5五种不同细胞对肠道病毒71型的敏感性

wcjd@wjgnet.com 世界华人消化杂志 2009年2月28日; 17(6): 573-577 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 基础研究 BASIC RESEARCH 应用空斑形成法检测五种不同细胞对肠道病毒71型的敏 感性 杨子峰, 秦 笙, 莫自耀, 关文达, 王玉涛 杨子峰, 秦 笙, 莫自耀, 关文达, 王玉涛, 呼吸疾病国家重点 实验室(广州医学院)·广州医学院第一附属医院 广东省广 州市 510230 杨子峰, 助理研究员, 主要从事临床病毒学与抗病毒药物的研究. 广州市重大科技基金资助项目, No. 2007Z1-E0111 作者贡献分布: 杨子峰, 秦笙, 莫自耀, 关文达及王玉涛对此文所 做贡献均等; 此课题由杨子峰和秦笙设计; 研究过程由杨子峰与 秦笙独立完成; 研究所用试剂及分析工具由莫自耀提供; 数据分 析由杨子峰, 秦笙, 关文达及王玉涛完成; 本论文写作由杨子峰, 莫自耀及秦笙完成. 通讯作者: 莫自耀, 510230, 广东省广州市, 呼吸疾病国家重点实 验室(广州医学院)·广州医学院第一附属医院. moziyao@163.net 收稿日期: 2008-12-26 修回日期: 2009-01-24 接受日期: 2009-02-09 在线出版日期: 2009-02-28 Detection of five different cells' sensitivities to enterovirus 71 using plaque forming assay Zi-Feng Yang, Sheng Qin, Zi-Yao Mo, Wen-Da Guan, Yu-Tao Wang Zi-Feng Yang, Sheng Qin, Zi-Yao Mo, Wen-Da Guan, Yu-Tao Wang, State Key Laboratory of Respiratory Dis- ease (Guangzhou Medical University), Guangzhou Institute of Respiratory Disease, Guangzhou 510230, Guangdong Province, China Supported by: the Major Programs of Guangzhou Sci- ences, No. 2007Z1-E0111 Correspondence to: Zi-Yao Mo, State Key Laboratory of Respiratory Disease (Guangzhou Medical University), Guangzhou Institute of Respiratory Disease, Guangzhou 510230, Guangdong Province, China. moziyao@163.net Received: 2008-12-26 Revised: 2009-01-24 Accepted: 2009-02-09 Published online: 2009-02-28 Abstract AIM: To establish the plaque assay for the quantitative detection of enterovirus 71 (EV71) and to compare sensitivity of buffalo green monkey (BGM) cells, vero E6 cells, MRC-5 cells, A549 and HEp-2 cells to it. METHODS: BGM cells and vero cells were transinfected with EV-71. Then the plates were covered with three kinds of overlay medium (i: 0.6% Agarose, ii: 1% methycellulose, iii: 1.2% Avicellulose) and incubated for 3 to 4 days. The plaques were stained, and the number of plaques was counted. The supernatants were harvested at 24-96 hours after infection for plaque assay, and this technique was used to measure the five cell lines simultaneously. RESULTS: The plaques appeared as clear cycles (range 0.5 to 1 mm) in BGM and vero E6 cells covered with 1% methycellulose and 1.2% avi- cellulose, whereas EV71 produced the pinpoint plaques covered with 0.6% agarose. The titer of vi- rus ranged from 1.65×109 pfu/L to 2.87×109 pfu/L. CONCLUSION: The techniques may benefit the quantitative detection of EV71. Furthermore, it indicates that BGM cells and vero E6 cells consti- tute a valuable and sensitive cell line system for enterovirus 71. Key Words: Enterovirus 71; Plaque forming assay; Cell; Quantitative detection Yang ZF, Qin S, Mo ZY, Guan WD, Wang YT. Detection of five different cells' sensitivities to enterovirus 71 using plaque forming assay. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2009; 17(6): 573-577 摘要 目的: 建立肠道病毒71型(EV71)的空班形成 方法, 并比较BGM、VeroE6、MRC-5、HEp-2 及A549五种细胞对EV71病毒的敏感性. 方法: 将不同稀释浓度的EV71病毒接种到五 种细胞, 分别覆盖三种不同的培养物, 孵育一 定时间后固定染色, 比较出斑效果; 以新建空 斑形成法测定五种细胞感染EV71 24-96 h后 培养液滴度, 计算空班形成单位(pfu). 结果: 在五种细胞中, BGM和VeroE6覆盖琼脂 糖凝胶的EV71可形成针尖样空班; 覆盖1%甲 基纤维素的EV71可形成直径大约1 mm圆形 或类圆形空班, 形成空斑单位最多, 病毒滴度 分别达2.87×109 pfu/L和1.65×109 pfu/L; 覆盖 1.2%艾维素的EV71在BGM细胞中可形成直 径大约0.5 mm类圆形空斑, 在VeroE6细胞中形 成针尖样空斑; 其他细胞均形成针尖样空斑. 结论: 空斑形成方法可对肠道病毒进行定量 www.wjgnet.com ® ■背景资料 肠道病毒71型是 1969年首次从加 利福尼亚患者的 中枢神经系统疾 病 的 婴 儿 粪 便 中 分 离 出 来 的 . EV71已在世界范 围内引起十多次 爆发和流行. 因此 EV71感染和流行 是值得长期密切 关注的问题. 加强 和完善其诊断方 法, 特别是准确定 量的方法, 将有助 于开展EV71病毒 的诊治、药物以 及疫苗等研究. ■同行评议者 赵平, 副教授, 中 国人民解放军第 二军医大学微生 物学教研室 万方数据 检测, BGM及VeroE6细胞为EV71的敏感细胞. 关键词: 肠道病毒71型; 空斑形成试验; 细胞; 定量 测定 杨子峰, 秦笙, 莫自耀, 关文达, 王玉涛. 应用空斑形成法检测 五种不同细胞对肠道病毒71型的敏感性. 世界华人消化杂志 2009; 17(6): 573-577 http://www.wjgnet.com/1009-3079/17/573.asp 0 引言 肠道病毒71型(enterovirus71, EV71)是小RNA病 毒科肠道病毒属(enteovirus)成员, 其感染主要引 起患者的手足口病(hand-foot-and mouth disease, HFMD)[1]. 近年来, EV71病毒的流行在亚太地区 呈上升趋势[2], 尤其是2008年我国安徽阜阳EV71 疫情的爆发及蔓延[3], 再度引起医学界的高度重 视. 关于肠道病毒定量检测, 传统的病毒滴定方 法主要是通过观察被病毒感染细胞产生的细胞 病变或血凝滴度进行定量检测, 但这类方法易 因实验者的技术水平和经验的差异造成判断的 主观性. 检测病毒核酸的实时定量PCR方法有快 速、敏感的优点, 但不能提示病毒感染力[2]. 空斑形成试验是对病毒感染力精确定量的 有效方法, 本研究针对EV71病毒建立空班形成试 验方法, 用于比较不同细胞对EV71的敏感性, 为 临床实验室选择合适诊断细胞系组合提供依据. 1 材料和方法 1.1 材料 琼脂糖(O x o i d)、二乙基氨基乙基 (DEAE, GE公司), 小牛血清(TBD公司), 甲基纤 维素(carboxymethylcellulose sodium salt, Sigma 公司), 艾维素(Avicel, FMC公司), 结晶紫(Crystal v io le t, 天津市大茂化学试剂厂), 24孔细胞培 养板(Cornnig公司). 细胞株: BGM、VeroE6、 MRC-5、A549、HEp-2为本室保存细胞株, 细 胞为本室保存. 病毒株: 肠道病毒71型广州株 (EVGZ06), 自临床患者样品分离, 以MRC-5细胞 传代扩增. 1.2 方法 1.2.1 空斑试验: 用常规制备的BGM、VeroE6、 MRC-5、HEp-2和A549五种细胞接种10倍系列 稀释的病毒, 吸附1-2 h后, 五种细胞分别覆盖三 种不同的培养物1.5 mL/孔, 置34℃、50 mL/L CO2条件下培养3 d. 以福尔马林缓冲结晶紫溶液 (0.1%)固定和染色, 计算空班形成单位(PFU). 培 养物配方: (1)6 g/L琼脂糖覆盖物: 总量22.6 mL, MEM(2×)10 mL, 无菌纯水3.4 mL, 小牛血清0.4 574 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2009年2月28日 第17卷 第6期 mL, 1% DEAE 0.2 mL, 20 g/L琼脂糖6 mL. (2)10 g/L甲基纤维素覆盖物: 总量20 mL, 称取1 g甲基 纤维素粉高压灭菌后, 加入MEM(1×)19.6 mL 和小牛血清0.4 mL, 混匀备用. (3)1.2% Avicel: 2.4% Avicel与MEM(2×)等体积混合. (4)MEM(2 ×): 总量500 mL, 称取9.4 g MEM粉末溶解于无 菌纯水462 mL过滤除菌, 另补加终浓度0.6 g/L 谷胺酰氨, 100 U/L青霉素, 100 μg/L链霉素, 7% NaHCO3, 0.02 mol/L HEPES, 0.4% BSA. 按下列 公式计算空斑形成单位: 空斑形成单位(pfu/L) = [每孔平均空斑数/每孔病毒接种量(mL)]×病毒 稀释度. 1.2.2 用空斑试验检测EV71在BGM、VeroE6、 MRC-5、HEp-2和A549细胞上不同增殖时间的 滴度: 常规接种五种细胞于24孔培养板, 待细胞 形成单层后, 分别接种MOI = 0.01的病毒各3孔, 取感染后24、48、72、96 h四个时间点的上清 液做空斑形成试验, 计算空斑形成单位. 2 结果 2.1 空斑试验的建立 在BGM和Vero E6两种细 胞, 覆盖琼脂糖凝胶的EV71形成针尖样空班; 覆 盖10 g/L甲基纤维素的EV71形成直径大约1 mm 圆形或类圆形空班; 覆盖Avicel的EV71在BGM 细胞中可形成直径大约0.5 mm类圆形空斑, 在 Vero E6细胞中形成针尖样空斑, 其他细胞均形 成针尖样空斑(图1). 2.2 检测EV71在BGM、VeroE6、MRC-5、 HEp-2和A549细胞上不同增殖时间的病毒滴度 结果 EV71病毒在不同细胞不同增殖时间所产 生的滴度: BGM>VeroE6>MRC-5>HEp-2>A549, 其中病毒在BGM和VeroE6细胞上产量均高于其 他3种细胞. 2.3 EV71在BGM、VERO、MRC-5、A549和 HEp-2出现CPE的特征与时间 EV71在BGM、 VeroE6细胞, 感染后第2天即迅速出现典型的肠 道病毒CPE: 细胞变圆、坏死、脱落, 最终整个 单层细胞被破坏(图2-3); MRC-5、A549和HEp-2 细胞接种后4-5 d出现细胞变圆、坏死、脱落等 CPE, 出现CPE的时间落后于上述两种细胞, 且 不易与老化细胞辨别. 3 讨论 EV71是1969年首次从加利福尼亚患者的中枢神 经系统疾病的婴儿粪便中分离出来的[4]. EV71 已在世界范围内引起十多次爆发和流行, 我国 台湾地区也曾发生EV71感染大爆发[5], 特别是 www.wjgnet.com ■研发前沿 肠道病毒在自然 界广泛存在且型 别 众 多 , 一 病 多 原、一原多症是 肠 道 病 毒 感 染 的 重 要 特 征 . 在 E V 7 1 流行期间 , 虽然可通过血清 中和试验和核酸 扩增测序等手段 进行鉴定分型, 但 对于常规条件一 般的临床实验室, 病毒分离培养仍 然是十分实用和 重要的诊断办法. 万方数据 杨子峰, 等. 应用空斑形成法检测五种不同细胞对肠道病毒71型的敏感性 575 www.wjgnet.com 2008-05我国安徽爆发的EV71[3], 严重危害人民 群众的生命安全, 因此EV71感染和流行是值得 长期密切关注的问题. 加强和完善其诊断方法, 特别是准确定量的方法, 将有助于开展EV71病 毒的诊治、药物以及疫苗等研究. 病毒空斑(又叫蚀斑)如同噬菌体的蚀斑[7], 在细胞培养中是一种较精确地测定病毒感染力 的方法. 每个空班由单个具有感染性病毒颗粒 复制形成, 所以病毒空斑实验既检测了病毒的 感染性也测定了病毒的滴度, 这一特点是分子 生物学手段不能比拟的. 本研究将琼脂糖、甲 基纤维素以及艾维素三种材料用于覆盖不同细 胞, 为建立EV71病毒空斑试验选择最佳覆盖材 料. 结果发现, 病毒在不同细胞不同材料下形成 空斑效果差异较大, 最佳的是Vero E6细胞覆盖 含10 g/L甲基纤维素营养物, 形成十分清晰的类 圆形空斑. 本研究建立的EV71空斑形成法体系, 操作简单, 结果易于观察, 试验周期较短, 十分 适用于EV71病毒的定量检测. 肠道病毒在自然界广泛存在且型别众多, 一 病多原、一原多症是肠道病毒感染的重要特征. 在EV71流行期间, 虽然可通过血清中和试验和 核酸扩增测序等手段进行鉴定分型, 但对于常规 条件一般的临床实验室, 病毒分离培养仍然是十 分实用和重要的诊断办法. 分离肠道病毒所选用 的细胞系一般都为人源或猴源细胞[6], 他们都具 有肠道病毒受体, 可不同程度地支持肠道病毒 的体外复制. 如, 脊髓灰质炎病毒在猴肾细胞和 HEp-2细胞产生CPE[8], 而埃可病毒只对A549、 MRC-5和猴肾细胞敏感[9], 柯萨其病毒B组病毒 和A组中的少数型别(7、9、16等)能在猴肾细胞 中生长, 人胚肺成纤维细胞株对柯萨其A组和B 组病毒敏感性也存在差异[10]. 明确EV71病毒敏 感的宿主细胞, 不仅可以为临床实验室挑选合 适细胞系提供可靠信息, 也对抗病毒药物和预 防性疫苗的筛选有重要意义. 本研究根据以往实验经验、细胞的普遍 性和获得的难易程度三个原则选择了BGM、 ■创新盘点 本研究根据以往 实验经验、细胞 的普遍性和获得 的 难 易 程 度 三 个 原 则 选 择 了 BGM、VeroE6、 HEp-2、MRC-5 和A549 5种细胞, 比较其对EV71的 敏感性, 结果显示 BGM和VeroE6细 胞的敏感性最好, 出现细胞病变最 快, 病毒产量也最 高. A B C D E F 图 1 BGM细胞和VeroE6细胞在不同覆盖物下形成的空斑. A-C: BGM; D-F: VeroE6; A, D: 0.6% Agar; B, E: 10 g/L甲基纤维 素; C, F: 1.2% Avicel. 400 350 300 250 200 150 100 50 0 24 h P.I 48 h P.I 72 h P.I 96 h P.I PF U /m L (× 10 4 ) 感染后不同时间 BGM VeroE6 MRC-5 HEp-2 A549 图 2 空斑形成法测定不同时间收获液的病毒滴度. 万方数据 www.wjgnet.com 576 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2009年2月28日 第17卷 第6期 VeroE6、HEp-2、MRC-5和A549 5种细胞, 比较 其对EV71的敏感性, 结果显示BGM和VeroE6细 胞的敏感性最好, 出现细胞病变最快, 病毒产量 也最高. EV71感染BGM、VeroE6细胞后第2天即 迅速出现典型的肠道病毒CPE, 因此感染后48-72 h病毒产量最高, 之后上清液中细胞碎片、脱落 细胞过早出现, 有可能影响病毒高峰的持续时 间. 而MRC-5敏感性虽然也不低, 但由于在体外 传代数有限, 在临床实验室应用受到一定限制, A549和HEp-2虽然也有病毒增殖, 但由于滴度低 且不易出现典型CPE, 仅可用于抗原检测. 总之, 我们建立了用于测定肠道病毒EV71 型病毒的空斑形成技术 , 成功应用于五种细 胞对E V71型病毒敏感性比较的研究, 筛选出 BGM、VeroE6细胞为EV71的敏感细胞, 为临床 实验室挑选合适细胞系提供了可靠信息. 肠道 病毒空班形成技术的应用能迅速准确计数出不 同标本中的病毒空斑数, 将有利于疫苗效价滴 定、抗病毒药物筛选等研究. 致谢: 感谢陈敬贤教授为本研究提供的帮助. 4 参考文献 1 Hsiung GD, Wang JR. Enterovirus infections with special reference to enterovirus 71. J Microbiol Immunol Infect 2000; 33: 1-8 2 陈宗波. 人类肠道病毒71型感染的研究进展. 中华儿 科杂志 2005; 43: 428-430 3 中华人民共和国卫生部新闻办公室. 卫生部公布2008 年5月全国突发公共卫生事件信息 . 中华人民共和 国卫生部官方网站, 2008-06-12; cited 2008-12-26; 1(1): 24 screens. URL: http://www.moh.gov. cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohbgt/ s3582/200806/36296.htm 4 Schmidt NJ, Lennette EH, Ho HH. An apparently new enterovirus isolated from patients with disease of the central nervous system. J Infect Dis 1974; 129: 304-309 5 Komatsu H, Shimizu Y, Takeuchi Y, Ishiko H, Takada H. Outbreak of severe neurologic involvement associated with Enterovirus 71 infection. Pediatr Neurol 1999; 20: 17-23 6 David MK, Peter MH. Fields Virology. 5th ed. Philadelphia USA: Lippincott Williams and ■应用要点 本研究结果发现, 病毒在不同细胞 不同材料下形成 空斑效果差异较 大, 最佳的是Vero E6细胞覆盖含10 g/L甲基纤维素营 养 物 , 形 成 十 分 清晰的类圆形空 斑. 本研究建立的 EV71空斑形成法 体 系 , 操 作 简 单 , 结果易于观察, 试 验周期较短, 十分 适用于EV71病毒 的定量检测. 图 3 EV71在不同细胞的CPE(Day2 P.I 100×). A: 正常BGM细胞; B: EV71的CPE(BGM); C: 正常VeroE6细胞; D: EV71的 CPE(VeroE6); E: 正常MRC-5细胞; F: EV71的CPE(MRC-5). A B C D E F 万方数据 www.wjgnet.com 杨子峰, 等. 应用空斑形成法检测五种不同细胞对肠道病毒71型的敏感性 577 Wilkins, 2007: 845 7 黄文林. 分子病毒学. 第2版. 北京: 人民卫生出版社, 2006: 742 8 Albrecht P, Enterline JC, Boone EJ, Klutch MJ. Poliovirus and polio antibody assay in HEp-2 and Vero cell cultures. J Biol Stand 1983; 11: 91-97 9 Smith CD, Craft DW, Shiromoto RS, Yan PO. Alternative cell line for virus isolation. J Clin Microbiol 1986; 24: 265-268 10 Shinohara M, Uchida K, Shimada S, Segawa Y, Hirose Y. [The usefulness of human lung embryonal fibroblast cells (MRC-5) for isolation of enteroviruses and adenoviruses] Kansenshogaku Zasshi 2002; 76: 432-438 编辑 李军亮 电编 何基才 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 2009年版权归世界华人消化杂志 •消息 • 2007 年内科学类期刊总被引频次和影响因子排序 总被引频次 影响因子 数值 学科排名 离均差率 数值 学科排名 离均差率 1170 JOURNAL OF GERIATRIC CARDIOLOGY 19 44 -0.98 0.059 44 -0.89 G275 WORLD JOURNAL OF GASTROENTEROLOGY 4431 1 3.46 0.745 10 0.38 G803 肝脏 467 28 -0.53 0.537 17 -0.01 G938 国际呼吸杂志 521 25 -0.48 0.386 32 -0.29 G415 国际内分泌代谢杂志 654 20 -0.34 0.520 19 -0.04 G939 国际脑血管病杂志 662 19 -0.33 0.480 22 -0.11 G501 临床肝胆病杂志 497 26 -0.50 0.318 36 -0.41 G291 临床骨科杂志 689 18 -0.31 0.455 25 -0.16 G658 临床荟萃 1169 13 0.18 0.233 40 -0.57 G257 临床内科杂志 651 21 -0.35 0.367 34 -0.32 G855 临床消化病杂志 292 36 -0.71 0.394 30 -0.27 G261 临床心血管病杂志 866 17 -0.13 0.474 24 -0.12 G293 临床血液学杂志 341 34 -0.66 0.347 35 -0.36 G491 岭南心血管病杂志 157 41 -0.84 0.110 43 -0.79 G662 内科急危重症杂志 276 37 -0.72 0.318 36 -0.41 G746 实用肝脏病杂志 297 35 -0.70 1.100 3 1.04 G190 世界华人消化杂志 2353 5 1.37 0.568 15 0.05 G800 胃肠病学 376 33 -0.62 0.372 33 -0.31 G326 胃肠病学和肝病学杂志 468 27 -0.53 0.399 29 -0.26 G451 现代消化及介入诊疗 84 43 -0.92 0.230 41 -0.58 G083 心肺血管病杂志 214 40 -0.78 0.206 42 -0.62 G419 心血管病学进展 467 28 -0.53 0.419 27 -0.23 G260 心脏杂志 523 24 -0.47 0.392 31 -0.28 G610 胰腺病学 223 38 -0.78 0.282 38 -0.48 G234 中国动脉硬化杂志 869 16 -0.13 0.521 18 -0.04 G422 中国脑血管病杂志 223 38 -0.78 0.503 21 -0.07 G267 中国实用内科杂志 2121 7 1.13 0.601 13 0.11 G211 中国糖尿病杂志 1284 11 0.29 0.931 7 0.72 G203 中国心脏起搏与心电生理杂志 616 23 -0.38 0.599 14 0.11 G633 中国血液净化 449 31 -0.55 0.478 23 -0.12 G119 中国循环杂志 643 22 -0.35 0.411 28 -0.24 G231 中华肝脏病杂志 2746 4 1.76 1.056 4 0.95 G235 中华高血压杂志 982 15 -0.01 0.757 9 0.40 G639 中华老年多器官疾病杂志 143 42 -0.86 0.235 39 -0.57 G876 中华老年心脑血管病杂志 465 30 -0.53 0.431 26 -0.20 G150 中华老年医学杂志 1010 14 0.02 0.510 20 -0.06 G155 中华内分泌代谢杂志 1548 9 0.56 1.032 5 0.91 G156 中华内科杂志 3238 3 2.26 0.847 8 0.57 G161 中华肾脏病杂志 1477 10 0.49 1.018 6 0.88 G285 中华消化内镜杂志 1271 12 0.28 0.607 12 0.12 G168 中华消化杂志 2249 6 1.26 1.123 2 1.08 G892 中华心率失常学杂志 384 32 -0.61 0.568 15 0.05 G170 中华心血管病杂志 3705 2 2.73 1.217 1 1.25 G172 中华血液学杂志 1632 8 0.64 0.633 11 0.17 平均值 994 0.541 以上数据摘自《中国科技期刊引证报告》(2008年版). 科学技术文献出版社, 160-161. 代码 期刊名称 ■同行评价 本文建立了肠道 病毒71型(EV71) 的空班形成方法, 并比较了五种细 胞对EV71病毒的 敏感性, 探讨了三 种覆盖材料对病 毒感染以及空斑 形 成 的 影 响 , 为 临床实验室进行 EV71的定量检测 提供了有用的方 法, 有重要的应用 推广价值. 万方数据