套式实时荧光定量PCR检测人外周血单个核细胞中FOXP3mRNA

套式实时荧光定量PCR检测人外周血单个核细胞中FOXP3mRNA 套式实时荧光定量PCR检测人外周血单个 核细胞中FOXP3mRNA 临床检验杂志2006年第24卷第4期ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience,2006,Vo1.24,No.4289 文章编号:1o01_764x(2oo6)042893中图分类号:R446.6文献标识码:A?研究生园地? 套式实时荧光定量PCR检测人外周血单个核细胞中 FOXP3mRNA 曹新国,王礼文(江苏省中医院,南京210029) 摘要:目的建立检测人外周血单个核细胞(PBMC)中FOXP3mRNA的方法.方法跨内含子设计外引物,并根据扩增的片 段,设计一对内引物和raqM~探针,采用套式实时荧光定量PCR(nested—real—time—PCR)方法.首次PCR扩增用减少引物浓 度及循环次数的方法以增加其模板的特异性,再行第二次PCR扩增作实时荧光定量检测,用FOXP3和B—actin品作标准 曲线,以二者比值作为FOXP3mRNA表达水平指标.结果重复6次PCR,6次试验cl的总平均值为14.66,平均变异系数为 5.81%.ct值和模板起始浓度对数值之间具有较好的线性关系(R=0.999);检测最低浓度可达100拷贝.结论nested—re— al—time—PCR检测PBMC中FOXP3mRNA的方法简单且重复性好,高度敏感且特异,可作为评价免疫功能及某些疾病治疗效果 观察的临床常用方法. 关键词:FOXP3;nested—real—time—PCR;基因表达 人类免疫调控转录因子FOXP3基因是分叉头/ 翼状螺旋转录调节因子家族中的一员,该基因对免 疫自身稳定作用十分重要,有着调控Tr细胞的发育 及功能的作用j.目前认为FOXP3特异表达于 CD4CD25T细胞,可作为Tr细胞的特异分子标 志物J.与检测CIMCD25调节T细胞的数量相 比,检测FOXP3的表达水平能更准确反映机体调节 性T细胞的功能.目前,实时荧光定量PCR(rea1. time—PCR)检测FOXP3mRNA还仅限于实验室收集 的纯化CIMCD25T细胞,其FOXP3mRNA含量较 高.为探讨一种适用于临床的检测方法,直接从人 的外周血单个核细胞(PBMC)中检测FOXP3mRNA, 我们建立了一种套式实时荧光定量PCR(nested.re. al—time—PCR)方法,报告如下. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1主要试剂Trizol裂解液购自Invitrogen公 司,AMV逆转录酶,TaqDNA聚合酶购自Promega公 司;oligo(dT).,RNAase抑制剂购自大连宝生物公 司;引物为上海Invitrogen公司合成. 1.1.2主要仪器定量PCR分析仪为Rotor.gene 2000real—timecycler(澳大利亚CorbettResearch公 司),Centrifuge5417R高速冷冻离心机(德国Eppen. doff公司),UV2401PC紫外可见分光光度计(日本 Shimadzu),PE9600扩增仪(美国ABI公司). 1.1.3标本收集正常人体检抗凝血标本15份, 类风湿性关节炎(RA)病人20份,治疗前后结果对 比5份,红斑狼疮病人6份,共计46份. 1.2方法 1.2.1引物,探针的设计与合成根据GeneBank 提供的FOXP3mRNA序列(GeneBank号: AF277993)和p—actin序列(GeneBank号: AY399813)设计引物.FOXP3外引物:上游:5. GCACArIq"CCCAGAGrI11CCTCC.3;下游:5.CCTAT. CATCCCTGCCCCCA一3;扩增片段长度422bp. FOXP3内弓I物:上游:5.TCACCTACGCCACGCT. CAT.3;下游:5.ACTCAGG33"GTGGCGGATG.3;扩 增片段长度152bp.TaqMan探针:5.FAM.AG. GCTCCAGAGAAGCAGCGGACACTC一3TAMRA.13一 actin外弓I物:上游:5.GCGAGAAGATGACCCAGAT. CA一3;下游:5.CATCTC1_rGCTCGAAGTCCA.3;扩 增片段长度335bp.13一actin内引物:上游:5. ACACTGTGCCCATCTACGAG.3;下游:5.rIq'CAT. GAGGTAGTCAGTCAGGTCCC一3;扩增片段长度91 bp.TaqMan探针:5.FAM.ATGCCCTCCCCCATGC. CATCCTGCGT—TAMRA.3.. 1.2.2总RNA的提取和逆转录用等量淋巴细胞 分离液自全血分离PBMC,严格按Trizol试剂说明书 提取PBMC总RNA,分光光度计检测RNA的质量 和浓度.逆转录用二步法,模板RNA1—2g,300 作者简介:曹新国,1978年生,男,硕士研究生,从事分子生物学和临床免疫学方面的研究. 通讯作者:王礼文,主任技师,硕士研究生导师,主要从事微生物学和免疫学诊断研究. 290临床检验杂志2006年第24卷第4期ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience,2006,Vo1.24,No.4 g/mloligo(dT)153,70?5min,冰上放置5 min.此后再加5×AMV缓冲液4l,10mmoL/L dNTP2l,RNAase抑制剂1l,AMV酶1l,加 DEPC水至20l,42?60min,95?灭活5min,逆 转录的cDNA置一7OqC保存备用. 1.2.3FOXP3定量标准品的构建取上述cDNA3 l,用FOXP3外引物在PE9600上进行扩增:95? 预变性5min,95?20S,64?20S,72?30S,共 35个循环;最后72延伸5min.经电泳回收纯化 的PCR产物,与pGEM.T载体4?连接12,16h. 连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5a,涂布于含 x.gal和IPTG并具Amp抗性的15g/L琼脂平皿上, 37?倒置14,16h培养,经蓝白斑筛选,EcoRI酶 切初步鉴定,阳性克隆交上海博亚公司测序分析. 阳性菌株进一步扩增后抽提质粒,用核酸紫外分光 光度计准确定量,换算成拷贝数后作1:10倍比稀 释,作为标准品一70?保存. 1.2.4B.actin定量标准品的构建取上述cDNA3 l,用B.actin外引物在PE9600上扩增片段,其余 步骤同FOXP3定量标准品的构建. 1.2.5PCR扩增每份标本及各系列拷贝标准品 以同样条件,分2管同时扩增FOXP3mRNA和B.ac- tin.每管取逆转录产物3l,10×PCR缓冲液2.5 l,dNTP(10mmoL/L)0.5,MgC12(25mmol/L) 1.5tzl,TaqDNA聚合酶(5U/pA)0.2l,分别加 FOXP3mRNA和B-actin上,下游外引物(10 mmoL/L)各0.25tzl,加水至25l,在PE9600扩增 仪上95qC20S,64qC20S,72qC30S,共l8个循 环.首次PCR扩增完成后,作FOXP3mRNA和B. actinrea1.time-PCR,同样条件,分2管进行.dNTP (10mmoL/L)(),5tzl,MgC12(25mmoL/L)3l,Taq DNA聚合酶(5U/~1)0.2,10×PCR缓冲液2.5 l,再分别吸取扩增产物1l,FOXP3mRNA和B. actin上,下游内引物(10mmoL/L)各0.5l,荧光探 针(20mmo~L)0.5l,加水补足至25l,在Rotor Gene2000荧光定量扩增仪上93?预变性2min后 93?5S,60?35S,40个循环,从仪器电脑软件上 读取结果. 2结果 2.1总RNA的质量和纯度Trizol法提取PBMC 总RNA,经琼脂糖凝胶电泳显示清晰的28S,18S,5 s条带,紫外分光光度计检测RNA溶液A?/A舳在 1.8,2.0之间,提示总RNA完整性和质量较好. 2.2电泳检测PCR扩增产物以cDNA为模板, FOXP3外引物和B.actin外引物做第一次扩增,产物 片段422bp.再以FOXP3内引物和B-actin内引物 做第二次扩增,经15g/L琼脂糖凝胶电泳,产物片 段9lbp.电泳结果显示扩增出的目的片段分子量 大小与预期目的片段符合,见图1. Markerl234567Marker 4 5 oo 00 b b 3oob 4 5 oo 00 b b 3oob 2oob loob 2oo loo 注:1—6依次为:活动期RA,系统性红斑狠疮,皮肌炎,静止期 RA,肿瘤,正常人的PCR扩增产物;7:阴性对照. 图1FOXP3,13-aetinPCR外,内引物扩增产物电泳结果 2.3阳性克隆的鉴定经凝胶回收的PCR大引物 电泳产物与T载体连接后,转化DH5a,获得重组质粒,EcoRI酶切初步鉴定,并经测序证实与NCBI基 因序列(GeneBank号:AF277993)一致. 2.4套式荧光定量PCR的线性范围用10倍系 列稀释的质粒标准品(10.,10)作套式荧光定量 PCR,将Ct值与不同浓度标准品的对数值拟合作 图,得出的标准曲线显示,Ct值和模板起始浓度对 数值之间具有较好的线性关系(R=0.999);检测 灵敏度可达到100拷贝. 2.5套式荧光定量PCR检测的重复性6次PCR (每次各6管)的Ct均值分别为14.55,14.496,14. 4,14.844,14.89,14.75,变异系数分别为8.24%, 5.69%,7.78%,4.92%,2.33%,5.89%;6次试验 Ct的总平均值为14.655,平均变异系数为5.81%. 2.6临床标本检测FOXP3mRNA表达水平以 FOXP3/actin比值表示,15份正常人比值均数为0. 536,20份RA病人为0.806,6份红斑狼疮病人为 0.682;RA治疗前比值均数为0.5894,治疗后为1. 0152,上升81%. 3讨论 检测基因mRNA表达,应尽可能跨内含子设 计,这样可避免残余DNA扩增,能准确反映mRNA 基因表达水平.本实验nested.rea1.time.PCR的外引 物采用跨内含子设计,则基本达到此目的.我们通 一泐K外外 临床检验杂志2006年第24卷第4期 ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience,2006,Vo1.24,No.4291 过首次PCR以增加原始模板量,再用内引物作real— time.PCR,可大大增加原rea1.time.PCR法的特异性 和敏感性.由于是直接从外周血检测FOXP3, CD4CD25T细胞数量少,个体之间FOXP3表达 差异又较大,用nested—real—time—PCR能很好的解决 这一问.我们研究表明,首次PCR扩增减少引物 浓度及循环次数,可减少非特异扩增,提高模板特异 性.这样既可增加原始模板量,又可使第二次PCR 扩增作实时荧光定量检测时的本底大大减少,使敏 感性大为提高.由于多一次PCR扩增,注意条件一 致,精确操作是保证检测结果可靠的重要因素. FOXP3的表达和CD4CD25T细胞数量并不 一 定相关,有可能存在差异.在评价治疗肿瘤和自 身免疫性疾病的效果时,观察FOXP3表达的高低, 可能比检测CD4CD25T细胞数量更有意义L5. 有些免疫性疾病,如RA,SLE急性期病人反而 CD4CD25T细胞数量增高明显,原因可能是一种 功能缺陷代偿性增高.本文初步结果也证实,外 周血CD4CD25T细胞数量和FOXP3mRNA表达 有相同增高趋势,但并不相关.虽CD4CD25T细胞数量增高,但FOXP3mRNA表达增高不明显.然 用免疫抑制性药物治疗病人症状改善后,检测 FOXP3mRNA表达水平比CD4CD25T细胞数量 增加更为明显.这可能是CD4CD25T细胞表达 FOXP3mRNA增强,表明CIMCD25T细胞功能恢 复的一种反映.要阐明FOXP3mRNA表达水平的 临床意义尚需更多的临床资料给予证实.我们首次 建立了一种从PBMC中检测FOXP3mRNA的方法, 其方法简单,重复性好,并有很高的敏感性和特异 性,应用该检测方法可为各种自身免疫性疾病的诊 断和疗效评估提供实验参考数据. 参考文献: [1]HoriS,NomuraT,SakaguchiS.ControlofregulatoryTcelldevelop- mentbythetranscriptionfactorFoxp3[J].Science,2003,299 (5609):1057-1061. [2]HoriS,SakaguchiS.Foxp3:acriticalregulatorofthedevelopment andfunctionofregulatoryTcells[J].MicrobesInfect,2004,6(8): 745-751. [3]SchubertLA,JefferyE,ZhangY,eta1.Scurfin(FOXP3)actsasa repressoroftranscriptionandregulatesTcellactivation[J].JBiol Chem,2001,276:37672-37679. [4]ChatilaTA,BlaeserF,HoN,eta1.Encodingaforkhead-relatedpro- rein,ismutatedinX-linkedautoimmunity-allergicdisregu|ationsyn- dreme[J].JClinInvest,2000,106(12):R75.R81. [5]MorganME,JolandaHM,BilsenV,eta1.ExpressionofFOXP3mR- NAisnotconfinedtoCD4+CD25+Tregulatorycellsinhumans [J].HumanImmunology,2005,66(1):13-20. [6]曹新国,王礼文.人类免疫调控转录因子FOXP3研究进展[J]. 临床检验杂志,2006,24(1):63-65. [7]EhrensteinMR,EvansJG,SinghA,eta1.Compromisedfunctionof regulatoryTcellsinrheumatoidarthritisandreversalbyanti-TNF— therapy[J].JExpMed,2004,200(3):277-285. Nestedreal-timePCRfordetectionofhumanFOXP3mRNAinperipheralblood mononuclearcells CAOXinguo,WANGLiwen(JiangsuHospitalofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China) Abstract:ObjectiveTodevelopanested—real— timePCRmethodforthedetectionofFOXP3mRNAinhumanDeripheralbloodmononu. clearcells(PBMC).MethodsTheouterprimersweredesignedbyspanintron.andtheinnerprimersandTaqManprobeweredesigned accordingtotheamplifiedsequence.Duringthenestedreal?timePCR,decreaseprimersconcentrationandcycletimesweredecreasedin firstPCRamplificationtoincreasespecifictemplates,thenquantitativereal— timefluorescencewasdetectedinthesecondPCRamDlifi. cation.ThestandardcurvewascreatedbyFOXP3andbeta-actinrecombinedplasmidDNArespectively,andtheresuhswerepresented astheratiosofFOXP3mRNAtobeta— actinmRNA.ResultsTotalmeanCt(thresholdcycle)in6testswas14.66.ThemeanCV(coeffi. cientofvariation)was5.81%.ThestandardcurveshowedafinelinearrelationshipbetweenCtandtemplateconcentration.andthe correlationc~efficientwas0.999.Thesensitivitywas100timeshigherthannormalrea1.timePCRbyreach100copy.ConclusionsNesI ted.real.time.PCRforthedetectionofFOXP3mRNAinhumanPBMCisasimple,repeatable,highspecificandsensitivemethodtoe. valuateimmunefunctionandobservetherapeuticeffectsincertaindiseasesforclinicalroutineapplication. KeyWords:FOXP3;nested—rea1.timePCR;geneexpression (收稿日期:2005.11-27) (本文编辑:杨林)