无菌与带菌盐藻矿质元素含量的比较分析

第30卷，第7期 2010年7月 光谱学与光谱分析 SpectroscopyandSpectralAnalysis V01．30，No．7，ppl956—1959 July，2010 无菌与带菌盐藻矿质元素含量的比较分析 唐颖1，王长海孙，黄笛1 1．大连理工大学环境与生命学院，生命科学与工程系，辽宁大连 116024 2．烟台大学海洋学院，山东烟台264005 摘要采用火焰原子吸收光度法分别测定了对数初、中、末期无菌与带菌盐藻细胞及上清液中Mg，Fe， K，ca，Na，Mn，Zn，Cu，Ni，Cd和Cr的含量。结果明：(1)该盐藻Mg，Fe，K，Ca和Na的含量在1～10 mg·g．1之间，Zn，Cu，Mn和Ni的含量基本在0．1～lmg·g叫之间，有害金属Cd和Cr的含量极微。(2) 无菌与带菌盐藻不同时期矿质元素的变化趋势大致相同，Mg，Fe，K，Ca，Na，Mn和Cu的含量随着培养时 间的延长有所下降，ca下降的最明显；Mg，Fe，K，Ca和Na的含量在上清液中保持稳定，无明显差异，而 Cu和Mn含量在对数中后期的上清液中明显增加。(3)无菌与带菌盐藻Mg，K，Cu和Ni的含量差异不大； 带菌盐藻的Fe，Ca，Na和zn的含量在对数中期均显著下降，且低于无菌盐藻；而到对数末期又明显高于无 菌盐藻。本实验结果为进一步利用盐藻资源以及深入研究藻菌相互作用机理提供了参考。 关键词矿质元素；盐藻；原子吸收分光光度计；无菌 中图分类号：Q946．9文献标识码：A DOI：10．3964／j．issn．1000-059312010)07-1956—04 引 言 盐藻即杜氏藻(Dunaliella)，是绿藻门团藻目杜氏藻科 的一个属，包含约30个种，其中最有代表性和应用最广的是 盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)。它营养丰富，尤其富含伊胡 萝卜素，是一种在食品、医药保健和养殖业等领域中有独特 经济价值的微藻。目前关于微藻矿质元素的分析研究报道很 少口’2]，而关于无菌纯化微藻和带菌微藻矿质元素含量的比 较研究国内外尚无报道。 海洋微藻与其共栖的微生物间有非常密切的关系。藻一 菌之间相互作用的研究在赤潮、水产饵料、环境修复等方面 均有重要作用睁引，也愈来愈受到国内外学者的关注。迄今 为止，关于藻菌相互作用机理仍有很多问题有待深入研究， 而微藻与其共栖菌在矿质元素代谢方面的相互关系研究也少 有报道。本研究采用火焰原子吸收光度法测定分析了无菌纯 化与自然带菌盐藻细胞及上清液中11种矿质元素的含量， 为进一步利用盐藻资源以及深入研究藻菌相互作用机理提供 了参考。 1材料与方法 1．1藻种及其培养方法 杜氏盐藻(Dunaliellasalina)自然带菌藻种由烟台大学 海洋学院馈赠。无菌藻种即本实验室分离纯化并鉴定的无菌 藻种(大连理工大学学报，待发表)。 培养方法：培养基为∥2培养液[6]，海水经0．22tan的 微孔滤膜过滤后高压灭菌使用。于HPC,-280B光照培养箱培 养，温度范围(23士1)℃，光照(2500士500)Ix，光周期为 L12：D12，盐度3l士1，pH8～8．3。 1．2仪器和工作条件 AA320型原子吸收分光光度计和n心104型电子天平 为上海精密科学仪器有限公司产品；各元素空心阴离子灯为 上海电光器件有限公司产品。各元素波长与狭缝设置参照仪 器说明书条件设置，灯工作电流为10mA，空气流量 5．5L·rain～，乙炔流量为1．0w1．5L·rnirl之问。 1．3试剂 各元素标准储备液为光谱纯，上海市计量测试技术研究 院生产。硝酸、盐酸为优级纯。试剂溶剂用水为去离子双蒸 水。 收稿日期：2009-05-10。修订日期：2009-08—20 基金项目：国家(863)项目(2002AA224061)资助 作者简介：唐颖。女，1975年生，大连理工大学生物科学与工程系讲师e-mail：tangyin90303@163．tom *通讯联系人 e-mail：chwan92001@sina．tom 万方数据 第7期 光谱学与光谱分析 1957 1．4样品处理 实验所有器皿均提前用3％稀硝酸浸泡。5000r·minq 离心10min收集藻泥，用0．5mol·L1甲酸胺洗掉盐分后 烘干备用。称取样品0．06g，平行取3份于坩埚中，将样品 放在电炉上炭化后，移入马弗炉中，550℃，5h灰化完全， 冷却后移出，加入少许浓HN03于电炉上煮沸，直至灰分不 再溶解，冷却后，加入去离子水5mL，用定量滤纸过滤到25 mL容量瓶内，用热的l％盐酸溶液洗涤坩埚内壁和滤渣至无 Fe3+反应为止。用去离子水定容，摇匀，作为样品待测溶液。 离心收集后的藻泥上清液经过0。45pm的滤膜抽滤，得 到的上清液留做矿质元素测定。 2结果与讨论 2．1各元素标准曲线 以各元素浓度值c(弘g·mL_1)为横坐标，吸光度值A为 纵坐标绘制标准工作曲线如表1所示，可见在实验的工作浓 度范围内，11种元素均有良好的线性关系。 Table1 Mineraldements’standardcqlrveequations andcarrelatirecoeffidents 2．2实验方法的精密度 每个实验组分别取3个平行样本分别进行6次的平行测 定，结果取平均值。3个平行样本间的相对标准偏差(RSD) 小于7．81％(见表3～表5)。标准加样法测定回收率在 94．6％～103．5％之间。结果说明实验精密度良好，测定方法 可靠。 2．3无菌、带菌盐藻胞内及培养上清液中矿质元素含量的 测定 由于微藻生长初期密度过低矿质元素的含量差异不易比 较，故选取进入对数期的藻细胞作为样本(0D68z在0．405～ 0．625之间)，结果如表3～表5所示。该盐藻矿质元素含量 丰富，其中Mg，Fe，K，Ca和Na的含量基本在1～10nag ．g．1之间，而Zn，Cu，Mn和Ni的含量基本在0。1～1nag ．g叫之间。这些微量元素对人和动物都有重要的生理意义， 而该盐藻有害金属CA和Cr的含量极微，这些都说明该盐藻 有良好的饵料应用和保健功能。 从不同时期盐藻矿质元素的含量变化来看，无菌与带菌 盐藻矿质元素的变化趋势大致相同，这说明与其共栖菌相 比，盐藻对于其培养体系的矿质元素的作用占主导地位。其 中，Mg，Fe，K，Ca，Na，Mn和Cu的含量随着培养时间的 延长都有所下降，Ca下降的最为明显，由3．53～4．64mg· g叫减少至0．46t0．47mg·g～。而在去除藻细胞的上清液 中，无论有菌还是无菌，也无论什么时期，Mg，Fe，K，Ca 和Na的含鼍都基本保持稳定，无明显差异。这些元素参与 了藻多种重要的生理活动，它们含量的下降可能与藻的快速 生长增大了对这些元素的消耗有关；而在生长末期，由于藻 细胞的衰亡，其含量又略有回升。Cu和Mn的含量在对数中 后期的上清液中明显增加，可能与其向环境的释放增加有 关，其生理机制有待进一步研究。王溪森等曾报道盐藻稳定 期的一些无机元素质量浓度大于对数期[1]，这说明单位体积 下微邑元素的质量虽然有可能随着藻密度的增大而增大，但 对于单位质量下的藻细胞而言，培养体系的矿质元素供给在 对数初期最充足。 从无菌与带菌盐藻的矿质元素含量的比较来看，Mg， K，Cu和Ni的差异不大。带菌盐藻的Fe，Ca，Na和Zn含量 在对数中期均显著下降，且低于无菌盐藻；而到对数末期又 明显高于无菌盐藻。这种变化可能与共柄菌的代谢活动对矿 质元素的利用和释放有关。我们实验中发现带菌盐藻在未加 微量元素的，／2培养基中生长未受太大影响，而无菌盐藻生 长则显著减慢，林伟等研究也曾表明某些共栖菌町能会提供 盐藻生长的微量元素、类维生素等代谢物质[7]。在实验中还 发现在盐藻生长后期，菌会进入第二个生长高峰，因此可推 测生长活跃的菌代谢产生的微最元素可能是造成后期中带菌 盐藻的这些元素含量增加的主要原因。另外，早有研究表明 pH会影响藻对体系中金属离子的吸附作用[8]，所以菌的代 谢活动会改变培养体系的pH，从而问接影响微藻的矿质元 素含量。还有研究表明共栖菌会改变某些微藻对Cu的敏感 性[9]，这表明细菌也会直接影响微藻对矿质元素的应答反 应。不过，关于藻菌矿质元素代谢相互作用机理的全面深入 的研究还很欠缺。 另外，从结果还发现带菌盐藻上清液中的Cd含量在对 数中后期约为无菌盐藻的2倍，推测与菌对Cd的吸附和解 吸附等过程相关。Folgar等研究表明杜氏盐藻有很强的Cd 耐受性，但对环境中的Cd去除效果很差[1⋯。本实验中随着 藻密度的增加，Cd和Cr在上清液中的浓度略有上升，也间 接说明该盐藻似乎对Cd和Cr未有良好的去除作用。 3结束语 由于微藻对于水环境中重金属污染有独特的修复作用， 故近年来，对于藻菌和矿质元素的相关研究主要侧重于藻菌 相互作用体系对环境中一些重金属离子的去除解毒作用及其 机理的研究，而直接对无菌、带菌微藻矿质元素的比较分析 研究还未见报道。这一方面可能因为微藻无菌纯化相对繁琐 复杂，目前只有少数微藻无菌纯化研究见报道。另一方面微 藻本身矿质元素的代谢途径及功能的基础研究还不够深入。 虽有一些相关的初步研究，但也只局限于几种主要金属离 万方数据 1958 光谱学与光谱分析 第30卷 子In-is]。本研究不但为利用盐藻资源提供理论依据，还可作为深入研究藻菌相互作用机理的参考。 ’raMe2 Mineralelemenb’咖t啪协ofaxenieandnatlln柚DunaliellasaUna锄dⅡ砖irculture supernatan协intheearlyexponentiaIphase(i=l=SlO，n-----3，onm；0．405) 垂壅 蒌堕垫蔓!!竺墨：墨：!! 塑堕垫蔓!!竖：曼二!! 蒌堕垒蔓圭煎鎏!!丛：竺三=二!! 堂堕垫蔓圭煎矍!!竖：!生二：! Mg 3．31士O．0921 3．61士0．0235 5．98±0．0039 5．97土0．OlO2 5．85士0．3047 1．15士0．0413 3．53士0．2657 6．49士0．2684 0．17士0．0497 0．16±0．0125 0．25士0．0473 0．65士0．0375 极微 极微 6．42士0．2640 0．83士0．0388 4．64土0．2429 5．01士0．2792 0．07士0．0024 0．27士0．0136 0．3l士0．0309 0．58士0．0413 极微 极微 1．35士0．0877 53．49士0．1215 11．89土0．0687 19．5l士0．0987 0．30士0．1027 0．19士0．0183 0．14士0．0267 1．49士0．1215 0．15土0．0380 0．39±0．0992 1．50土0．1339 53．3l±0．1608 12．17士0．1190 19．31士0．0490 0．16士0．0236 0．25士0．0250 0．11土0．0349 1．42士0．1608 0．17士0．0014 0．32士0．0175 Table3 Mineralelements’嘲咖tsofaxenicandnaturalDunaliellasalinaand曲屺irculture supernatantsinthemiddleofex'ponentiaiphase(i士SD，n=13，oD蚍=0．575) 元素 无菌盐藻／(rag·g_1)带菌盐藻／(rag·g一1)无菌盐藻卜清液／(魑·mL．1) 带菌盐藻上清液／(pg·mI—11) Mg 1．47土0．0932 1．31土0．083 5．95士0．0033 5．99士0．0039 Fe 3．58士0．0896 3．34士0．0827 1．61士0．0163 1．70±0．0175 K 0．34±0．0274 0．36士0．0159 52．65±0．2191 53．45士0．2105 Ca Na Mn Zn Cu Ni CA Cr 0．47士0．0216 1．37士0．0122 极微 0．14±0．0109 极微 0．53士0．0325 极微 极微 0．46土0．0265 0．90士0．0213 极微 O．09士0．0173 极微 0．46±0．0175 极微 极微 11．13士0．1375 19．31土0．1433 0．68±0．0413 0．49士0．0367 0．22土0．01 1．63土0．0607 0．13土0．0101 0．60士0．0069 12．44士0．1366 19．32士0．0776 0．66士0．0143 0．24±0．0069 0．20士0．05 1．59士0．0608 0．24士0．0150 0．60士0．0349 Tabk4Mineralelemenb’c蚰咖bof锄醒皿icandnatural1)mlaliellasalinaandtl忙irculture supernatantsintheendofexponent|蚰phase(i+SD，n-----3，‰=O．625) 元素 无菌盐藻／(nag·g-1)带菌盐藻／(nag·g-1)无菌盐藻上清液／(旭·mL一1) 带菌盐藻上清液／(嵋·mL_) Mg 2．27士0．1693 3．09士0．1286 5．97士0．0184 5．98士0．0019 F色 3．77±O．1782 5．93士0．1202 1．00±0．0877 1．09士0．0865 K 1．11士0．0762 1．55土0．0154 52．93士0．1823 53．10土0．1608 Ca 0．63士0．0445 1．03士0．0436 12．33士0．2478 11．57士0．2381 Na 2．47士0．1789 4．21士0．1173 19．40士0．0546 19．50士0．0417 Mn 极微 极微0．35士0．0408 0．32士0．0236 Zn 0．21±0．0115 0．33士0．0179 0．19士0．0069 0．19士0．0302 Cu 0．03士0．0012 0．05士0．0043 0．23士0．0149 0．26土0．010 Ni 0．74士0．0305 1．02士0．0530 1．45士0．1053 1．59士0．0608 Cd 极微 极微0．12士0．0110 0．24士0．0190 Cr 极微 极微0．78士0．0375 0．54士0．0349 参 考 文 献 [1]WANGXi-鸵n，XIEXiao-long，ZHAO“(王溪森，谢小龙，赵利)．GuangdongTraceElementsScience(广东微量元素科学)，2004， 11(11)：27． [2]XINGRong-lian，WANGChang-hai，TANGNing(邢荣莲，王长海．汤宁)．SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光谱分析)， n K勖№№孙国M甜D 万方数据 第7期 光谱学与光谱分析 1959 7 8 9 10 11 12 [13] [14] [15] 2007，27(10)：2131． KimJD，KimB，Lee0G．BiologicalControl，2007，41(3)：296． LINWei，LIUXiu-yun，etal(林伟。刘秀云，等)．OceanologiaetLimnologiaSiniea(海洋与湖沼)，2001，32(1)：7． GutzeitG，LorehD．WaterSci．TechnoL，2005，52(12)：9． McLachlanJ．GrowthMedia-MarineInHandbookofPhycologicalMethods，CutureMethodsandGrowthMeasurement&ed．ByJanet RStein．Cambridge：CambridgeUniversityPress，1973．25． I』NWei，LIUXiu-yun，etal(林伟，刘秀云，等)．OeeanologiaetLimologiaSinica(海洋与湖沼)，2000，3l(6)：647． PANJin-fen，LINRong-gen，MALi．ChineseJournalofOceanologyandLimnology，2000，18(3)：260． JacquelineLLe、，y，JennyLStauber，StevenAWakelin，etaLChemosphere，2009，74(9)：1266． FolgarS，TorresE，P&ez-RamaM。etaLJoumalofHazardousMaterials，2009，165(1-3)：486． SimonFoster，DanielleThomson，WilliamMahenMarineChemistry，2008，108：172． LIUXiao-mei，GAOYun-tao，DUGang(刘晓梅，高云涛，杜刚)．EnvironmentPopulationandPrevention(环境污染与防治)，2006， 28(5)：324． LIUXiao-mei。DUANGang，GAOYun-tao(刘晓梅，段刚，高云涛)．EnvironmentalScienceandTechnology(环境科学与技术)， 2006，29(7)：47． uUPei—ran，wUWei-hua(刘沛然．武维华)．BulletinofBotany(植物学报)，1999，41(6)：617． BerestovskiiGN，KataevAA，TsyganovM八Biofizika。2006，51(6)：991． AnalysisoftheMineralElementContentsofAxenicandNatural DunaliellaSalina TANGYin91，WANGChang-hai弘，HUANGDil 1．Dept．ofBioseLandBiotechnoL，DalianUniv．ofTeehnol，Dalian116024。China 2．OceanSchoolofYantaiUniversity，Yantai264005，China AbstractThecontentsofelevenmineralelements，includingMg，Fe，K，Ca，Na，Mn，Zn，Cu，Ni，CdandCrcontentsofax- enicandnaturalDunaliellasalinaandtheirculturesupernatantsinthedifferentperiodofexponentialphaseweredetermined withflameatomicabsorptionspeetrophotometer(AAS)．Theresultsshowasfollows：(1)1rhecontentsofMg，Fe，K，Ca，and Naarebetween1and10mg·g～．Thecontentsofgn，Cu，Mn，andNialebetween0．1and1mg·g～．TherearelitthCd andCrinthemicroalgae．(2)ThechangesinthecontentofmineralelementsofaxenicandnaturalDunaliellasalinaduringdif- ferentphasesarealmostthesame．ThecontentsofMg，Fe，K，Ca，Na，MnandCudecreasedalongwiththegrowthofthemi- croalgae，especiallythecontentofCa．ThecontentsofMg，Fe，K，CaandNaintheculturesupematantskeepstableinthecul— tureprocessandhavenodistinctdifferenceamongaxenicandnaturalDunaliellasalina．ButthecontentsofCuandMninthecul— turesupematantsincreasedgreatlyinthemiddleandendofexponentialphase．(3)ThecontentsofMg，K，Cu，andNishowno significantdifferencesinaxenicandnaturalmicroalgae．ThecontentsofFe，Ca，Naandgninthenaturalmicroalgaedecreased greatlyinthemiddleofexponentialphaseandwerelessthaninaxenicone，butincreasedattheendofexponentialphaseand werehigherthaninaxenicone．The8eresultsprovidereferenceforfurthertoapplyingtheresourceofDunaliellasalinaandstu- dingtherelationshipofmicroalgaeandassociatedbacteriainthectdture． KeywordsMineral-element；Dunaliellasalina；Flameatomicabsorptionspeetrophotometer；Axenie *Correspondingauthor (ReceivedMay10，2009；acceptedAug．20，2009) 万方数据