实验十四DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析(1)

实验十四DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析(1) 实验十四 DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析 [原理]二甲氨基萘磺酰氯(1-Dimethylaminonaphtalene -5-sulfonyl chloride,DNS-Cl)，可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨基酸，反应过程如下: 形成的DNS-氨基酸在紫外线(260nm或365nm)照射下发出强烈的黄色荧光，因此可用荧光检测DNS-氨基酸的存在。 聚酰胺薄膜对不同的DNS-氨基酸吸附力不同，用此薄膜在一定的溶剂系统中可将混合DNS-氨基酸进行层析分离。但是有些氨基酸的结构很近似，如只采用一种溶剂系统进行单向层析，难以达到完全分离氨基酸的目的，这时可选用另一种溶剂系统进行第二向层析，使在第一向层析中不能分离清楚的DNS-氨基酸得到完全分离，这样的层析方法称为双向层析。 聚酰胺是一类高分子化合物含有大量的酰胺基团。这些酰胺基团上的氨基与氨基酸中的羰基形成氢键;而酰胺基团上的羰基又可与氨基酸中的羟基、酚羟基形成氢键。由于不同的氨基酸和聚酰胺形成氢键的能力不同，所以选择适当的溶剂系统对氨基酸混合液进行展层时，不同的氨基酸在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系统就呈现差异，这一差异使各种氨基酸在层析过程中分布在不同的位置，得到分离。 [器材与试剂] 主要器材: 毛细玻管 层析缸 40?温箱 紫外灯 电吹风 聚酰胺薄膜(5cm×5cm) 试剂: DNS-Cl丙酮液:每毫升丙酮液中含DNS-Cl 2.5 mg。 展开剂: 第一相 苯:冰乙酸 = 9:1.7(v/v) 第二相 85%甲酸:水 = 1.5:100(v/v) 1mol/L HCl 1mol/L NaOH 0.2 mol/L NaHCO 溶液(用去离子水配制并用1 mol/L NaOH 调至pH 9.8) 3 水饱和乙酸乙酯 [操作]: 正常人血清处理: 取0.5ml正常人血清于离心管中加入无水乙醇1.5ml(一滴一滴地加入并摇匀)沉淀蛋白质，置4?冰箱2小时，离心取上清液于具塞试管中80,90?蒸干备用。 正常人血清中氨基酸的DNS化: 在有塞试管中(内有经预处理的血清)加pH9.8的 0.2 mol/L NaHCO 0.2ml、3DNS-Cl丙酮液0.2ml充分摇匀，放入40?恒温箱保温30分钟，去塞后再保温15分钟，取出后用1 mol/L HCl酸化至pH 2,3(注意用最小体积，从一滴加起。若酸化过份pH , 2,3，可用1 mol/L NaOH校回)。再加水饱和的乙酸乙酯1ml,摇匀待分层，吸取上层乙酸乙酯液于另一干净试管中。原管再加乙酸乙酯1ml，同样摇匀分层收上层液于同一试管中，80,90?水浴蒸干残渣加无水乙醇50μl溶解，摇匀后点样。 3.正常血清DNS-氨基酸的双向层析: 取一张5cm×5cm聚酰胺薄膜，经左下角距两边各0.5cm处点上血清DNS-氨基酸。点样时用毛细玻管吸取DNS-氨基酸乙醇液，点样直径控制在2mm,3mm之间，可重复几次以提高浓度，点样量以紫外灯下能见一明亮的荧光点为佳。点样后将膜卷拢放在苯-冰乙酸溶剂系统中进行第一向层析(点样处在下)，待溶剂前沿到达离顶端约3mm处取出用电吹风冷风吹干至无冰乙酸味为止。在紫外灯下 观察层析情况然后将膜调转90?与第一向垂直在85%甲酸-水溶剂系统中进行第二向层析。层析后，用电吹风热、冷风交替吹去除残存溶剂。在紫外灯下观察结果，并用铅笔轻轻描写出各荧光点位置，对照图谱可确定各荧光点的DNS-氨基酸种类。