第六章 愈伤组织培养

null第六章 愈伤组织培养第六章 愈伤组织培养　细胞的全能性和植物的再生性 　细胞的全能性和植物的再生性 细胞的全能性:? 再生概念：从一个植株分离根、茎、叶等，在切口处组织长出不定芽和不定根，从而成为新的完整的植株。 在自然情况下，一些植物的营养器官和细胞再生比较困难，主要是由于内源激素调整缓慢或不完全，外界条件不易控制等因素所致。在组织培养人工控制培养的条件下，通过对培养基的调整，特别是对激素成分的调整，就有可能顺利地再生。愈伤组织 (Callus) ？愈伤组织 (Callus) ？愈伤组织(callus)：愈伤组织原是指生物在受伤以后于伤口面形成的一团薄壁细胞。在组织培养中，则是指外植体在人工培养基上诱导产生的无序生长的薄壁细胞团。 null在组培中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并再分化成植株。 植物之所以会产生器官，是由于受伤组织产生了创伤激素，促进了周围组织的生长而形成愈伤组织，凭借内源激素和贮藏营养的作用又产生新的器官。 通过诱导愈伤组织进行植物体组培的的优点： 快速 得到大量的愈伤组织，进而得到植株 在组织培养中再生植株还可通过与合子胚相似的胚胎发育过程进行，即形成胚状体再发育成完整植株。 null愈伤组织培养的主要内容: 材料的制备 愈伤诱导与分化 形态发生 愈伤的培养null第一节 植物材料（外植体）的制备 1.一般植物组织都能诱发愈伤组织。 诱导愈伤组织的成败关键主要不是实验材料，而是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。 双子叶植物为最多，单子叶植物少些，此外，裸子植物、蕨类和藓类植物也有诱发成功的例子。:null所有的多细胞植物都有诱发愈伤组织成功的潜在可能性。 植物的各种组织，如维管束形成层、贮藏器官的薄壁组织、根的中柱鞘、胚乳、子叶、叶片的叶肉、维管束组织等，在合适的条件下，都能形成愈伤组织。 双子叶植物能够迅速地长出愈伤组织。null2.材料必须完全无菌 微生物一旦与培养基接触，就迅速繁殖，抑制愈伤组织的生长。 用抗菌素来抑制微生物的生长，在短时间有效，而且抗菌素只能对一定谱系中的细菌才产生作用，该谱系以外的微生物仍然可以大量繁殖。 抗菌素还可能抑制植物组织的生长。null得到无菌材料，植物组织必须先进行消毒。 有好几种化学试剂都能起到表面消毒的作用，试剂的选择及处理时间的长短要根据材料对试剂的敏感性来决定。null一般都采用在消毒后能很容易去除的药剂。 因为消毒剂对植物细胞也有杀伤作用，若不去除就会妨碍愈伤组织的发生。 例如用无菌水反复冲洗后可以把大部分药剂都洗掉，或者能自动分解变成低毒性物质。null次氯酸钠能分解成为具有杀菌效能的氯气，然后就散失到空气中。 低浓度的氯化汞是一种令人满意的消毒剂，只是难以去除，故在消毒后必须用大量清水冲洗材料。 在材料放入消毒剂之前，先在乙醇中漂洗一下，可以使材料表面弄湿，从而使消毒剂易于渗入并杀死微生物。null3.外植体的大小和形态 消毒后的植物材料，即可进行培养。 从外表均一的外植体长出的愈伤组织，在开始阶段是相当一致的，而从茎、根等器官切段上长出的则是一个混杂的愈伤组织。 有些外植体外表上看来是由同一类细胞组成，例如烟草的髓、胡萝卜的次生韧皮部、菊芋的块茎等，这些细胞中DNA的含量有很大差别。这种差别可能是由于细胞核中染色体数目的差别，即倍性不同所造成的。null得到形态一致的愈伤组织的培养策略 从切段中取出某一种组织进行培养。 改变培养基的组成，只促进某一类细胞分裂而抑制其他细胞分裂的办法来建立这一类细胞的愈伤组织。 往往培养基略加改变就能改变愈伤组织的整个性质。null接种的外植体的大小和形状并不需要严格限制 不能太小，小于肉眼能见的限度时，细胞分裂可能难以发生。故一般要求切块的大小要适当。 外植体的细胞数目多，获得愈伤组织的机会也多。null如果目的仅在于得到愈伤组织，将茎的切段、叶、根、花、果实或种子，或其中的某种组织切成一片片或一块块放到培养基上就可以了。null如果要定量地研究愈伤组织的发生，外植体的大小必须一致，形状和组成也要基本相同。进行这类研究常选用组织块较大的材料，例如胡萝卜的贮藏根、马铃薯的块茎、菊芋、荷兰防风草等。这样才能得到足够数量的、无菌的、一致的、适合于培养的外植体。null具体的操作过程： 无菌的块茎或块根，用钻孔器钻出一批同一类薄壁组织圆柱形的组织，平行排列好。多把刀片等距离地固定在一组金属片之间，一次切下去得到许多个长短一致的圆柱形的外植体。null圆柱形大量地、准确地得到外形相同的外植体。 圆柱体的表面积大，利于组织块和外界气体和营养物的交换。 外植体的损伤表面分泌物，具有促进愈伤组织形成的能力，因此表面积越大，产生分泌物数量也越多，愈伤组织的得率也越高。 外植体的体积应尽可能小，从而得到较大数量的外植体。外植体最小的限度由其亲本组织细胞的平均大小来决定。细胞数目。null例如菊芋的细胞比胡萝卜根次生韧皮部的细胞大三倍，一个3.8毫克的胡萝卜外植体大约包含25，000个细胞，这样一个外植体是能够成活的。而同样重量的菊芋外植体，由于细胞大而数目少，在分离过程中造成损伤往往难以成活。必须重量达到8毫克才包含约20，000个细胞，使之易于成活。null 第四节 愈伤组织的 培养 一、培养基 培养基一般包括大量元素、微量元素和一种碳水化合物，最常用的碳水化合物是蔗糖。 这样简单的培养基(基本培养基)只有很少几种植物组织能够培养和维持下去，大多数组织需要添加各种各样的附加物（完全培养基），如维生素、氨基酸、糖醇，生长素、细胞分裂素、赤霉素、螯合剂如EDTA、各种营养性的提取物如椰子汁等。null注意：选用完全已知的合成化合物，不大主张用复杂的天然产物，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。 必须强调： 适合于诱发愈伤组织的培养基不一定适合于维持这些愈伤组织；适合于液体培养的培养基也不一定适合于固体培养。null早期， 采用无机盐浓度低的培养基，化学工业不够发达，化学试剂中杂质含量较高。用高浓度无机盐带入更大量的杂质，往往会抑制愈伤组织的生长。 近代，MS培养基或类似MS培养基的高浓度的培养基。高浓度无机盐既有利于保证组织生长所需的矿质营养，愈伤组织生长快，又因离子浓度高，在配制、贮存、消毒等过程中，若某种成分略有出入，也不致影响培养基的离子平衡。null培养基中的N，大多数都用硝态氮，只有MS培养基和B5培养基中才用硝态和铵态的混合物。 K的水平在近代的培养基中有逐渐提高的趋势。 有趣的是，各种离子浓度大为不同的培养基往往能使相同的组织快速生长。例如Hildebrandt培养基与MS培养基显著不同，但二者都能培养烟草的愈伤组织。null注意： 激素的种类和用量的添加null二、愈伤的培养方式：培养分为固体和液体培养两大类。液体培养又分静止和振荡培养的二类。 1、静止液体培养 是由Heller和Gautheret(1940)在矿质营养工作的基础上发展起来的。方法简便。 优点：是培养基中不出现营养物浓度差异的现象，可以用来进行许多营养方面的研究工作。 null操做方法： 试管中先放入液体培养基，然后放入滤纸，滤纸制成桥状的支持物，使它正巧贴在液面上，最后把组织放在滤纸上。滤纸象灯芯一样不断给组织提供水分和营养。 这种静止培养目前已经很少有人应用了。null2、振荡液体培养 外植体在液体培养基中不断转动，消除静止培养的缺点。 振荡培养又分二类。(1)连续浸没的。(2)定期浸没的。 (1)连续浸没 搅动培养液或振动培养液使组织悬浮于培养基中。 一般容器中培养液的体积要少些，以确保最大的气相表面，造成较好的通气条件。一般培养液的体积约占容器体积的20％。 null小量培养采用磁力搅拌器比较方便，一般选用250转／分的转速。在一个150毫升的三角瓶中放16毫升培养基，在这里组织可生长约10天。 大量培养采用摇床，往复式摇床和旋转式摇床都可用，但以用后者为多。振动速度一般是50-100转／分。 null(2)定期浸没的 组织块时而在液体中时而在 气体里，这样既可保证培养基的充分混和，又保证了组织块呼吸所需的气体交换。 这种培养法需要有一个转床。用这种方法，Steward等(1964)第一次成功地将胡萝卜单细胞再生成完整植株，证明了植物细胞的全能性。 null3、继代培养（传代）：愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于养分的枯竭，水分的散失，组织代谢产物的积累，影响愈伤组织生长，因此必须将组织转移到新的培养基上。 一般在25-28℃下进行固体培养时，每隔4-5周进行一次继代培养。 null组织块较小时，继代培养时可将整块组织转移。组织块较大时，可先将组织分成几小块再接种。继代培养必须及时进行，长期不传代常常由于代谢产物的累积，对组织起毒害作用，某些植物愈伤组织的褐化现象即往往由此引起的。褐化的愈伤组织反复地进行继代培养，可使愈伤组织恢复活力而迅速生长null理论上愈伤组织是可以无限制继代，但愈伤组织继代次数增加，形态发生能力逐渐丧失。 原因：遗传因素即继代培养中通常出现 染色体紊乱。nullREASONS 遗传上表现不稳定：染色体出现多倍 体和非整倍体null四、培养条件 1、光照：愈伤组织的诱导需弱光或不需光，分化需光。继代培养一般需光。此时光对器官的作用是一种诱导反应。 2、温度：一般采用24～28℃的恒温条件进行。 3、湿度：较大，以免引起培养基干缩。 null 第三节 愈伤组织形态的发生null愈伤组织培养物在某些条件下，可以再分化产生不定芽或根的分生组织甚至是胚状体，继之，由这些有结构的组织而发育成苗或完整小植株。 一、愈伤组织通过再分化形成再生植株的方式：主要有三种(1)先产生芽，后在茎的基部长根；2)先长根，再长芽；(3)愈伤组织的不同部位分别形成根和芽。 null二、 愈伤组织器官的形成 一般愈伤组织开始分化时，由大小不等的细胞开始逐渐形成大小均匀的细胞，保持相对稳定状态。 在分化时，愈伤组织的表层和内部都可形成分生中心。芽多发生在愈伤组织的表层，属外起源。 根发生在组织的深处，与整体植株发生类似，是内起源。 愈伤组织的外部形态也随分化而改变，一般由疏松转向紧密。null三、体细胞胚的发生 愈伤组织 体细胞胚 植株null四、激素对愈伤组织分化的影响 植物生长调节物质在分化过程中的作用是极为明显的，合适的植物生长物质配比在器官分化中起着重要的作用。 如仙人掌科的金牛掌茎段培养中，当6-BA加倍时，茎段的愈伤组织可以再分化出仔球，而6-BA浓度过高(150倍)或过低(10倍)则无仔球形成。null器官分化的植物激素控制理论 大多数植物组织或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理论。 生长素与细胞分裂素的比例小时则产生苗，比例大时则生根，而两种激素的比例适中时，则产生无结构的愈伤组织。nullnull愈伤组织继代次数增加，形态发生能力逐渐丧失理论上可以无限制继代， 但形态发生是指细胞再生植株的过程nullREASONS生理生化方面的变化：如过氧化物酶活性和激素 非胚性细胞与胚性细胞竞争：遗传上表现不稳定：染色体出现多倍体和非整倍体第二节 愈伤组织的诱导与分化第二节 愈伤组织的诱导与分化愈伤组织的特征： 细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。 生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色，有光泽；也有浅绿色或绿色；而老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。Wound callus on the stem of an Erythrina tree 刺桐树Wound callus on the stem of an Erythrina tree 刺桐树Origin of callus 愈伤的起源 Origin of callus 愈伤的起源 愈伤从增殖的组织细胞中产生，激素改变细胞的新陈代谢状态，从生长静止期到代谢旺盛。nullCallus arising from leaf tissueCallus arising from vascular tissue From rootFrom embryo culturePhoto indicating where the callus (c) arises from Photo indicating where the callus (c) arises from Callus establishment – 3 stagesCallus establishment – 3 stages从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：起动期 （诱导期）、分裂期和分化期。 三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以及细胞的平均大小都有明显的差别。 大多数植物容易产生愈伤， 但许多植物趋向于细胞快速分裂nullStage 1. Induction（诱导期）: 诱导期是细胞准备分裂的时期，是愈伤组织形成起点。 外植体细胞在完整植株中随着细胞的分化过程而逐渐停止分裂，开始执行它们各自不同的功能。外植体细胞一般处于静止状态，称为静止细胞。 ※特点：在诱导期，代谢活化了，细胞内 的合成代谢迅速进行，但是细胞 的大小仍然和外植体时一样， 没有多大改变。null※ 诱导期的长短： 由一系列内部（植物的种类、生理状况）和外部（光照、外源激素）因素决定。 例如菊芋的诱导期有时还不需要1天，胡萝卜则要好几天，而菊芋块茎贮藏时间的改变，诱导期也发生改变。从11月到次年4月取菊芋块茎进行培养，则诱导期从22小时逐渐延长到40小时。null故可以从内外因两方面着手，改变诱导期长短 主要外因方面是添加一些生长物质 Steward等(1964)用2, 4-D及其类似的生长调节物质处理处于静止状态的组织，看到RNA的含量很快明显地增加。并且2、4-D积累在分裂细胞的核仁中。 Yeoman 和 Mitchell (1970) 指出了核仁是生长物质的作用部位。nullBrown（1972）认为静止细胞是具有分裂能力的，只是被存在的一类抑制物质所阻止，而使其分裂能力不能表现，如果除去抑制物质，就可恢复分裂能力。若加入抵消抑制物质影响的外源物质（激素），细胞就立即进行DNA复制，全部细胞进入S期，并发生同步分裂。Stage 2. Cell division 分裂期Stage 2. Cell division 分裂期Active cell division, cells revert to a meristematic dedifferentiated state. null分裂期：外植体(explant)中已分化的活细胞在外源激素的作用下，外植体外层细胞出现了分裂，由于外层细胞的迅速分裂使得这些细胞的体积缩小，逐渐回复到分生组织状态，因此也称为回复变化。在回复变化时，细胞通过脱分化的起动期而进入分裂，并开始形成愈伤组织。 特征：生理生化上分裂期的一个明显特征是外层细胞进行分裂，而中间的细胞不分裂。另外还有细胞数目增加，体积变小；细胞核和核仁增到最大等 Stage 3. Differentiation 分化期Stage 3. Differentiation 分化期Appearance of cellular differentiation and the expression of secondary metabolic pathways. null分化期特点：分化结构的形成过程加速，超过了回复变化。外层细胞的分裂逐渐减慢，甚至停止，为次生生长所代替，大量次生结构出现。在这时期中细胞的伸展和分裂处于平衡，故细胞的平均大小往往没有变化。 根据形态变化列出三个时期，实际上它们并不是严格的，特别是分裂期和分化期。一块培养组织的细胞既有分裂的又有分化的。五、Callus types 愈伤组织的质地和物理性状五、Callus types 愈伤组织的质地和物理性状null愈伤组织的质地和物理性状是有明显差异的 有的坚实，有的脆。脆的愈伤组织是悬浮培养生长的最合适的材料，容易使组织处于分散状态。 White(1956)用白云杉愈伤组织做材料，发现坚实的可以产生脆的变异，但无相反情形发生，用高浓度的酵母提取物能诱导豌豆愈伤组织变脆。 Blakely和Steward(1961)指出单冠毛菊脆的和坚实的愈伤组织间是可以相互转变，只要改变椰子汁和萘乙酸的量就能转变类型。 Grant和Fuller(1968)在蚕豆根的愈伤组织中，也见到有脆与坚实的两种类型并可以互变。null愈伤组织的基本解剖学： 基本解剖学特征明显差异。 菜豆，凡是脆的都有大量的分生组织中心或瘤状结构，它们被大而未分化的细胞所分开；而不脆的类型很少分化，而且大部分是高度液泡化细胞。 单冠毛菊，脆的愈伤组织由松散排列的细胞组成，坚实的愈伤组织是由堆得很紧的细胞所组成。null愈伤组织的化学成分： 蚕豆，不脆的愈伤组织有大量的组成细胞壁的多糖，以单位干重计，细胞壁的部分也多；但与果胶物质及半纤维素相比，纤维素的百分率是低的。无疑，大量的纤维素增加了细胞的硬度，而果胶含量的增加，保证了细胞紧紧地粘在一起而不易断碎。From callus to plantFrom callus to plant