免疫荧光技术

免疫荧光技术 一、原理 荧光免疫分析技术是一种以荧光物作为标记物的免疫分析技术，荧光物质的分子在特定条件下吸收激发光的能量后，分子呈激发态而极不稳定，其迅速回到基态时，可以电磁辐射形形式释放出所有的光能，发射出波长较照射光长的荧光。 荧光抗体技术 利用某些荧光素通过化学方方法与特异性抗体结合制成荧光抗体，使其仍保持原抗体的免疫活性，然后使荧光抗体与被检抗原发生特异性结合，形成的免疫复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此借助荧光显微镜检测或定位被检抗原。根据所用的方法可分为直接荧光抗体法、间接荧光抗体法和补体荧光抗体法。 二、荧光抗体的制备 (一)荧光素 荧光素是指一个分子或原子吸收了给予的能量后即可引起发光，停止能量供给，发光也瞬时停止。可以产生明亮荧光的染色物质，称荧光素。目前常用的荧光素有以下3种： 1．异硫氰酸荧光素(FITC) 易溶于水和乙醇。最大吸收光谱为490—495nm，最大发射光谱为520一530nm，呈黄绿色荧光，分子量389．4。在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰氨化而形成硫碳氨基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个IgG分子上最多能标记15—20个FITC分子。 2．四乙基罗丹明(RB200) 不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为595—600nm，呈明亮橙色荧光，分子量580。RB200在五氯化磷(PCI5)作用下转变成磺酰氯(SO2Cl)，在碱性条件下易与蛋白质的赖氨酸e—氨基反应而标记在蛋白分子上。 3．四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC) 最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光。与蛋白质结合方式同FITC。 目前使用最广泛的荧光素仍为FITC，其主要优点是：①人眼对黄绿色较橙红色更为敏感；②一般切片等标本中绿色的自发荧光少于红色的。 (二)FITC标记抗体法 1．材料和试剂 抗血清，FITC，硫酸铵，DEAE—纤维素，sephadex G—50，琼脂糖，透析袋，层析柱，电磁搅拌器；o．olm01／L pH 7．1磷酸盐缓冲液(PBS)，o．5m01/L pH 9．5碳酸盐缓冲液；O．025m01/L pH 9．o磷酸盐缓冲液。 2．抗体的纯化 ：一般提取抗血清中的丙种球蛋白或IgG组分，而无需纯化其特异性抗体部分，通常以盐析法提取丙种球蛋白，必要时也可作DEAE纤维素柱层析，提取物中不应混有白蛋白及其他阴电荷强的蛋白组分，否则经标记后易与标本发生非特异性吸附，而导致非特异性荧光的产生。 3．FITC标记IgG (1)直接标记法(也称热标法)： ①抗体溶液的制备：以o．01m01/L PH 7．1PBS将蛋白浓度调至20mg／m1于称量瓶中； ②荧光素的称取：根据欲标记的蛋白质总量，按每mg蛋白加0．0lmg荧光素称取适量的荧光素，溶解于相当蛋白溶液1／10体积的0．5m01/L pH，9．5碳酸盐溶液中； ③标记：边搅拌边将FITC缓慢加入IgG溶液中，注意避免将荧光素粘于容器壁及搅拌棒上，室温，磁力搅拌4h。应尽量避免产生泡沫，在密闭条件下进行； ④透析：标记后的球蛋白溶液离心20min(2500r／min)，去除其中少量沉淀物，上清于lo一50倍体积的pH 8．0PBS中透析2—4h； ⑤标记IgG的纯化：Sephadex G—50凝胶过滤去除游离FITC.洗脱第1峰为结合蛋白峰，第2峰为荧光素峰。过滤后蛋白约稀释1倍。 DEAE—纤维素柱层析可去除标记不适当的蛋白。由于未结合色素的抗体所带阴电荷较少，故进行分步洗脱时，其最先洗出，随后是荧光标记合适的抗体部分，而过量结合色素的抗体由于所带阴电荷较多，最后洗出。将DEAE纤维素用o．olm01儿pH 7．6的PB平衡后装柱，加入适量的标记抗体溶液，分步洗脱，每5min收集l管(3—5m1)，开始洗下的为淡绿色液体，渐至洗脱液为无色，这部分常为标记低或未标记的抗体，可弃去。继而分别用含0．01、0．05及0．14m01/LNaCl的0．01m01/LpH 7．6的PBS依次洗脱，这部分各有标记抗体洗脱峰，可分别测定各管的F／P值，取其中F／P值在1—4的各管合并，一般这3部分均为荧光素标记合适的抗体部分。合并后用聚乙二醇(PEG，MW 20000)浓缩至蛋白量为5mg／m1，4000r／min离心30min，上清分装后保存。 (2)间接标记法(也称半透膜渗析低温标记法)： ①抗体溶液的制备：用0．025m01／L pH 9．5的碳酸盐缓冲液将免疫球蛋白稀释至10mg／m1，装入透析袋中； ②荧光素的称取：称取相当蛋白量1／20的FITC，溶于l0倍于蛋白溶液量的0．025m01/LpH 9．5碳酸盐缓冲液中； ③标记：将透析袋浸泡于FITC溶液中，于4℃磁力搅拌标记l 6—18h； ④标记IgG的纯化：同直接法。 4．FITc标记IgG的鉴定(以兔或羊抗人IgG荧光血清为例) (1)抗体含量：一般以琼脂双相扩散法进行滴定，效价在1：16—1：32者较为理想。 据统计，一个染色单位约相当于o．25mg标记抗体蛋白，对标记抗体溶液不低于4个单位或抗体蛋白量1mg／mI以上，最好在16单位。 (2)荧光素和蛋白质结合比例(F／P)： 一般多用紫外分光光度计进行检测和换算。将制备的荧光抗体作适当稀释(使其OD280。接近1．o)，先在495nm下读取OD值(为FITC的特异吸收峰)，再于280nm下读取OD值(为蛋白质的特异吸收峰)。然后按下列公式计算F／P值：F／P＝2．87×OD495／(OD280一o．35×OD495)。F／P值越高，表明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。用于一般固定标本以F／P＝1．5为宜，而活细胞染色以F／P＝2．4左右为宜。 (3)实用效价滴定： 采用PBS将荧光血清和已知抗核抗体阳性血清分别对倍稀释后进行间接法棋盘交叉染色观察，以最高稀释度能显示最清晰明亮的特异性荧光(++)，而非特异性荧光最弱者为其使用效价。 (4)特异性染色试验： 以鼠胃、肾、肝冷冻切片为抗原，已知抗核抗体或抗平滑肌细胞阳性的病人血清与之结合，再用标记好的羊或免抗人IgG荧光血清染色，结果为阳性(++)者效果良好。 (5)非特异性染色试验：用PBS将荧光标记IgG血清作系列对倍稀释代替第一血清作荧光染色，结果为阴性且背景非特异性荧光较弱的稀释度作为使用的非特异性染色滴度。 (6)标记IgG的纯度鉴定：采用聚丙烯酰胺圆盘电泳进行鉴定，所用凝胶为单层分离胶。标记的IgG蛋白为一扩散色带，有时其上有一染色较深的蛋白带。 5．荧光抗体的保存 保存荧光抗体一要防止抗体失活，二是保持荧光素不脱落和不受激发淬灭。一般认为o一4℃可保存1—2年，一20℃可保存3—4年。宜小量分装，禁止反复冻融。保存前需加防腐剂(一般加入浓度为1：5000—10 000的硫柳汞)和除菌。真空干燥后更易长期保存。 三、荧光抗体染色方法 (一)直接法 用特异荧光抗体直接滴加于待检抗原标本上，由于标记抗原与抗体发生特异性结合，使之呈现荧光，根据荧光分布和形态确定抗原性和部位。 (1)染色：切片经固定后，滴加经稀释至染色效价为1：8或1：16的荧光抗体，室温或37℃湿盒内放置30min。 (2)洗片：倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH 7．4或7．2的PBS中洗2次，每次5min，再用蒸馏水洗lmin。 (3)用50％甘油(0．5m01/L pH 9．5碳酸缓冲液稀释)封固，镜检。 (4)对照染色： ①正常兔荧光血清染色结果应为阴性； ②染色抑制试验：将荧光抗体和未标记抗体球蛋白或血清等量混合，结果为阴性。为染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果为阳性； ②类属抗原染色试验。 (5)优缺点：操作简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白抗原如肾、皮肤的检查和研究。缺点是只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性低。 (二)间接法 可用于检测抗原和抗体。用未标记的特异性抗原加在切片上先与标本中之相应抗体(第l抗体)结合，再用针对第l抗体的抗抗体即第2抗体(荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在。 (1) 切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。 (2) 滴加未标记的特异性抗体于切片，37℃作用30min。 (3) 0．0lm01/L pH 7．2PBS洗2次，每次5min，吹干。 (4) 滴加特异性荧光抗体于切片，37℃作用30min。 (5) 如(3)水洗。 (6) 缓冲甘油封固，镜检。 (7) 对照染色：①抗原对照：即类属抗原染色，结果为阴性；②阳性对照。 (8)优缺点： 间接法只须制备一种荧光抗体便可以检出多种抗原，敏感性高，操作简单，可用于不易制备动物免疫血清的病原体(如麻疹)等的检测，广泛用于自身抗体和感染病人血清的检验。 (三)补体法 在抗原抗体反应时加入补体(多用脉鼠补体)，再用荧光标记的抗补体抗体(如抗C3)进行示踪。 1．材料 (1)免疫血清60℃灭活20min，用K01mers盐水(K01mers盐水配法：在pH 7．40．1m01/L的磷酸缓冲液中，溶解MgSO4使其终浓度为o．01％)作对倍稀释成1：2，1：4，1：8……，补体用1：10稀释的新鲜脉鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价，如为1：32则免疫血清应作1：8稀释。 (2)补体用新鲜脉鼠血清一般作1：10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，用K01mers盐水按2单位的比例稀释备用。 (3)抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用K01mers盐水稀释备用。 2．方法 (1)涂片或切片固定。 (2)吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液滴于切片上，37℃湿盒内放置30min. (3)用o．01m01/LpH 7．2PBS洗2次，搅拌，每次5min，吸干标本周围水液。 (4)滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体，37℃放置30min。 (5)同(3)。 (6)蒸馏水洗1min，缓冲甘油封固，镜检。 3．对照染色(均应为阴性) (1)抗原对照。 (2)抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。 (3)灭活补体对照：将补体经56℃30min处理后，与以上补体按同样比例稀释后同免疫血清等量混合，然后进行补体法染色。 4．优缺点 敏感性较高，荧光抗体不受免疫血清动物种属的限制，一种荧光抗体可作更广泛的应用。对检查形态小的如立克次体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。 (四)荧光亮度的判断 “-”——无或可见微弱荧光 “+”——仅能见明确可见的荧光 “++”——可见有明亮的荧光 “+++”——可见耀眼的荧光。 四、荧光抗体技术的应用 血液中T及B细胞及其亚群的鉴定； 血清中自身抗体的检测(如抗核抗体、抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体、甲状腺球蛋白抗体、抗胃壁细胞抗体及其他自身抗体)； 组织中免疫球蛋白及补体组分的检测； 特异的组织固定抗体检测； 特殊染色体的鉴定； 激素和酶的局部组织定位； 恶变组织中肿瘤特异性抗原的检定； 细菌和病毒的快速检定； 寄生虫的检定与研究(如血吸虫、疟原虫等)。