胆病从肝论治_在防治胆结石实验研究中的应用
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中 医 药 信 息
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2010年第27卷第1期
V01.27,No.1,2010
“胆病从肝论治"在防治胆结石实验
研究中的应用
唐乾利1,黄名威1,俞渊2,赫军2,王清坚2,黄炜1
(1.广西中医学院,广西南宁530001;2.广西中医学院第一附属医院,广西南宁530023)
摘要:目的:以“胆病从肝论治”为原则研究大黄灵仙胶囊防治胆结石的作用机制。方法:使用致石饲
料诱发方法建立豚鼠胆囊结石模型,治疗组造模期间每日...
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lnfiJrrnationOilTra(1i!iorlalChineseMf-f¨ine
2010年第27卷第1期
V01.27,No.1,2010
“胆病从肝论治"在防治胆结石实验
研究中的应用
唐乾利1,黄名威1,俞渊2,赫军2,王清坚2,黄炜1
(1.广西中医学院,广西南宁530001;2.广西中医学院第一附属医院,广西南宁530023)
摘要:目的:以“胆病从肝论治”为原则研究大黄灵仙胶囊防治胆结石的作用机制。方法:使用致石饲
料诱发方法建立豚鼠胆囊结石模型,治疗组造模期间每日予大黄灵仙胶囊(制作成悬液)灌胃治疗,连
续8周。观察比较治疗组和模型组豚鼠胆囊结石形成率,检测各组豚鼠肝脏病理和超微结构变化情况
以及荧光定量PCR检测肝组织胆固醇、胆汁酸代谢相关酶的
达量。结果:模型组和治疗组豚鼠胆囊
结石形成率分别是100%和50%,差异有统计学意义(P<0.01)。治疗组豚鼠肝组织病变较模型组明
显减轻。胆固醇7a一羟化酶、胆汁酸盐输出泵基因表达分别是模型组的2.08倍和2.57倍(P<0.01)。
结论:大黄灵仙胶囊具有较好的防治结石功效,作用机制与其保护肝组织以及在转录水平上调胆固醇、
胆汁酸代谢相关酶的表达有关。“胆病从肝论治”在胆结石防治实验研究中具有重要的指导价值。
关键词:胆结石;胆病从肝论治;胆固醇7a一羟化酶;胆汁酸盐输出泵;超微结构
中图分类号:R657.42 文献标识码:A 文章编号:1002—2406(2010)01一0016—04
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分为TNF—Ot和TNF—B两种类型,两者氨基酸序列
仅有28%同源性,但两者结合相同的受体,具有抗肿
瘤、免疫调节、抗病毒、致热作用,并可促进炎症反应,
引起恶液质【l,2J。有研究发现,温病湿热证与IlIL浆
ETX水平及血清TNF—d水平密切相关¨’4J。TNF—Ot
为内源性炎性致病因子,温病湿热证中这种冈子水平
显著升高,可促使机体产生炎症反应。本研究提示,病
毒组与肠菌组m清TNF—Ot水平明显增高,这与文献
报道一致。且病毒组比肠菌组有碌著的升高,推测
MHV—A59作为生物致病因子所致的湿热症模型炎
症反应更加剧烈。
4.2温病湿热证与血脂紊乱
有研究表明[5。J,高脂血症与中医的痰湿有十分
密切的关系,其中甘油三酯(TG)、总胆同醇(TC)及低
密度脂蛋白(LDL—C)在痰湿中尤为明显。血脂可为
痰的物质基础之一。
中医学认为,湿邪与痰饮都是津液代谢失调的病
理产物,痰饮的生成与湿邪有较大的关系,湿邪是痰饮
生成的主要来源,而痰湿的产生与脾胃密不可分。有
学者认为旧J,不论是外源性或内源性脂类异常,均是
造成了脾胃运输与转化功能障碍而发病。因此,湿、
基金项目:2006年国家自然科学基金资助项目(30660232)
作者简介:唐乾利(1961一),男,教授,主ft医师,硕士研究牛导师,广西
名||T医,广西中医学院外科学学科带头人,从事中两医结合
外科I临床、科研及教学工作,主要研究方向:胆石病防治、烧
伤创疡治疗。
收稿日期:2009—09—12
修回日期:20139—10—16
痰、血脂这三者有着密切的关系,i者与脾胃损伤密切
相关,在某一阶段可能是同源异流,不能截然分开,将
血脂作为湿邪的代谢产物之一,或者作为湿邪的客观
之一是有理论和实验依据的。本研究结果显示,
两种模型小鼠m清TG水平的升高,与前期的研究一
致一]。因此,两种温病湿热证动物模型存在着脾胃损
伤,导致脾之运化水湿功能失司,湿聚成痰,而造成血
脂升高。两种模型小鼠的TG水平变化无差别,提示
了模型在本阶段,“内湿”的形成可能主要与肥甘饮
食、湿热外环境有关,与生物致病网子的关系相对较
小,因为,温病湿热证的典型发病特点是先有“太阴内
伤,湿饮停聚”,这样造成了“内湿”形成,血脂升高,才
有“客邪外至”,即生物致病凶子感染。
参考文献:
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万方数据
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InfimnationonTraditionalChineseMedicine
TheApplicationof‘BiliaryDiseasesTreatedbyDifferentiatingSyndromesoftheLiver’
totheExperimentaIResearchonPreventionandTreatmentofGallStones
TANGQian—h1,HUANGMing—weil,YUYuan2,etal
(1.GuangxiUniversityofTCM,Nanning53000l,China;
2.TheFimtAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityof粥M,Nanning530023,China)
Abstract:Objective:ToinvestigatethemechanismofDahuanglingxianCapsulesinpreventingandtreatinggall——stone
diseasesbasedontheprincipleof“BiliaryDiseasesTreatedbyDifferentiatingSyndromesoftheLiver”.Methods:111e
gall—stonemodelsofguineapigswereinducedbybeingfedwithlithogenicdiet,atthesametime,thetreatedgroup
werefedwithlavageofDahuanglingxianCapsules(madeintosuspensionfluid)onceperday.Gall—stonesformation
ratioofthemodelgroupandthetreatedgroupwerestatistlled8weekslater.Theroutinepathologyandultrastruetureof
liverweredetected.Genesexpressionsofcholesterolandbileacidmetabolismrelatedenzymeswerequantitativelyana—
lyzedbyrealtimePCR.Results:Gallstonesformationratioofthemodelgroupandthetreatedgroupwere100%and
50%respectively.Gallstonesformationratioofthetreatedgroupwassignificantlydecreasedcomparedwiththemodel
group(P<0.O1).Liverroutinepathologyanduhrastructureofthetreatedgroupwereobviousbetterthanthatofthe
modelgroup.TheCYP7AlmRNAandBSEPmRNAexpressionsofthetreatedgroupwere2.08timesand2.57timesof
thoseofthemodelgrouprespectively(P<0.01).Conclusions:DahuanglingxianCapsuleshaveagoodeffectonpre-
ventinggallstonesformation,themechanismofwhichwasassociatedwithitsliverprotectionandup—regulationofthe
expressionsofcholesterolandtherelatedenzymesofbileacidmetabolismonthetranscriptionlevel.Theprincipleof
“biliarydiseasestreatedbydifferentiatingsyndromesoftheliver”embodiesthevalueofguidanceintheexperimentalre—
searchonpreventionandtreatmentofgallstones.
Keywords:gall—stone;biliarydiseasestreatedbydifferentiatingsyndromesoftheliver;cholesterol7alpha—hydrolase
(CYPTAI);bilesaltexportpump(BSEP);uhrastructure
中医学认为,胆与肝相连,附于肝之短叶间,肝胆
有经脉互为络属,构成表里关系,胆汁来源于肝之余
气,胆汁所以能正常排泄和发挥作用,亦依靠肝的疏泄
功能。故认为胆病多源于肝,主张“胆病从肝论治”。
虽然胆结石的形成机制未完全阐明,但是现代医学同
样认为,肝细胞产生病理性胆汁是胆结石形成的基本
要素⋯。因此,“月日病从肝论治”符合胆石病的治疗原
则。本文即应用这一原则来指导研究大黄灵仙胶囊保
护实验豚鼠肝组织和调节肝组织胆固醇、胆汁酸代谢
相关酶表达的作用,以了解其防治胆结石的作用机制,
同时为“胆病从肝论治”的应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料普通豚鼠(广西医科大学实验动物中心
提供,许可证号:SCXK桂2003—0003);大黄灵仙胶囊
(广西中医学院第一附属医院中心药房提供,医院内
制剂,桂药监注[2002]175号);组织总RNA抽提试剂
盒、柱式胶回收试剂盒(购自BIOBASICINC公司);
逆转录试剂盒、荧光定量PCRMix(购自大连宝生物t
程有限公司);其他试剂均购自上海生工生物工程技
术服务有限公司。
1.2方法
1.2.1 造模和给药普通健康豚鼠60只,2509左
右,雌雄不拘,随机分为模型组20只、大黄灵仙胶囊治
疗组20只、正常对照组20只。模型组和治疗组参照
文献方法【21给予致石饲料喂养,正常对照组予常规饲
料喂养。各组动物饲养期间适量补充青饲料。造模开
始后大黄灵仙胶囊治疗组每日予大黄灵仙胶囊(制作
成悬液)按参考剂量∞’41灌胃1次,模型组和正常对照
组以等体积生理盐水灌胃对照。造模及治疗时间总共
8周。
1.2.2标本采集方法采集标本前禁饮食12h。以
水合氯醛腹腔注射麻醉后剖腹,观察肝脏、胆囊大体病
理,记录胆囊结石性状并计算成石率。剪开膈肌进入
胸腔,心脏穿刺抽血作生化(胆同醇、胆汁酸、胆红素)
检测。迅速切取芝麻大小的肝组织投入装有预冷的
2%戊二醛的小瓶中送电镜室制作切片观察,而后每只
动物在相同部位切取约50mg的新鲜肝组织提取总
RNA,同时适量备份肝组织液氮保存。
1.2.3豚鼠肝组织病理及超微结构的检测 各组豚
鼠肝组织常规病理切片检查,同时利用透射电镜检测
肝组织超微结构的改变情况。
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1.2.4豚鼠肝组织胆同醇、胆汁酸代谢相关酶的表达
检测
根据课题组研究获得的豚鼠胆同醇7a一羟化酶
(Cholesterol7alpha—hydrolase,CYP7A1)和胆汁酸盐
输出泵(bilesaltexportpump,BSEP)基因cDNA序列
(Genbank登陆号分别为GQ507494、GQl69125)以及
内参基冈B—actin序列分别设计荧光定量PCR引物
(CYP7A1基因扩增上游引物5TGGAGAAGGCAG
GTCAA3,'下游引物5℃CATTACTGTAGAAGGTG
GTC3,,产物330bp;BSEP基因扩增上游引物5qq'C
TATGATCCCGACGAA37,下游引物5CGGCTGCTA
TGACACrITrl3,产物190bp;内参基因扩增上游引物5
7AGCGTGGCTACACTTTCA3,.下游引物5GTYGGC
ATAGAGGTCC1TAC3,’产物305bp),定量检测两组
豚鼠肝组织CYP7AI和BSEP基冈的表达。
1.2.5血清胆同醇、胆汁酸和胆红素检测采用全自
动生化检测仪检测。
1.2.6统计方法采用SPSS13.0统汁分析软件处
理,计量数据以均数±标准差(面±s)表示,组问两两比
较用£检验。
2结果
2.1 胆囊结石形成情况
结石形成的判定以胆囊内有肉眼可见的泥沙或团
块状结石为准。结果模型组豚鼠结石形成率达剑
100%(20/20),而大黄灵仙胶囊治疗组则为50%(10/
20)。经卡方检验结石形成率差异有统计学意义(P<
0.01)。所有模型动物的胆囊结石均为松软的团块或
泥沙样,黄绿色或黑褐色(图2一B),经红外光谱分析
为胆红素盐类色素型结石。而从结石形成的大小及质
量分析,模型组结右量大且几乎为团块状,而大黄灵仙
胶囊治疗组动物的结石均为泥沙样,结石形成量少
(图2一C)。
图1 各组豚鼠胆囊及结石
图解:图1中为各组动物新鲜胆囊标本照片。其
中A为正常胆囊,胆囊壁薄,胆汁清澈透亮,胆囊内未
见结石影;B为模型组胆囊,可见胆囊壁增厚,内有团
块状结石形成;C为大黄灵仙胶囊治疗组胆囊,胆囊壁
增厚,可见少量泥沙样结石。
2.2各组豚鼠肝脏常规病理及超微构变化的比较
常规病理切片显示模型组豚鼠肝组织普遍存在脂
肪变、局灶坏死及早期纤维化改变,而大黄灵仙胶囊治
疗组豚鼠肝组织主要表现为肿胀及脂肪变。透射电镜
检测则显示,模型组和大黄灵仙胶囊治疗组豚鼠肝组
织超微结构均有不同程度改变,主要表现为细胞水肿,
核膜不规则,核旁细胞器减少,线粒体肿胀,脊模糊不
清,内质网扩张,毛细胆管扩张,腔内绒毛脱落减少甚
至消失。但从改变的程度分析,大黄灵仙胶囊治疗组
肝组织仍然保持较好的超微结构,明显优于模型组
(图2),说明大黄炙仙胶囊具有较好的保护肝组织的
作用,与笔者较前观察的病理情况一致|3J。
图2各组豚鼠肝组织超微结构
图解:图A为正常肝组织,核圆,核膜完整规则,核仁清晰,线粒体丰富,脊清晰可见。图B为治疗组肝组织,核膜
完整,线粒体肿胀,呈双层膜改变,但脊仍可见,内质网扩张,为早期水肿改变。图C为模型组肝组织,核膜不规
则(未显示),核旁细胞器明显减少,线粒体萎缩,结构不清晰,可见大量糖原颗粒。
2.3豚鼠肝组织胆同醇、胆汁酸代谢褶关酶的表达及
血清胆固醇、胆汁酸和总胆红素检测结果
CYP7A1基因是胆同醇代谢的关键酶,而BSEP基
因与胆汁酸盐的分泌关系密切‘5|,二者的功能缺陷都
可能影响胆固醇、胆汁酸的代谢而直接影响胆结石形
成。经过大黄灵仙胶囊治疗后豚鼠肝组织
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CYP7A1mRNA和BSEPmRNA表达量均明显上调,表
达量分别是模型组的2.08倍和2.57倍,差异均有统
计学意义(P<0.01)。本文在检测基冈表达的同时检
测各组豚鼠血清中的总胆同醇、胆汁酸以及胆红素含
量(见表1)。结果显示,模型组和治疗组豚鼠血清中
总胆固醇含量上升,而胆汁酸含量下降,与正常组比较
差异均有统计学意义(P<0.01)。而治疗组豚鼠血清
中的总胆固醇含量比模型组低,胆汁酸含量比模型组
高,差异非常显著(P<0.01)。血清总胆红素的含量
从低到高的组别为正常组、治疗组和模型组,各组问比
较差异均有统计学意义(P<0.01)。血清胆红素的变
化可能与各组豚鼠肝组织的损伤程度有关,同时与结
石的成分相关。
表l各组豚鼠血清胆固醇、胆汁酸检及总胆红素检测结果(元±s)
注:模型组和正常组总胆汁酸比较,“P<0.01;治疗组和正常组
总胆汁酸比较,△△P<0.OI;模型组、治疗组和正常组总胆红素比
较;一P<0.Ol。
3讨论
“胆病从肝论治”是治疗胆道疾病的基本原则之
一,内涵丰富,有充分的理论依据和广泛的I临床基
础阳J。大黄灵仙胶囊为广西名中医唐乾利教授治疗
胆石病的有效经验方,方中生大黄、芒硝攻下导滞、利
胆排石;金钱草、郁金、柴胡、枳壳、泽兰相伍,既有清热
利湿之功,又有理气祛痰之效;鸡内金、金钱草、威炙仙
为排石佳品;威灵仙、磁石为经验用药;黄芪、甘草意在
益气补虚,保护胃气。诸药合用共奏疏肝利胆,攻下排
石的功效【7J。本文即应用“胆病从肝论治”原则来指
导研究大黄灵仙胶囊保护实验豚鼠肝组织和调节肝组
织胆同醇、胆汁酸代谢相关酶表达的作用以了解其防
治胆结石的作用机制。研究结果显示,大黄灵仙胶囊
能湿著降低豚鼠胆囊结石的发牛率,治疗组豚鼠肝组
织病理改变和超微结构的变化明显较模型组轻,属于
早期口f逆性的水肿性病变。笔者认为,在致石饲料
(高脂高纤维素低蛋白)的持续作用下,肝细胞的代谢
出现紊乱,甚至出现肝细胞的变性坏死㈦’91,而肝细胞
的损伤直接导致胆固醇、胆汁酸代谢相关的酶受到影
响【10|,最终产生病理性胆汁而导致结石生成。本文的
研究表明,治疗组豚鼠总胆同醇含量较模型组低,而胆
汁酸含量则高于模型组,差异有统计学意义(P<
0.01)。在基因转录水平,模型组豚鼠肝组织的
CYP7A1和BSEP基因表达均显著F调,而治疗组豚鼠
肝组织CYP7A1mRNA和BSEPmRNA表达水平分别是
模型组的2.08倍和2.57倍,这说明大黄灵仙胶囊具
有在病理状态下上调豚鼠肝组织CYP7AImRNA和
BSEPmRNA表达的作用。
综七所述,中药制剂大黄灵仙胶囊防治胆结石的
实验研究表明,“胆病从肝论治”符合胆结石的防治原
则,治疗胆石病的关键在于,不仅要清除胆石“异物”
本身,更要恢复肝胆系统的正常生理功能,防止病理性
胆汁的产生。只有正本清源,才有叮能防止胆结石的
复发和再生,从根本上治愈胆石病。因此,“胆病从肝
论治”的原则应该贯彻到胆结石防治的全过程。虽然
彻底防止、逆转胆汁的成石性还很困难,但许多中药能
在多方面、多层次作用于肝细胞,有望从病理性胆汁形
成这一中心环节治愈胆石病⋯J,值得进一步深入
研究。
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