一氧化氮供体型二氢吡啶类衍生物的合成及体外NO释放活性测定

第 39卷第 3期第 391页 2010年 6月 华中科技大学学报(医学版) Acta Med Univ Sci Technol Huazhong V01．39 NO．3 P．391 June． 2010 一 氧化氮供体型二氢吡啶类衍生物的合成 及体外 NO释放活性测定 赵朝阳 ， 何智涛 ， 焦明昆 ， 洪 亮 ， 瞿小兰 ， 张 静 ， 杨 畅 ， 丁 楠 ， 项光 亚 △ 华 中科技 大学同济医学院药学院 ，武汉 430030 湖北省 天然 药物与资源评价重点实验室 ，武汉 430030 摘要：目的 合成一氧化氮供体型二氢吡啶类衍生物，检测其体外 NO的释放能力，寻找新型抗高血压药。方法 以中间体 5一甲氧基羰基一2，6-二甲基一4一(3-硝基苯)一1，4-二氢吡啶一3一甲酸(M)为基本骨架，利用 C一3位羧基与硝酸酯和呋 咱氮氧化物结构偶联 ，合成系列 目标化合物；采用 Griess法测定 目标化合物的 NO体外释放量。结果 合成了 8个新化 合物(I a～ I f，Ⅱa～Ⅱb)，其中6个呋咱氮氧化物类衍生物在体外具有良好的 NO释放能力。结论 所有化合物的结 构均经 H—NMR确证 ，呋咱环型化合物在体外能有效 释放 NO。 关键词 ：一氧化氮 ； 二氢吡啶类衍生物 ； 钙通道阻滞剂 ； 抗 高血压药物 中图分类号 ：R9l6．691 DOI：10．3870／j．issn．1672—0741．2010．03．025 Synthesis of NO—releasing Dihydropyridine Derivatives and Determination of Their NO—releasing Activities in vitro Zhao Chaoyang，He Zhitao，Jiao M ingkun et al Pharmacy School，TongJi Medical College，Huazhong University of Science and Technology，W uhan 430030，China Abstract Objeetive To design and synthesize a series of nitric oxide releasing dihydropyridine derivatives，and to study their N0一releasing ability in vitro．Methods NO—releasing dihydropyridine derivatives were synthesized by coupling 5一(me— thoxy carbony1)一2，6 dimethyl一4一(3一nitropheny1)1，4-dihydropyridine一3一carboxylie acid (M)with furoxan or nitrate ester moie— ties through the carboxyl group of M．Results Eight new NO—releasing dihydr0pyridine derivatives were synthesized，and their NO—releasing activity was determined in vitro．Conclusion The target compounds were confirmed by H—NMR．Furoxan-type compounds can release N0 effectively in vitro． Key words nitric oxide； dihydropyridine derivatives； calcium antagonists； anti—hypertension drug 钙离子拮抗剂是一类应用非常广泛的抗高血压 药物 ，它能选择性抑制跨膜钙 内流及 细胞 内的钙释 放 ，降低细胞内游离钙浓度及其利用率 ，抑制 ATP 酶的活性 ，降低心肌收缩力 ；使平滑肌细胞松弛，血 管扩张，降低外周血管阻力，从而有效降低血压l】 ]。 临床上多选用二氢吡啶类钙离子拮抗剂作为抗高血 压首选药 ，对伴有冠心病心绞痛者尤为适宜 。 近年来，一氧化氮(NO)供体型抗高血压药物引 起了人们的广泛关注 ]，这是由于一氧化氮具有舒 张血管、降低血压、抑制血小板黏附和聚集的作用， 在维持血管张力 、调节血压及血流动力学方面起着 十分重要的作用 ]。 赵朝 阳，男 ，1984年生 ，理学硕士 ，E—mail：zcy789@126．corn 通 讯 作 者，Corresponding author，E—mail：gyxiangl968@ hotma— il．corn 本研究 以二 氢吡啶类药 物的通用 中间体 5一甲 氧基羰基一2，6一二 甲基一4一(3-硝基苯)-1，4-二氢毗啶一 3一甲酸(M)为母体 ，利用 C一3位的羧基 ，将硝酸酯和 呋咱氮氧化物结构引入，设计合成了一氧化氮供体 型选择性二氢吡啶类钙拮抗剂 ，期望得到的化合物 能在保持选择性钙离子拮抗剂降压 活性 的同时 ，通 过一氧化氮供体部分在心血管系统释放一氧化氮 ， 来增强钙拮抗剂 的降压效果 。 1 材 料与 方法 1．1 主要材料与试剂 1．1．1 试剂 二环 己基碳二酰亚胺 (DCC)和 4一N， N一二甲氨 基 吡啶 (DMAP)购 自美 国 Sigma公 司。 L一半胱氨酸、对氨基苯磺酰胺、N一(1-萘基)乙二胺二 盐酸盐购 自美国 Acros公 司。其他试剂均为国产化 · 392 · 华中科技大学学报(医学版) 2010年 6月第39卷第 3期 学纯或分析纯。 1．1．2 仪器 H—NMR采用 BrukerACF一400核磁 共振仪测定，TMS为内标，CdC1。或 DMSO为溶 剂 。 1．2 化合物合成 路线 以间硝基苯甲醛、乙酰乙酸甲酯、碳酸氢铵为原 CHO + NH4HCO NOz H3C 料，以苄基三乙基氯化铵(TEBA)为相转移催化剂， 得到中间体 2，6-二甲基一4一(间硝基苯基)一1，4一二氢 吡啶一3，5-二羧酸二 甲酯(N)。然后 ，NaOH 水解化 合物 N得二氢吡啶中间体 5一甲氧基羰基一2，6一二甲 基一4一(3-硝基苯)一1，4二氢吡啶一3一甲酸(M)。合成 路线见图 1。 CH， H COOC N 图 1 目标化合物 M 的合成路线 Fig．1 The synthesis of the target compound M 以苯硫酚为原料，经多步反应得 3，4-二苯磺酰 基一1，2，5一嗯二唑一2一氧化物(1)。将 (1)与一 系列二 醇反应得到中间体 2a～2f[ 。在二环己基碳二酰亚 HO—R +HO—R—OHNaOH ,． 0 H，C H M NO2 CO0H CH 胺 (DCC)和催化量 4一N，N一二 甲氨基吡啶 (DMAP) 作用下 ，2a~2f与中间体 M 缩合得到 工类 目标化合 物 I a～ I f，合成路线见图 2。 SO Ph ＼ P H1C。 ＼ ODcc，DMAP H]C 2a-2f 图2 目标化合物 I a～If的合成路线 Fig．2 The synthesis of the target compounds I a-- I f 将中间体 M 与 1，4一二溴丁烷连接，然后再以乙 腈为溶剂与硝酸银反应得到 1I a；将中间体 M用甲 醇钠转化为钠盐 ，该钠盐在 以 DMF为溶剂的条件 下与 ClCH CH ONO 反应得到 11 b。合成路线见 图 3。 1．3 化 合物 的合成 中间体 1和化合物 2a～2f参照文献E63方法制 备。 1．3．1 5一甲氧基羰基一2，6一二 甲基一4一(3-硝基苯)一1， 4一二氢吡啶一3一甲酸(M)的合成[ 取间硝基苯甲醛 (5．05 g，33．3 mmo1)，乙酰 乙酸 甲酯(7．8O g，66．7 retoo1)和碳酸氢铵(5．27 g，66．7 mmo1)，搅拌混合 ， N H NO 8O。C回流反应 2．5 h，冷却至室温，加水 200 mL，强 力搅拌 10 min，弃去水层。残余物真空干燥，乙醇 重结晶得到黄色晶体 N。m．P．213～215。C，收率 92．1 。 取 N(3．46 g，10．0 mmo1)，40 NaOH 溶液 9 mL(4．00 g，0．1 mo1)和氯化苄基三乙基铵(O．10 g， 0．5 mmo1)，54 mL甲醇中 7O℃反应 2 h，冷却至室 温 ，蒸去部分甲醇 ，加水 200 mL，搅拌 ，抽滤 ，滤液乙 酸乙酯洗涤 2次，6 mol／L HC1调节 pH值至 2．5， 析出固体，抽 滤 ，水 洗 ，干燥 ，得 淡黄 色粉 末 (M)， m．P．199～2o1。C，收率 64．9 ，可直接投入下一步 反应 。 √ 。 赵朝阳等．一氧化氮供体型二氢吡啶类衍生物的合成及体外 NO释放活性测定 ． 。 393 。 H COOC H，C M ． T ． ． ． ． r ． ． ． i ． ． e ．．． t ． ． h ．．． y ．．．．． 1 ．． a ． ． ． m ． ． ． ． ． ． i ． ． n — — e Br(CH2)4Br H COOC H， 3a H M—Na DMF AgNO CH CH CICH CH ONO 3b H 1I b 图 3 目标化合物II a和Ⅱb的合成路线 Fig．3 The synthesis of the target compounts 1I a andⅡb 1．3．2 目标 化合 物 工a～ I f的合 成 通 法 (以 I a为 例[6 73) 将中间体-2a(0．36 g，1 mmo1)溶于 3O mI 干燥的二氯 甲烷 中，加入数粒 DMAP，搅拌溶解后 ， 向反应混合液中加入 M(0．33 g，1 mmo1)，分次加 入 DCC(0．21 g，1 mmo1)。室温反应 ，过夜 。过滤 ， 滤液经无水硫酸镁 干燥 ，减压浓缩至干 。残渣经柱 层析[石油醚(60～90℃)一乙酸乙酯，体积比4：1] 纯化(以下 柱层析 同此 )，得到 黄色 固体 I a，收率 55．3 。 I b：产物经柱层析纯化得黄色油状物 ，收 率 42．0 。 工C：产物经柱层析纯化得黄色油状物 ， 收率 47．6 。 工d：产物经柱层析纯化得黄 色油状 物 ，收率 41．4 。 工e：产物经柱层析纯化得黄色油 状物，收率 59．2 。 I f：产 物经柱层析纯化得黄色 油状物 ，收率 64．8 。 1．3．3 目标化 合物 1／a的合 成l6棚 将 化合物 M (O．33 g，1 mmo1)，溶 于无水丙 酮 25 mL中，加入 1，4一二溴 丁烷 (0．5 mI ，4 mmo1)，三 乙胺 1 mL， 56℃搅拌 回流反应 14 h，反应液浓缩 ，柱层析得黄 色油状物 3a，收率 81．7 。 化合物 3a(0．23 g，0．5 mmo1)，溶于无水乙腈 10 mI 中，加入硝酸银(0．17 g，1 mmo1)，避光反应 48 h，过 滤，浓 缩，柱层析 得黄 色油状 物 1I a，收率 57．3 。 1．3．4 目标化合物 11 b的合成[9 在三 口瓶中加 入浓硫酸 (14．1 g，0．144 mo1)和发烟硝 酸(9．1 g， H I1 a 2)40NO2 0．144 mo1)，冰浴条件下搅拌使酸混合均匀 ，缓慢滴 加 2一氯乙醇(10 g，0．12 too1)，1 h后滴加完毕 ，继续 反应 。2 h后 ，用 分液漏斗将混合物 中的有机层分 出，有机层用饱和碳酸钠溶液洗涤 ，乙醚萃取后用饱 和食盐水洗涤，蒸馏水洗涤。无水硫酸镁干燥 ，减压 蒸馏得无色透明液体 3b(9．36 g，收率 62．4 )。 将 5一甲氧基羰基一2，6一二 甲基一4一(3-硝基苯 )一1， 4～二氢吡啶一3一甲酸钠(M)一Na(0．71 g，2 mmo1)溶于 2O mI 无 水 DMF中，加 入无水 碳 酸钾 (0．55 g，4 mmo1)，C1CH2CH2oNO2(1．25 g，10 mmo1)以及 少 量 KI。加热至 100。C，搅拌反应过夜。冷却后，将 反应液倾入水 中，用 乙酸 乙酯萃取 (50 mL×3)，有 机层用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩 至干得 粗产 品，经 柱层析 得黄色 油状物 11 b，收率 37．1 。 1．4 NO体外释放试 验 参照文献[6—7]的方法进行。将被测化合物配 成 2．5 mmol／L的 DMSO溶液 ，取 1 mL分别用含 有 3．4 mmol／L的 L一半胱氨 酸或不含有 L一半胱氨 酸的 PBS溶液稀释至 100 mL，被测化合 物的终浓 度为 0．025 mmol／L。将该溶液 于 37℃下孵育后 ， 各个时间点分别取 出 8 mI 和 2 mI Griess试剂r4 g对氨基苯磺酰胺 、0．2 g N一(1-萘基)乙二胺二盐酸 盐 、10 mL质量分数 为 85 的磷 酸，用蒸馏水定容 至 100 mL]混合 ，于室温放置 10 min，在 540 nm处 S N C C ( C 【 } 脱 rL C } · 394 · 华中科技大学学报(医学版) 2010年 6月第 39卷第 3期 测定吸光度 。 2 结果 化合物的 H—NMR数据见表 1。 2．2 NO体外释放实验结果 2．1 目标化合物结构表征 目标化合物体外 NO释放能力实验结果见表 所合成的所有化合物均经 H—NMR证实。各 2。 表1 化合物 H NMR数据 Table 1 The H—NMR data of compounds Compounds H NMR(400 MHz．CDCla for all compounds except DMSO for M) N M I a I b I e I d I e 工f II a II b 2．38(s，6H，C2，6-CHs)，3．66(s，6H ，C2，6一CooCH 3)，5．12(s，1H，C4一H)，7．27(brs，1H ，NH)，7．35—8．13(m，4H，Ar_H) 2．29(s，6H，C2．6一CHs)，3．54(s，3H，COOCH3)，4．99(s，1H ，C4 H)，7．49—8．O4(m ，4H，Ar—H)，8．94(brs，1H ，NH)，11．85(s， 1H，C00H)。 2．39(s，6H，C2，6一CHs)，3．64(s，3H，COOCHs)，4．08— 4．22(t，2H，COOCH 2)，1．99— 2．11(m，2H，CooCH2CH2)，1．85— 1．97(m，2H，C0OCH2CHzCH2)，4．35—4．48(t，2H，C0OCH2CH2CH2CH2)，5．12(s，1H ，C 一H)，5．9O(brs，1H ，NH)，7．34— 8．12(m，4H，Ar—H) 2．38(s，6H，C2．6一CHa)，3．63(s，3H ，COOCH 3)，4．29 4．37(d，2H，COOCH2)，5．81— 5．89(m，2H，CO()CH2CH —CH)，4．68 4．73(m，2H，COOCH2CH—CHCH 2)，5．1O(s，1H，C4一H)，5．O1(brs，1H ，NH)，7．54—7．98(m，4H ，Ar—H) 2．37(s，6H，C2．6一CH a)，3．64(s，3H ，COOCH a)，4．22—4．34(s，2H，COOCH2)，5．13— 5．21(s，2H，COOCH2C三 CCH 2)，5．O9 (s，lH ，C4一H)，5．9l(brs，1H，NH)，7．31 8．1 2(m，4H，Ar—H) 2．37(8，6H，C2．6一CH 3)，3．66(s，3H，COOCH a)，4．1 9— 4．31(t，2H，COOCH2)，2．15— 2．24(m，2H，COOCH2CH2)，4．33— 4．38(t，2H，COOCH2CH2CH2)，5．09(s，1H，C4 H)，5．80(brs，1H，NH)，7．36—8．12(Ill，4H ，Ar H) 2．38(s，6H，C2．6一CH3)，3．65(s，3H，COOCH 3)，4．44— 4．53(t，2H ，COOCH2)，4．56— 4．62(t，2H，COOCH2CH2)，5．13(s， 1H ，C4一H)，5．85(brs，1H，NH)，7．37 8．16(m，4H．Ar H) 2．39(s，6H ，C2．6一CH3)，3．66(s，3H，COOCH 3)，4．58(s，2H，COOCH2)，5．17(s，1H，C4一H)，6．13(brs，1H ，NH)，6．54— 8．18 (m，4H ，ArH) 2．65(s，6H ，C2．6一CH3)，3．59(s，3H ，COOCH 3)，3．97— 4．O5(t，2H，COOCH2)，1．22— 1．31(m ，2H ，COOCH 2CH2)，1．48一 1．59(m，2H ，C00CH2CH2CH2)，4．32—4。39(t，2H ，C00CH2CH2CH2CHz)，5．36(s，1H，C4 H)，7．26(hrs，1H，NH)，7．59— 8．31(m，4H，Ar—H) 2．65(s，6H，C2．6一CH3)，3．69(s，3H ，COOCH 3)，3．45— 3．53(t，2H，C()0CHz)，4．31— 4．37(t，2H，COOCHzCH2)，5．41(s， 1H，C4一H)，7．08(brs，1H ，NH)，7．51—8．31(m，4H ，Ar—H) 表 2 目标化合物的 NO体外释放情况 ( ，mol／mo1) Table 2 NO releasing in vitro of targeting compounds( ，mol／mo1) Compounds No releasing percent W ithout L—cysteine W ith L—cysteine 3 讨论 近年来，一氧化氮(NO)供体型抗高血压药物引 起了人们的广泛关注，其中又以二氢吡啶类钙拮抗 剂最受重视。 本研究以二氢 吡啶类药物 的通用 中间体 5一甲 氧基羰基一2，6-二 甲基一4一(3-硝基苯)一1，4一二氢吡啶一 3一甲酸(M)为母体 ，利用 C一3位的羧基 ，将硝酸酯和 呋咱氮氧化物结构引入，得到了一氧化氮供体型选 择性二氢吡啶类钙拮抗剂。合成了 8个二氢吡啶类 衍生化合物 工a～工f，Ⅱa～Ⅱb；8个目标化合物均 为新化合物，未见文献报道。所有化合物的结构均 经 H—NMR确证。 为了检测所合成化合物释放 NO的能力，采用 体外法检测 了它们 的 NO释放活性。结果显示 ，呋 咱环型化合物在半胱氨酸存在的条件下均具有很好 的 NO释放活性，而在半胱氨酸不存在的条件下则 不能释放出 NO。这一结果与文献[7，9]报道的有 关呋咱环释放 NO结果一致，但 NO释放能力似乎 与连接键的长短与类型无关。而无论有无半胱氨酸 赵朝 阳等．一氧化氮供体型二氢吡啶类衍生物 的合成及体外 NO释放活性测定 · 395 · 存在 ，硝酸酯型化合物在体外均不能释放 NO，与文 献[7，9]报道也一致。 有关这些化合物的 NO体 内释放活性及其抗高 血压活性尚有待进一步研究 。 [1] 1223 [3] 参 考 文 献 王丽，陈国华．盐酸巴尼地平的合成[j]．化工时刊，2007，21 (6)：206—208． M iri R，M cEwen C A ，Knaus E E．Synthesis and calcium ch— annel modulating effects of modified Hantzsch nitrooxva1kv1 1，4-dihydro 2．6-dimethyl一3一nitro 4一(pyridinyl or 2-triflu oromethylpheny1)一5-pyridine—carh0xylates[J]．Drug Dev Res， 2000，51(4)：225-232． Chrissobolis S，Ziogas J，Anderson C R，et a1．Neuronal NO mediates cerebrai vasodilator responses to K。。in hypertensive ratsEJ]．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，282(5)：1724— 1 731． [4] [5] [6] [7] [8] [9] Stilo A D，Visentin S，Cena C，et a1．New 1，4 dihydropyridines conjugated to furoxanyl moiety，endowed with nitric oxide— like and calcium channel antagonist vasodilator activitiesl J．J M ed Chem，1998，41(27)：5393-5401． M aree A D，Cox D．Thrombosis and nitric oxide donor drugs r门．Thromb 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