，烘干 C器械盒(3把剪刀，2把镊子，2个烧杯，2个滤网，2个培养皿) 1， 洗涤剂冲洗干净 2， 过三水 3， 放入饭盒中压，烘干 乳鼠心肌原代培养过程: A准备工作: 1，剪封口膜(3-4个长的;鼠的只数x2+2的短封口膜) 2，器械:平镊，弯镊，剪刀(3把)，筛网 3，离心管，吸管，平皿1对，50ml烧杯1个，冰袋 2+4，DMEM，DMEM+10%FBS 胰酶(不含EDTA—除去细胞互相粘着所依赖的Ca，再 经机械轻度振荡，使之成为单细胞。) B步骤 (一)准备 1，将所需的离心管放在试管架上(PS:大概一只心脏一只离心管;多准备3个--2个消化细 胞用，一个放混匀用的吸管用) 2，点燃酒精灯，依次将吸管打开，加上胶头，并标明吸何种液体，以免操作中混淆(PS: 2个吸管--胰酶和混匀用;一个移液管--移取培养液用) 3，打开试剂，将其盖，放在远离操作的空间尽量往里 4，打开器械，按顺序依次摆放(2把剪刀;一把弯镊) 5，用酒精擦试冰袋，打开平皿，并将平皿过火，将平皿放在冰袋上，在每个平皿里加入DMEM(无血清) (二)取乳鼠心脏 1，戴无菌手套，将小鼠浸入酒精中消毒，捏抓小鼠背部皮肤，用1st剪刀剪掉头部，然后 剪开皮肤，在用2nd剪刀，剪开胸骨(靠左侧点)用镊子夹取心脏，放入DMEM平皿中， 注意镊子不要碰到别处。(PS:剪时不要剪到腹腔，避免污染) 2，待所有乳鼠心脏取完后(将心脏上带的血管和心房剪掉) 3，将剩下的心室剪成均匀的几块(*均匀) (三)消化 1，用吸管，将均匀几等分的心脏，吸入离心管中，将上清DMEM弃掉，加入大约组织块2倍的胰酶，进行消化，封口，放入37度水浴锅中摇晃，大约3分钟，用吸管将胰酶吸出弃掉。(清洗组织) 2，重新加入新的胰酶，封口，放入37度水浴锅中摇晃，大约1分钟，timer计时(具体时间可以依胰酶活性再摸索)，待液体浑浊时(液体不要变黄-消化过了;白色范围内即可)，将液体吸出，放入另一个离心管中加入等体积的DMEM+FBS以中和胰酶，注意混匀，封口，放入4度，而原有组织块的离心管，再加入2倍的胰酶。 3，重复，操作“2”6-7次，直至组织块消化完。 4，消化液在不锈钢筛网上过滤，之后再将烧杯中的液体加入新的离心管中，封好，2500r/3min(1500r/5min)离心。(PS:离心后，不要震动将沉淀震开) 5， 离心后，迅速倒掉上清，向离心管中加入培养液(90%DMEM+10%FBS) 6， 轻摇吹匀，吸入培养瓶中，瓶口旋松，倒置，放入CO培养孵箱中(PS:3只鼠一只培2 养瓶;每个培养瓶4ml培养液;一只鼠一个小皿;每个小皿1-2ml培养液) 7， 差速贴壁: (1) 在1.5-2h后，将倒置的瓶正着取出，用10-100uL枪以100:1的比例加入双抗和BRDU (抗成纤维生长)，放入CO孵箱中培养(正方) 2 (2) 48小时心肌细胞贴壁，换液(有血清DMEM，注用PBS清洗细胞表面，不要将贴 壁细胞吹起) 注:原代细胞培养后，48小时换液 第二天早上，培养，换液后的细胞状态良好才可以用 转染，转染试剂+mi-RNA，混合15-20min 转染试剂用量:瓶+10ul;6孔+5ul 转染6h后换液;转染换液后24h后可以用。 转染注意事项: 1，有n个孔，摆2n个EP管，分别加入1/2量opti+转染试剂和1/2 opti+mi-RNA 2，X-treme在5min内要将2者混起来，lipo是5min以上;混合20min左右，则可加入细胞中。 3， 加入时，将培养液弄起，缓慢加入培养液内，不要碰到细胞转染时的比例: 瓶:4000ul培养液(无血清)+1000ul opti(10ul X-treme+490ul opti;10ul mi-RNA+490ul opti) 6孔板:1600ul培养液(无血清)+200ul opti(5ul X-treme+95ul opti;5ul mi-RNA+95ul opti) 24孔板:900ul培养液(无血清)+100ul opti(1ul X-treme+49ul opti;1ul mi-RNA+49ul opti) PS:转染是将外源基因导入细胞内的一种专门技术。