低浓度五氯酚对鲫鱼血液细胞毒性的体外研究

第 24卷 2005正 第 3期 5月 环 境 化 学 ENVIRONMENTAL CHEMISTRY Vo1．24．NO．3 Mav 2005 低浓度五氯酚对鲫鱼血液细胞毒性的体外研究 张 民 顾宇飞 顾 颖 王 斌 尹大强一 (南京大学环境学院，污染控制与资源化研究国家重点实验室，南京，210093) 摘 要 通过细胞体外毒性试验 ，研究 了低浓度五氯酚对鲫鱼血液淋巴细胞和红细胞 的毒性影响．结果表 明：在 2．50一l000．00lxg·l 范 围 内，五氯 酚对 鲫 鱼 淋 巴细 胞 的活 性没 有 显著 效 应，但 在 500．00和 1000．00lxg·l (高浓度组 )时，对淋巴细胞膜的完整性产生显著影响，造成乳 酸脱氢酶 (LDH)相对释 放量增加 ，并随五氯酚浓度 的增加和暴露时间的延长而增 加．低浓度五氯酚组 (5．00--1000．001xg·l ) 对红细胞溶血没有显著影响，但与二苯并 [a，h]葸联合作用产生协同效应，红细胞溶血效应明显高于两 种化合物单独作用，并且随浓度 的增加 ，血色素相对释放量显著增加．另外 ，鲫鱼 淋巴细胞 膜的完整性 (LDH的释放) 比淋巴细胞活性和红细胞溶血对低浓度五氯酚更敏感． 关键词 五氯酚，细胞膜完整性 ，淋巴细胞活性 ，红细胞溶血 ，鲫鱼． 五氯酚具有明显的生物毒性，特别是对鱼类和贝类等水生生物的毒性较大，尽管残留在水环境中 的五氯酚浓度较低 ，不会造成水生生物急性毒性 ，然而五氯酚性质较稳定 ，易在环境中富集 ，可以通 过多种途径在动植物体内积累，具有极大的潜在危害 ¨．化合物进入高等动物体后 ，通过血液参与机 体循环输送到靶器官，可与血液中细胞 、功能蛋 白等发生作用 ，因此 ，血液成分的变化是检测化合物 生物毒性的早期指标之一，已被广泛使用． 本试验采用鲫鱼为研究对象，建立细胞毒性体外试验，测定了低浓度五氯酚 (PCP)对鲫鱼血液 中淋巴细胞活性 、淋巴细胞膜完整性和红细胞溶血的影响，旨在阐明低浓度五氯酚对鲫鱼血液细胞毒 性 ，探索这些细胞毒性指标的敏感性，为我国五氯酚的水生生态风险评价提供科学数据和方法． 1 材料与方法 1．1 试验材料 五氯酚 (Superco公司)纯度 >98％ ，二苯并 [a，h]蒽 (Aldrich公司)，纯度 >99％，LDH试剂 (南京建成生物工程研究所)． RPMI 1640培养基 (GIBCOBRL公司) 将 RPMI 1640干粉溶于 100 ml蒸馏水中，摇匀，使之溶 解．用 CO 调节 pH至 6．0—6．3左右 (烧杯中溶液颜色 由红转为橙黄)．过滤灭菌 ，装于已灭菌的 250 ml三角瓶里．向三角瓶中加入 1％青 、链霉素 (溶液中青、链霉素浓度为 100 U·ml )，4~C保 存．使用时，加新生牛血清 (杭州 四季青生物工程材料研究所)使血清浓度约为 15％，再用 5％ NaHCO，调 pH至7．2—7．4用于实验．所有操作在无菌条件下进行． Hanks盐溶液 将 80 g NaC1，0．98 g MgSO4(无水)，4 g KC1，1．2 g Na2 HPO4·12H2 O，0．6 g KH PO ，10 g葡萄糖 (无水)和 1．4 g CaC1 按顺序溶于 1000ml蒸馏水中，并加入 4 ml氯仿，4~C保 存 ，作为 Hanks盐溶液母液．取 100 ml母液用 900 ml蒸馏水稀释，加入 1％酚红，高压灭菌 15 min， 然后用 5％ NaHCO 调 pH至 7．0—7．2用于实验． 植物血凝素溶液 (PHA，上海伊华医学科技有限公司) 每安瓿瓶加 2 ml无菌水溶解，4~C保存． 淋巴细胞分离液 (上海华精生物高科技有限公司) 用于从血液中分离淋巴细胞． 0．4％ Trypan Blue染液 将 0．4 g Trypan Blue，0．06 g KH2PO4，0．81 g NaC1，0．05 g甲基对羟苯 甲酸盐和95 ml蒸馏水 ，置于 250 ml三角瓶中煮沸，冷却后用 1 mol·l NaOH调 pH至7．2—7．3，加 2004年 5月 8日收稿． ·国家 自然科学基金资助项目 (20237010，20377022)和江苏省六大人才高峰资助项 目 (2002／A)． ··通讯联系人 维普资讯 http://www.cqvip.com 3期 张民等 ：低浓度五氯酚对鲫鱼血液细胞毒性的体外研究 303 蒸馏水定容至 100ml，过滤灭菌备用． PBS溶液 将 8 g NaC1，0．2 g KC1，2．89 g Na2HPO4·12H2O和0．20 g NaH2PO4溶于 1000 ml蒸馏 水中，高温灭菌 15 min． MTT溶 液 MTT [3．(4，5-dimethylthiazol-2-y1)-2，5一diphenyl tetrazolium bromide]，AMRESCO公 司)纯度 >98％．将 MTT溶解于 PBS溶液，配成浓度为 5 mg·ml～，过滤灭菌后备用． DMSO溶解液 二甲亚砜 (A．P．)与 95％乙醇按体积 1：1配制而成． 鲫鱼 (Cyprinus Carpio) 南京市淡水水产研究所养殖基地 ，雌性 ，平均体重 210．0±23．5g，平 均体长 21．5±4．4 cm．实验室驯养一周后用于实验，驯养采用除氯自来水，平均水温为 15±2~C，光 暗比为 12：12 h． 1．2 试验方法 1．2．1 淋巴细胞分离与纯化 鲫鱼血液淋巴细胞分离按 Andrew 的方法进行 ．用加有肝素的注射器从鱼尾部静脉抽取血液 ， 通过离心分离并洗涤，制成细胞悬液 ，用培养基调节细胞浓度至 2×10 个 ·ml～，用于淋巴细胞活性 试验和淋巴细胞细胞膜完整性试验． 1．2．2 红细胞的分离与纯化 鲫鱼红细胞的分离与纯化按照 Parnham等的方法进行 ，将从鱼尾静脉抽取的血液加入已灭菌的 离心管 ，离心分离并洗涤 ，用吸管将其打匀成细胞悬液 ，用于红细胞毒性试验 ，24h内使用． 1．2．3 淋巴细胞活性试验 淋巴细胞活性用 MTT法测定 ]．试验结果采用应激指数 (S．I．)表示鲫鱼淋巴细胞的活性效应． 应激指数 (s．I．) =含有应激物 (PHA)的 OD值／不含应激物 (PHA)的 OD值 1．2．4 淋巴细胞膜完成性试验 根据 Dagmar Fischer等人的方法 测定淋巴细胞乳酸脱氢酶释放量 ，表示细胞膜完整性．试验结 果用 LDH相对释放量 (L)表示 ，L值小于 10％认为无 LDH释放效应 ，细胞膜完整性无损伤． LDH相对释放量 (L) = (各浓度组 LDH活力／空白组 LDH活力) ×100％ 1．2．5 红细胞毒性试验 红细胞毒性采用测定红细胞溶血 (血色素释放 )进行 ]．试验结果用血色素相对释放量 (H) 表示 ，H值小于 10％认为无血色素释放效应 ，无红细胞溶血． 血色素相对释放量 (H) = (各浓度组 OD 。值／参照组 OD 。值) ×100％ 1．2．6 数据处理 实验数据采用 EXCEL软件处理 ，对样本之间进行 t检验，各剂量组与空 白对照组 比较 ，当 P< 0．05时，认为有显著性差异，当 P>0．05时认为没有显著性差异． 2 结果与讨论 2．1 五氯酚对鲫鱼淋巴细胞活性的影响 低浓度五氯酚对鲫鱼淋巴细胞活性的影响见图 1，统计结果显示：与对照组相 比，在 2．50— 1000．00 g·l 浓度范围内，各浓度组对淋巴细胞活性的影响均无显著效应 ，s．I．值无显著变化． 2．2 五氯酚对鲫鱼淋巴细胞乳酸脱氢酶释放的影响 低浓度五氯酚对鲫鱼淋巴细胞乳酸脱氢酶释放的影响见表 1．统计分析结果显示 ：在 30 min和90 min两个不同暴露时间下，淋巴细胞 LDH的相对释放量都表现出随浓度增加而增加的趋势，而且在 高浓度组 (500．00，1000．00 g·l )，LDH的相对释放量显著增加 (P<0．05)，L值都大于 10％ ， 同时，随着暴露 时间 的延 长，高浓 度组 LDH 的相 对 释放 量也 明 显增 加，而低 浓 度组 (5．o0— 125．00 g·l )的 L值均小于 10％，没有显著效应． 维普资讯 http://www.cqvip.com 环 境 化 学 24卷 2 1．5 趔 1 ∽ 0．5 0 I ． ． ． 1 ．上 ． 1 ．1 ． ． I ． ．蠹 莹1喜 圭萤莹 ~-q嚣 l奏 莹 萤 蚕 羹 薹 五氯酚浓度 ， ·1 图 1 低浓度五氯酚对鲫鱼淋巴细胞活性的影响 Fig·1 Effects of low concentration PCP on lymphocyte activity of cruclan carp 表 1 不同暴露染毒时间下不同浓度五氯酚对鲫鱼淋巴细胞乳酸脱氢酶相对释放量 (L)的影响 (n：4) Table 1 Effects of different concentrations PCP on the relative release 0f lactate dehydrogenase(LDH)of cruclan carp lymphocytes in different exposure time(n=4)． 注：数据以 Mean±SD表示 ， ·显著效应 2．3 五氯酚对鲫鱼红细胞溶血的影响 低浓度五氯酚对鲫鱼红细胞溶血的影响见表 2，统计分析结果显示 ：低浓度五氯酚对鲫鱼红细胞 溶血没有显著效应，各浓度组的 H值均小于 10％．低浓度二苯并 [a，h]蒽在5．o0—125． 00 P．g．1一 浓 度范围内，对鲫鱼红细胞溶血也没有显著效应 ，但高浓度组 (500．O0，1000．00 P．g．1一。)导致红细 胞溶血效应显著 (P<0．05)，H值均大于 10％ ，而且随浓度增加 ，H值显著增加．五氯酚与二苯并 [a，h]蒽 1：1的混合物除5．00和 10．00 P．g·l 浓度组外，其余浓度组对红细胞溶血均产生显著效应 ， H值均大于 10％ ，而且随浓度增加 ，H值显著增加． 表 2 不同化合物对鲫鱼红细胞血色素相对释放量的影响 (n=4) Table 2 Effects of different chemicals on erythrocytes hemolysis of cruclan carp 注：效琚以 Mean±SD表示 ，·显著效应． 2．4 讨论 综上所述 ，低浓度五氯酚 (2．50—1o00．00 P．g·l )对鲫鱼淋巴细胞活性和红细胞溶血都没有 显著影响，但 500．O0 g·l 和 1000．00 P．g·l 浓度组对淋巴细胞细胞膜完整性有显著影响 ， 表现为 LDH相对释放量显著升高．Repetto等利用虹鳟鱼 (0．mykiss)RTG-2细胞体外的研究表明 ， 低浓度 PCP对 RTG-2细胞活性没有显著影响 ，高浓度 PCP (1O0la,mol·l )引起 LDH释放量显著增加 引 ， 与本研究结果基本相似．他们认为，一些化合物造成细胞膜损伤的主要途径是改变细胞膜的通透性 ， 可以推测五氯酚引起细胞膜完整性损伤的机制之一是改变细胞膜的通透性，造成乳酸脱氢酶释放 ． 然 而 ，亲脂性的五氯酚是通过镶嵌在细胞膜的脂层改变了细胞膜的通透性 ， 还是通过改变了细胞膜膜离 子通道的通透性，需要进一步实验证据证实．从本研究还可以看出，同一化合物对不同细胞膜损伤不 一 ， 低浓度五氯酚对红细胞膜没有显著的影响 ，表现为没有产生血红素显著释放 ， 发生红细胞溶血现 象·可能是由于细胞膜的组成不同所致，红细胞具有完整的膜骨架网络 ， 膜骨架网络通过锚蛋白和带 4．1蛋白同细胞膜紧密相连，保证了红细胞膜很好的弹性和较高的强度． 维普资讯 http://www.cqvip.com 3期 张民等：低浓度五氯酚对鲫鱼血液细胞毒性 的体外研究 305 五氯酚不仅可以单独产生生物毒害作用 ，而且与其它化合物具有协同作用，产生对生物产生更大 的毒害．Zhu等人发现 PCP和双邻二氮杂菲铜 [bis-(1，10-phenanthroline)cupric，Cu(II)(OP)：]复合 物对微生物的急性毒性具有协同效应 ，Till Luckenbach等人利用虹鳟鱼研究发现 PCP和 PAHs联合 作用对热休克蛋白 hsp 70(heat shock protein，hsp)也具有协同作用 ．本研究 中低浓度五氯酚不产 生红细胞溶血效应 ，其毒害作用远小于二苯并[a，h]蒽，但与二苯并 [a，h]蒽混合后产生协 同作用 ， 使红细胞血色素释放显著增加．这种协同作用表明，五氯酚在真实环境中具有更大的生物危害．但其 协同作用机理尚不明确，有待进一步研究． 目前 ，运用血液细胞检测化合物细胞毒性的方法很多 ，细胞膜损伤 LDH释放被认为是一种快速 灵敏的检测细胞毒性的方法．Cho等人指出 LDH释放是检测细胞膜损伤的重要标志物 ，A Soltan Menem等人指出细胞膜损伤可以作为高速 中子辐射污染的生物标志物 ¨．本文中 500．00和 1000．O0 g·l 浓度组五氯酚引起 LDH释放量的显著升高 ，而对淋 巴细胞活性和红细胞溶血没有显著效应 ， 说明细胞膜损伤 LDH释放这一指标对低浓度五氯酚有较高的敏感性 ，建议将鱼淋巴细胞 LDH酶释放 作为监测和评价低浓度五氯酚对水生生态系统危害的生物标志物． 3 结论 (1)在 2．50—1000．00 g·l 的浓度 范围内，五氯 酚不影 响淋 巴细胞 的活 性，但高浓度 组 (500．00 g·l 和 1000．00 g·l )可造成细胞膜的损伤 ，引起 LDH释放 ，具有细胞毒性． (2)在试验浓度范围内，五氯酚对红细胞溶血没有显著效应，但与二苯并[a，h]蒽会产生协同 效应 ，增加对红细胞的毒性． (3)细胞膜完整性 (LDH释放)对低浓度五氯酚反应敏感 ，建议作为生物标志物来监测和评价 五氯酚对水生生态系统的危害． 参 考 文 献 International Programme on Chemical Safety／World Health Organization(ed．)：Pentachloropheno1．Environmental Health Criteria 71， Geneva，1987 Andrew F R，Collection，Separation and Identification of Fish Leucocytes．In：Stolen S J et a1．。 Techniques in Fish Immunology．USA： SOS Publication．1990 1 13— 135 Parnham M J，Wetzig H，Toxicity Screening of Liposomee． Chem Phys Lipids。 1993。64：263— 274 李延，胡双庆，尹大强等，11种取代酚类 内分泌干扰活性的初步筛选与评价，环境化学 ，2003，22 (4)：385—389 Dagmar Fischer， Li Youxin，Barbara Ahlemeyer et a1．，In Vitro Cytotoxicity Testing of Polycations：Influence of Polymer Structure on Cell Viability and Hemolysis． Biomaterials，2003，24： 1 121-- 1 133 Repetto G，Jos A，Hazen M J et a1．， A Test Battery for the Ecotoxicological Evaluation of Pentachloropheno1． Toxicology in Vitro． 2001，15：503-- 509 Zhu Ben-zhan，Mordechai Chevion， Mechanism of the Synergistic Cytotoxieity between Pentachlorophenol an d Copper一1。 10一phenanthro— line Complex：the Formation of a Lipophilic Ternary Complex． Chemico-Biological Interactions，2000。 129： 249— 26l Till Luckenbach，Herm ann Ferling，Maike Gernhoefer et a1．，Developmental and Subcellular Effects of Chmnic Exposure to Sub—lethal Concentrations of Ammonia，PAH and PCP Mixtures in Brown Trout(Salmo trutta f．，口rio L．)Early Life Stages．Aquatic Toxicology， 2003．65： 39— 54 Cho Youn‘sook，Kim Mee-jeong，Lee Joo—young et a1．，The Role of Thiols in Protecting Against Simultaneous Toxicity of Menadione to Platelet Plasma and Intracellular Membranes．The Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics．1997，280 (3)：l335一 l340 A Sohan Monem， Fadel M Ali，Noura J J A1一thani et a1．。Membr~e Solubilization in Erythrocytes a8 a Measure of Radiation Exposure to Fast Neutrons． Phys．Med．Bio1． 1999．44：347— 355 j i ] ] ] ] l 2 3 4 5 6 7 8 9 O } } [ [ [ [ 维普资讯 http://www.cqvip.com 306 环 境 化 学 24卷 CYToToXICITY TESTING oF PENTACHLoRoPHENoL IN LoW ER CoNCENTRATIoN To BLooD CELLS oF C JlⅣ【 ClARP，DS IN RD ZHANG Min GU Yu-fei GU yz WANG Bin YIN Da-qiang (State Key laboratory of Pollution Control and Resource Reuse，School of the Environment，Nanjing University，Nanjiag，210093) ABSTRACT The effects of pentachl0r0phen0l(PCP)on Cyprinus Carpios lymphocyte activity，lymphocyte membrane integrity and erythrocytes hemolysis were examined using the MTT assay，the release of the lactate dehydro- genase(LDH)and the hemoglobin release respectively in vitro．The results showed that lymphocyte activity had no remarkable response to PCP in all test concentrations(2．50—1000．001．Lg·1 )．But the membrane damage was found in 500．O0 I．Lg·1～ and 1000．00 I．Lg ·1～ groups．and the significant release of LDH was observed．The release of LDH increased with exposure time prolonging and exposure concentration increasing． The results also showed that PCP didnt change the release of hemoglobin from erythrocytes．But the release of hemoglobin was affected significantly by synergistic effects of PCP and Dibenzo[a，h]anthracene and the release of hemoglobin increased with the concentration of the mixture of PCP and Dibenzo[a，h]anthracene increasing． It is a conclusion in the present study that there is obvious cytotoxicity of PCP in lower concentration to blood cells of Cyprinus Carpios．The damage of lymphocyte membrane is more sensitive than lymphocyte activity and erythrocytes hemolysis to lower concentration of PCP．It is suggested that the release of LDH as a biomarker could be used to monitor and evaluate the contamination of PCP in aquatic ecosystem． Keywords： pentachl0r0phen0pl， membrane integrity， lymphocyte activity， erythrocyte hemolysis， Cyprinus Carpio． 维普资讯 http://www.cqvip.com