蛋白质提取的方法总汇
蛋白质提取的方法总汇
1、植物组织蛋白质提取方法
1、根据样品重量(1g样品加入 3.5ml提取液,可根据材料不同适当加入),准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4小时)。
3、用离心机离心 8000rpm40min4℃或 11100rpm20min4℃
4、提取上清夜,样品制备完成。
蛋白质提取液:300ml
1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml
2、甘油(Glycerol)75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl...
蛋白质提取的方法总汇
1、植物组织蛋白质提取方法
1、根据样品重量(1g样品加入 3.5ml提取液,可根据材料不同适当加入),准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4小时)。
3、用离心机离心 8000rpm40min4℃或 11100rpm20min4℃
4、提取上清夜,样品制备完成。
蛋白质提取液:300ml
1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml
2、甘油(Glycerol)75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g
这种方法针对 SDS-PAGE,垂直板电泳!
2、植物组织蛋白质提取方法
三氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨叶片
2、加入样品体积 3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm以上 1小时)弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮(含 0.07%的 β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm以上 1小时),然后真
空干燥沉淀,备用。
4、上样前加入裂解液,室温放置 30分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15℃8000rpm以上 1小
时或更长时间以没有沉淀为
),可临时保存在 4℃待用。
5、用 Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用。
药品:
提取液:含 10%TCA和 0.07%的 β-巯基乙醇的丙酮
裂解液:2.7g尿素 0.2gCHAPS溶于 3ml灭菌的去离子水中(终体积为 5ml),使用前再加入 1M的DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少!
3、组织:肠黏膜
目的:WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达
应用 TRIPURE提取蛋白质步骤:
含蛋白质上清液中加入异丙醇:(1.5ml每 1mlTRIPURE用量)
倒转混匀,置室温 10min
离心:12000 g,10min,4度,弃上清
加入 0.3M盐酸胍/95%乙醇:(2ml每 1mlTRIPURE用量)
振荡,置室温 20min
离心: 7500g,5 min,4度,弃上清
重复 0.3M盐酸胍/95%乙醇步 2次
沉淀中加入 100%乙醇 2ml
充分振荡混匀,置室温 20 min
离心: 7500g,5min,4度,弃上清吹干沉淀
1%SDS溶解沉淀
离心:10000g,10min,4度
取上清-20度保存(或可直接用于WESTERN BLOT)
存在的问题:加入 1%SDS后沉淀不溶解,还是很大的一块,4度离心后又多了白色沉定,SDS结晶?测
浓度,含量才 1mg/ml左右。
解决:提蛋白试剂盒,另外组织大小适中,要碎,立即加 2X BUFFER,然后煮 5-10分钟,效果很好的。
4、植物材料:水稻苗,叶鞘,根
1、200毫克样品置于冰上磨碎
2、加 lysis buffer,离心,10000rpm,4度,5min取上清
3、重复离心 5min
lysis buffer:urea np-40 ampholine 2-me pvp-40
5、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按 Davermal等(1986)的方法进行。
100mg材料剪碎后加入 10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入 1.5 ml 10% 三
氯乙酸(丙酮配制,含 10mM即 0.07%β-巯基乙醇),混匀,-20℃沉淀 1小时,4℃,15000 r/min离心 15 min,
弃上清,沉淀复溶于 1.5ml冷丙酮(含 10 mMβ-巯基乙醇),再于-20℃沉淀 1小时,同上离心弃上清,(有
必要再用 80%丙酮(含 10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每 mg干粉加入 20μl(可调) UKS液[9.5 M尿素,5mM碳酸钾,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫苏糖醇),
2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100],37℃温育 30min,期间搅动
几次,28度 (温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min离心 15 min,离心力越大时间长一点越
好!上清即可上样电泳。或者-70度保存
6、植物根中蛋白质的抽取
(1) sample, 液氮研磨
(2) 装 1.5 ml centrifuge 用 tube
(3) 加 1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul
(4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite
(5) 取上层液,蛋白质就在里面
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