/ ,『7
(生物
进 晨 '1994.w .14.No, 1
鲡
白细胞介素一2的结构与功能
77 )
. 型塑望 釜篓 蒋春雷’王志勇郑仲承 f 7 -————一._ 一, I、,,, /
(中国科学院上海生物化学研究所)
白细胞介素一2(IL一2)由激活的T细胞产
生,是作用于淋巴细胞和免疫效应细胞的重要
免疫因子,能提高免疫系统中多种免疫细胞的
功能,如提高它们杀伤癌细胞、病毒或细菌感染
细胞的能力。IL一2分泌水平的高低与多种疾病
有密切关系。随着人基因工程 IL一2(rlL一2)的问
世,IL一2的生物学与应用研究得到了更快的发
展。
目前对 IL一2的分子结构、结构与功能的关
系以及 tL一2的生物功能都有了比较全面和深
人的了解 ,关于 IL一2结构功能的研究多数采用
蛋白质工程的
,即用定点突变其基因,导致
蛋白质 氨基酸的改变.然后研究突变蛋 白质的
生物功能,国外有关 IL一2结构和功能研究的状
况列于表 1,在这方面我们做了大量工作,取得
许多新进展。
一 、关于IL-2的分子结构及其a螺旋组成
的新观点
人 IL-2由 133个氨基酿组成,分子量为
15~20道尔顿,分子 中有三 个半 胱氨酸残基
(Cys),分 别位于 IL-2中的第 58、lO5和 125
位。IL一2的二级结构主要由a螺旋组成。1989
年Brandhuber等用X-ray衍射方法,证明IL一2
由A、B、C、D、E、F等六个 a螺旋所组成,无p
折叠[1]。1992年,Mort等用核磁共振(NMR)
方法研究 了IL一2的二级结构[2],发现 IL一2分
子中只有 4个a螺旋区,另外还有一对 p反平
行折叠(图 la,Ib)IL一2分子中各螺旋相互折
叠,形成球状蛋白分子[2]。1991—1992年我们
用蛋白质工程方法也证明X—ray衍射所得六
· 蒋春冒为上海第二军医大学博士生
圈 l| x一衍射结果 6十 t 旋无 月折叠
圈 1b 棱磁共振(NMR)结果 4个 a螺旋 1十 折叠
个a螺旋的结论是错误的E33,而得出与 Mott
相似的观点
过去根据IL-2晶体结构x线衍射图谱的
结果,IL一2的六个 口螺旋区段如下:AI 11
一 l9,B}33—56(中间被 ~~rpro折断,分成B(33
l3 一
维普资讯 http://www.cqvip.com
一 46)及 B’(48—56)两个 q螺旋),C;66—78,
D;83—101,E;107—113.F;117—1 33,而核磁
共振(NMR)确定 IL一2的四个a螺旋,分别为
甲、1l一29.乙 、53—73,丙 、81—97,丁 、11 6—
131。(注:NMR原文的四个 q螺旋也叫 A、B、
C、 但在此文中为了区别 x一衍射的A、B、C、
D,故叫甲、乙、丙、丁)。两者比较后,主要差别
之一是 x衍射所得的 n螺旋 B(氨基酸 3l一
46)实际上不存在。我们在研究 IL一2的二级结
构时,将39Met、43Lys分别突变为Pro,破坏此
区域的 n螺旋,但所得突变体的总a螺旋度并
无明显变化,其生物活性也无明显改变E33。我
们过去研究 IL一2的 a螺旋结构 的结果,说明 n
螺旋的破坏对其生物活性必定有影响(见后),
因此上述实验结果说明 x—ray衍射所测定的
a螺旋(B)本来就是不存在 的E33。此结果与
NMR所得结论一致。 .
二、IL 2中n螺旋对生物活性的重要性
IL一2结构中含有 49—65 的 n螺旋,为了
解 n螺旋对其活性的影响,我们分别在n螺旋
(甲)(11—29),a螺旋(乙)(53—73)中引人 Pro
以破坏其螺旋结构 ,然后观察相应的功能变化。
如将 a螺旋 B中的 15Glu突变为 Pro后 ,由于
a螺旋的稳定性遭破坏,故 IL:2的洁性降到天
然的20 ,而如果将 15Glu突变为Lys,虽然氨
基酸由酸性变为碱性,但未破坏a螺旋,故突变
体的活性与天然一致,这表明a螺旋(甲)的稳
定性对其生物活性有一定的影响[7]。将n螺旋
(乙)中的53位 Leu突变为Pro,对其生物活性
的影响也比突变为 Asn的影响更为明显,这表
明 n螺旋乙的完整性对 IL一2的生物活性也是
很重要的[7]。
IL一2分子的 n螺旋(丁),对 IL一2生物学活
性的发挥尤为重要,这可从下列两方面进行说
明。将 125Cys突变为 Set或 Ala(不破 坏 n螺
旋),IL一2的活性有所升高,稳定性也更高。但
将其突变为 Pro(破坏其 a螺旋),活性财急骤
下降,由此可见 n螺旋(丁)区域的螺旋结构对
IL 2活性非常重要,下面分别加以详述。
以 往 的 研 究 证 明 IL一2分 子 中 58和
一 14 —
105Cys之间形成二硫键,它对维持 IL一2的生
物功能非常重要,将任何一个 Cys突变,都造
成 IL一2活性的严重下降[4],而第 125位 Cys
是游离的,它有可能引起一s—s键的错配而导
致活性下降,为此我们将此 125Cys分别突变
为 s 或 Ala,发现突变 IL一2的活性以及热稳
定性均有提高[5,63,~25Ala--IL 2尤其如此,
我们推测,可能的原因有:1、125Cys突变后使
IL一2分子复性过程中不会发生二硫键的错配,
同时也不易形成多聚体,2、Ala极性小,故疏水
性大于 s,而 125Cys位于 IL一2分子的a螺
旋 (丁)的疏水 面,125Ala的 引人,使 q螺旋
(丁)与其它螺旋 间的相互作用更加稳 固,因此
使分子的稳定性增强。
将 125Cys改为 Set或 Ala后,IL:2的活性
及稳定性均有增加,与此相反,如果将 125Cys
改为Pro以破坏其螺旋,则活性太大下降(相当
于天然 IL一2活性的 7 )如果将 127Set改为
Pro以破坏此a螺旋,活性也要大大下降(为天
然IL一2的4.5 ),若将 125Cys和 127Set同时
突变为 Pro,进一步破坏a螺旋,结果突变体的
活性还要进一步下降,只有天然活性的 1-2
对这些突变体的二级结构分析发现,它们的二
级结构均有显著变化。因此a螺旋破坏越大,活
性下降越明显。对照 t25Cys变成 Set或 Ala与
Pro的巨大活性差异,突出地说明n螺旋对其
活性的重要性,这说明 螺旋(丁)的稳定性对
IL一2的活性确有重大影响,此外 螺旋的破坏
可能还会影响IL 2的三维结构,IL一;中只有一
个 Trp,它在分子内韵微环境可用荧光进行检
测。对这些突变体 的荧光检测结 果显示,
121Trp的微环境均因上述 Pro突变后而 由疏
水性向亲水性转变,说明三维结构发生了明显
的变化,其变化程度与 t螺旋的破坏程度以及
突变残基与 121Trp的距离均成正比例关系。
这说明a螺旋破坏后,周围残基的微环境以及
空间位置也发生 了变化,可能打乱了a螺旋
(3-)中残基的两亲性分布。根据以上两点我们
认为a螺旋(丁)尤其是其疏水面的完整性,是
维持IL一2活性的重要因素E83。
维普资讯 http://www.cqvip.com
三、2o位残基等在IL一2结梅功能中的重要性
IL一2分子 Ct螺旋(甲)中20Asp对其生物
活性的发挥起很重要作用。将此残基突变后,
IL一2与IL一2受体 p亚基(1I 一2R[3)的亲合力显
著下降,突变体因不同残基变化而使生物活性
下降的程度不同[9]。我们将 20Asp突变为
Asn、活性下降 10倍 ,说明 Asp的酸性基团对
其生物活性是重要的。将 Asp改为 Lys活性还
要继续下降 1O倍(即总共下降了100倍) 说明
2o位氨基酸的酸性基团对活性很重要,而碱性
基 团则起相反作用。但如果将 20Asp改变为
Arg时,括性还要继续下降 3000倍,即活性几
乎全部丧失 ,Arg虽 比Lys碱性略大,但造成活
性 3000倍的差异,是不能单纯用碱性不同来解
释的,可能还与侧链基团有关。事实上如果将
20Asp改为 20Leu,所得产物 的活性与 2OArg
相似,Leu并非碱性氨基酸,因此只能用侧链基
团较长,疏水性较大来解释。上述结果说明IL-
2与其受体结合需要酸性基团(Asp),而较长的
疏水侧链基圃则妨碍这种结合,使其括性降低,
甚至完全丧失[10]。
1 7Leu也是对 IL一2活性有重要贡献的残
基 ,如将它突变为 Asp,虽然 IL一2的空间结构
无变化,但活性下降至天然 IL一2的 0.1 ,这
说明1 7Leu可能也与IL-2受体的结合以及活
性的发挥有关[11]。由于 1 7Leu与 20Asp均为
与活性有密切联系的残基,而且二者空间位置
很 近,我 们将 二 者 位 置 对 调,即将 17Leu,
20Asp突变为 1 7Asp,20Leu,结果突变体的活
性几乎完全丧失[11]。这表明20Asp与p亚基
结合时,其空间位置不能有任何改变,稍有偏差
就不能结合 ,除 20Asp外,1 7Leu也 必须位于
其特定位置才能发挥生物学作用。
我们还对不同种属来 源 IL一2分子 中的保
守部份与活性的关系进行 了研究,将 21Leu、
62G1u、1 26Gln这三个保守残基进行突变,如
21Leu÷ Thr、G2Glu— Leu、62Glu÷ Arg、
12GGln--~Asp,结果所得突变体的活性分别降
为 0、5 、0.3 ,说明这些保守残基对维持 IL一
2的活性也是至关重要的[12]
四、IL一2的镇痛作用与结构关系
IL一2是重要的免疫调节因子,近来徐获、
蒋春雷与周禧和、赵志奇发现IL一2还有镇痛作
用,我们向大鼠侧脑室注射 II 一2,然后测定不
同时间大鼠痛阈的变化 ,发现 IL一2能显著提高
大鼠的痛阈(即具有镇痛作用),这种作用能被
抗 IL一2抗体所阻断,说明为I'L-2特异性作用
所致。IL一2的镇痛作用也能被纳洛酮所拮抗,
这表明IL一2的镇痛作用途径可能与阿片受体
有关[13]。而纳洛酮对 IL一2的免疫功能无影
响,说明 IL一2发挥镇痛与免疫功能的途径可能
是不同的[14]。
为了研究 IL一2发挥镇痛作用的结构域与
发挥免疫活性的结构域是否一致,我们用无免
疫活性的IL-2突变体 20Leu—IL-2注射大 鼠
侧脑室 ,发现它对 痛阈的作用与天然 IL一2一
致,这也说明 IL一2免疫的功能与镇痛作用功能
存在于 IL一2分子 中两个不同的功能 区域(Do—
main)[14],上述结果均未见诸文献报导,这是
我们对 IL一2结构功能研究的一个重要结果
五、IL一2的功能与应用前景
1.IL-2的抗结核杆菌等作用
IL一2已广泛应用于多种肿瘤的治疗,同时
对免疫功能低下的疾病如肿瘤、肝炎等均有显
著疗效。近来庄玉辉与我们发现IL一2还有抗结
核杆菌的作用,抑制率可达 9o 以上[15]。Ka—
plan等用低剂量的IL-2皮下注射8—10天,能
使病人以及实验动物体内的麻风杆菌大大减
少,甚至转阴[16]。上述事实说 明IL一2将有很
大的临床应用前景。
2.IL一2基因治疗
多种肿瘤以及细菌、病毒感染等疾病都伴
有 IL-2水平低下,补充 IL一2,纠正体内免疫水
平,对治疗这些疾病均有重要作用。我们用逆转
录病毒载体插入IL一2基因,再转化肝癌细胞株
HAC,从面使之能持续分泌 IL一2。
将此IL一2基因转化了的HAc去接种大鼠
腹腔或皮下,结果使动物生存期延长,瘤体积缩
小,这些实验结果,说明IL一2的基因治疗在动
物模型实验中取得了明显的效果[1 7]。
一 】5 ~
维普资讯 http://www.cqvip.com
3.rIL一2的修饰
rIL一2半衰期短,临床需大剂量使用,故毒
副反应大 ,同时基 因工程方法生产 的rIL一2不
含糖,水溶性小,抗原性大(即容易产生抗体),
用PEG修饰rIL一2后,则可大大延长rIL一2的
半衰期,降低其抗原性[18]。我们实验室用
PEG修饰 IL一2所得产物也是如此,它对实验
动物肿瘤的疗效大大高于天然rIL-2[19],可使
肿瘤缩小,转移率低,荷瘤动物生存期延长,可
能具有很高的应用价值。
4.rIL一2毒素融合蛋白
由于许多疾病的IL一2受体表达超出正常
范围,因此 rIL-2毒素能选择性地杀灭 IL一2受
体高表达的细胞,而不影响其它淋巴细胞,是治
疗这些疾病的 良好手段。用基 因工程方法将
rIL-2基因与细菌毒素基因的功能区融合,表
达出rIL-2毒素,如rIL-2与白喉毒素或绿脓杆
菌外毒素融合的免疫毒素,它们在体外实验中
能抑制细胞的蛋白质合成,对表达 IL一2R的
细胞有强烈杀伤作用,而对 IL一2R阴性细胞则
无影响[2O一23],动物实验表明它能防止迟发
型过敏反应的发生[24],延长心脏移植鼠的存
活时间[z5,26]。对AIDS病毒感染的细胞有特
异性的杀伤作用[27] 我们实验室将绿脓杆菌
外毒素基因与 IL-2基因连接起来 ,在大肠杆菌
中表达,产物能杀伤 IL一2R阳性细胞,而且其
杀伤作用能被抗IL一2抗体等所阻断,说明其杀
伤作用,由IL一2的导向所致[28]。
六、IL一2受体的研究
IL一2通过与专一的IL一2受体结合而发挥
生物学作用。IL一2受体IL-2R含三个亚基即 、
p和 29,303,编码这三个亚基的基因巳被克
隆鉴定。p、 亚基为信号传递所必须,而n亚基
则参与高亲台受体的形成。
除了在激活的淋 巴细胞表 面上 IL一2R各
种亚基的表达有提高外,某些淋巴瘤,自身免疫
病以及器官移植等病人或动物模型中,IL-2受
体的表达均大大超出正常范围,而且血清中可
溶性 a受体的含量也显著提高[31--33]。因此
检测和控制IL-2R的水平,对临床一系列疾病
— — ’6 ——
的诊断和治疗有重要 的意义。,我们已有 IL一2R
的a,口和 亚基的基因,并表达了其可溶性成
份,将有潜在的应用价值。
总之 IL一2是一种结构复杂,功能广泛,有
较好临床应用前景的细胞因子,对 IL一2分子结
构与功能关系的了解有助于阐明其作用的分子
机制,有 目的地改造 IL一2分子结构,有可能研
制出多种用途或高效的新型IL一2。
IL一2的镇痛功能的发现,IL一2分子镇痛作
用以及其结构与功能的阐明提示 IL-2在机体
的神经、免疫系统的调节作用中有不可低估的
地位,也为免疫学和神经生物学者开辟了一个
新的研究领域。
重组 IL一2类似馏的生物活性
与受体结合事( )
部位 突变 活性( )— —
P55,P75 P55 P75
3EArr Ah 50— 10O 5--17 < O.o5 5O一 1。0
* u· P∞ 5.6
维普资讯 http://www.cqvip.com
B—helix * u Pro 30
6aLeu Asn 0.4— 1 2
6.唐建伟,中国 学 已投蔷
7.壬志勇等.待发表工作
8.镣获等,生暂工程学报,1993,9(4) 298
9.Zurawsk1.S M .and Zursw出 ,G.EMBO J.1989.8(9)
2583
第四届泛太平洋生物技术学术会议将于1995年2月9--9
H在澳太利亚墨尔率召开 。本次会议与第十二届奥戈种亚生物
技术学术舍议联音举办,将与在维多利亚的洛恩举行的蛋 白质
结构和分子生物学专业舍议先后进行。
泛盘平洋生物技术学术舍议已分捌在新加坡.芙国和台湾
举办三届。会议的宗旨是建立区硫音作罔络.促进更有救的音
作.提供展示有关生暂技术的技术与商业机舍的论坛·为本地
区和其他地区的^们造福.
第四届泛太平洋生物技术学木舍议为企业,研究机构、政
府和学术界提供了一十展示生物技木进晨、产品.服务与机强
的良机,分享在促进令^激动的新技术应用中克服困难的经
验。
本次会议的顾问羹员舍汇集了国际著名的生物学塞,尤其
是处于各 自研究领域前沿的科学家。在他们的帮助下精心制定
了夸人 奋的会议技术程序.舍议学术活动还将包括举办相 当
规模的商品晨诮会,提供展示、
和咨诲各种产品、服务的良
好机会,进将有利于正在成为经济巨^的本地区的发晨.会议
还将组 筝l杜舍话动 ,包括 在国立芙木馆太厅举行 的正餐招 待
舍,为促进长久的学术联系提供较轻梧的环境.
会议将探讨和晨望来自泛太平洋各国的生暂技术各领域
的研究、前商品化开发和商业发展的最新进展和重大突破.台
议包括主
报告和墙报,具体分组如下
· 泛太平洋地区生物技术的发展和创始
· 自热赍嚣利用
· 农业和食品生物技术
· j辱洋生物技术,TX产养殖
· 植物生物技术,生暂杀虫荆
· 保健,生暂药品和疫苗
· 细胞生物学,微生物生理学,生物多样性
· 遗传工程,基因转移,蛋白表选
· 基匿组结构 ,DNA顺序
· 环境生物技术和生物再生
·工艺进晨和量优化
· 发酵和细胞培养,后处理 ·分析生物技术 ,新仪器
· 商品化经验和机遇
· 珐规事务和理性问题
· 经济,市场和国家政策
- 风险评竹.安垒性 ,牡舍意识
- 教育,技术转让
会议征集任何有关 生物技术锈域尤其是上述各 方面的论
文摘要.希望参加的人应填写舍议顶通知上的联系表,寄往大
会秘书组索取详细赍料和注册表.中国生暂工程学舍巳将舍设
顶通知寄国内有关研究^员和研究单位,希参加的同志请尽快
向各 自单位查诲,如来收到可与中匿生物工程学舍办公室联
系.会议接收论文捷蔓的截止期为 1994年 8月 31 H,注册截
止期为 1994年 l0月 31 H.
舍议接收的论文将集册出版。接收论文曲簪件是至少有一
名作者注册并爿会.舍议以英文为正式用语.
中国生物工程学会办公富联系地址为
100080 北京中关村
中国科学院文献情报中心
中国生物工程学会办公室
电话:255.~167
中国科学晓应用研究与发展局
中国生暂工程学舍
一 九九四年一月
维普资讯 http://www.cqvip.com