分子生物学在中药领域的应用

分子生物学技术在中药领域的应用 分子生物学技术在中药领域的应用 【摘要】：随着国家中医药现代化战略的实施运用现代科学技术对中药的作用机理、质量控制和量效关系进行研究受到了广泛重视，关于中药分子生物技术的研究更成为热门课之一，但是中药所含成分极其复杂。而传统的中药化学质量又很难全面评价药材的品质，故导致我国中药走向世界困难重重。近年来分子生物学技术在中药质量评价领域的应用逐步扩大方法也日趋完善在中药的分子鉴定 中药质量控制，作用机理研究新药研发等方面均展示出很好的应用前景，现就分子生物学技术在中医药领域方面的应用做一述评。 【关键词】：分子生物学;生物技术;中医药领域;应用 【abstract】With the implementation of the strategy of national Chinese medicine modernization by using modern scientific technology of Chinese material medical mechanism, quality control and concentration-response relationship between received widespread attention ,As a new instrument，Molecular Biology had impelled the exponents of the TCM theory interpreted the molecular targets of the herbal medicine，and exploited the new TCM，Further, Molecular Biology would help enlighten new ideas an d develop new methods of diagnosis an d treatment．Therefore Molecular Biology will bring profound changes to the study of TCM . 【Key words】Molecular biology, Biotechnology, Chinese medicine field, application 分子生物学作为一门全新的理论与技术 ,在中医药开发中已经得到普及和推广 ,近二十年来我国对中医药分子生物学的研究取得了巨大成就。分子生物学的理论和技术突飞猛进 ,给生命科学带来巨大变化 ,为中医药走向世界奠定了良好基础。在中药领域中 ,分子生物学的渗入意味着中药开发已经驶入高效、低耗、减少淘汰的快车道。只要能将研究深入到分子水平 ,不仅可以深化中医药理论 ,提高疗效 ,减少毒副作用 ,又有利于尽快地与国际接轨。 1.分子生物学在中药鉴别与质量控制中的应用 1.1 传统鉴定 中药的传统鉴定是利用植物或动物形态分类学和解剖学特征，从基原、性状、显微特征、理化等方面进行药材鉴别。大部分药材经加工、炮制等处理后，往往失去了原来的形态和解剖特征，甚至显微特征也会发生改变，从而使药材的真伪优劣难以鉴别，特别是对一些故意造假、以次充好的药材更是难以鉴别。因此假劣药材、混淆品充斥中药材市场的状况一直未能得到根本改善。复方制剂也难以通过传统的形态鉴别方法来鉴别。近年来，分子生物学技术的应用，使中药材鉴别从器官水平提高到细胞水平和分子水平。  1.2 DNA分子鉴定   DNA分子作为生物遗传信息的直接载体，同种药用植物或动物的每一个体的所有细胞均包含相同的遗传信息，具有相同的遗传物质DNA，它不受气候、土壤等环境影响，也不会随个体发育阶段或因组织器官的不同而不同。因此DNA分子标记技术为鉴别原植物或动物形态已遭到破坏的药材的鉴别提供了新的技术途径。 1.2.1基于聚合酶链反应(PCR)的鉴别： 基于PCR的鉴别方法有随机扩增多态性DNA(RAPD）、任意引物聚合酶链反应（AP-PCR）、微卫星DNA等。如黄璐琦等应用RAPD技术对来源于13个种3 个变种的天花粉及其类似品，用8个引物分别扩增，得到了清晰、稳定的83条条带，通过聚类分析，把天花粉正品与类似品有效地分成3大类。曹晖等采用AP-PCR和RAPD方法扩增地胆草、白花地胆草和假地胆草及其商品药材苦地胆草的基因组DNA，获得了可靠的DNA指纹，根据DNA带型差异可鉴别苦地胆及其混淆品。张荣等用50个随机引物对云南木蓝属的8种生药进行了 PCR扩增，其中8个引物扩增成功，有的引物扩增种间差异明显，可以有效地进行鉴别。此外，运用基于PCR的DNA技术，还进行了野山参与栽培人参（园参）、西洋参、西红花及其伪品、冬虫夏草及其伪品、细辛属、石斛属等药材的鉴别。 1.2.2限制性长度多态性分析： 将药材的DNA或通过PCR扩增的药材DNA片段，用限制性内切酶消化后，进行限制性片段长度多态性(RFLP,PCR-RFLP)分析，即多态性酶切位点的分析，可以确定基因的种属特异性，从而鉴别药材。山崎真己等用RFLP方法分析了羽扇豆属药用植物。马小军等对人参的研究表明，对 RAPD反应产物进行限制性内切后作RFLP分析，能有效提高DNA 指纹的使用效率。吴平等从5种海马干燥标本中提取DNA，用 PCR技术扩增12SrRNA和Cyt b基因片段并进行RFLP分析，结果 12SrRNA基因比Cyt b基因保守，从Cyt b基因的RFLP获得的遗传信息比12SrRNA基因片段的大得多。以PCR-RFLP方法进行中药材的分子鉴定，应选择进化速率较快的基因。 2．在中药有效成分提取方面的应用 中草药有效成分的提取和鉴定是中药研究的重要工作之一。一种中药材要经过一系列繁琐而艰辛的分离提取过程， 鉴定测定后才得知其所含的有效成分及含量，然而有效成分往往是微量的，如长春花碱、美登米碱等。如何获得更多的有效成分一直是中草药研究的一个奋斗目标。生物技术的快速发展为这一研究提供了新方法、新思路，如转基因器官培养技术等。 3．在中药作用机制方面的应用 3.1 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术是分子生物学的基本技术之一,基本原理是具有一定同源性的2条核酸单链在一定的条件下按碱基互补原则退火形成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针。其中将核酸提取分离后在体外与探针杂交的是印迹杂交,直接在组织细胞内进行的是原位杂交。 中药作用机理研究中较早常用的有RNA印迹杂交(Northern blot) ,点杂交( dot blot)和原位杂交。二仙汤是治疗妇女更年期综合征、抗衰老的名方,具温补肾阳、泻相火、调冲任功能。廖柏松等[ 1 ]采用Northern blot对18月龄雌性大鼠下丘脑内阿片肽的基因表达水平进行研究,结果表明,二仙汤组β2内啡肽前体阿黑皮素原和脑啡肽原的mRNA 水平明显升高,达到未衰老前水平。沈小珩等[ 2 ]则从衰老过程抗氧化酶活性降低,且酶活性降低与其蛋白质基因表达水平降低平行的现象出发,采用分子杂交等技术考察二仙汤及其拆方对超氧化物歧化酶、过氧化氢酶基因表达水平及其活性的影响。结果表明,抗氧化酶活性显著升高,且与其mRNA 表达水平升高呈平行关系,提示二仙汤抗衰老是通过增强抗氧化酶基因表达水平而实现的。海风藤有祛风除湿、通经活络的功效。韩恩吉等[ 3 ]采用Northern blot观察它对人类神经母细胞瘤细胞系列淀粉样前体蛋白基因表达的抑制作用。结果发现,海风藤选择性地抑制β2APP基因表达,为其防治阿尔茨海默病提供了一定依据。郑钦岳等[ 4 ]应用dot blot研究了补血和血方四物汤对白细胞介素26 ( interleukin26, IL26) mRNA 表达的影响,实验表明,四物汤在0. 01～1. 00ng/mL 浓度内可使IL26 mRNA的表达明显增加。保心丸具有降脂、降低血浆内皮素、抑制血小板聚集等作用。为进一步阐明保心丸抗实验性动脉粥样硬化的机理, 樊永平等[ 5 ]用原位杂交技术研究内皮素( endothelia, ET)和一氧化氮合酶(Nitric oxide synthesis, NOS) 在AS家兔主动脉壁的基因表达。结果证实,保心丸组ET21mRNA 的表达较模型组低,而NOS mRNA较模型组高, 提示保心丸调节血管内源性NO和ET之间的平衡可能是其抗实验性AS的机理之一。精制血府胶囊是血府逐瘀汤的化裁精简方,其抗心肌缺血疗效明显优于原方,为揭示其作用机制,证实其疗效,王伟等[ 6, 7 ]分别采用Northern blot和原位杂交等技术,研究其对于心肌缺血密切相关基因表达的影响,前者结果表明精制血府胶囊显著提高缺血缺糖心肌细胞NOS mRNA表达水平,后者的精制血府胶囊组, ET21和内皮素转换酶( endothelin2-converting enzyme, ECE) 21的mRNA表达较其它组明显减少,且心肌细胞损伤也较其它组显著减轻。因而推测精制血府胶囊可能是通过提高NOS表达、促进NO生成及抑制ET21、ECE21的基因表达,减少ET21生成,减轻其对心肌细胞的直接损伤,发挥保护心肌细胞的作用。 Northern blot是用来测量真核生物RNA的量和大小及估计其丰度的实验方法,并可从大量RNA样本中同时获得这些信息, 但需要大量的材料, 受RNA降解影响大,敏感性低。dot blot的不足之处在于点于同一张膜上同样的样品杂交信号有时不稳定,且一般要用纯化的RNA样品。原位杂交的优势在于可对组织细胞中的核酸进行精确定位。核酸分子杂交是分子生物学基本技术,随着反转录2聚合酶链式反应( reverse transcription polymerase chain，reaction, RT2PCR)技术、差异显示PCR ( differential display 2PCR ,DD2PCR)、DNA阵列等优势技术的出现、逐渐成熟而应用渐增,近5年应用基本的分子杂交技术研究中药作用机理的报道已少见。 3.2 DD-PCR 1992年,梁鹏等建立了一种对不同来源的mRNA样品用PCR 技术对其中许多的cDNA基因一起进行扩增和显示的实验方法,即DD2PCR。该方法依赖2套不同类型的合成寡核苷酸引物:一套锚定反义引物与一套随机正义引物。最后通过比较不同来源的扩增cDNA产物的电泳带谱,能够发现差异表达的基因。 中药作用机理研究中应用DD2PCR的报道有唐发清等[ 18 ]对有抗鼻咽癌作用的益气解毒片干预鼻咽癌细胞基因表达的研究,旨在从基因选择性表达水平探讨其抗鼻咽癌的机理。结果表明, 益气解毒片在体外能抑制鼻咽癌细胞基因的表达, 同时诱导一些特异基因的表达, 从而抑制鼻咽癌细胞的增殖。 相比以往的方法, DD2PCR 技术提供了几方面理论上的优势,如理论上能够灵敏地检测组织或细胞中表达量极低的mRNA样品的差异表达,能鉴别特定组织或细胞来源样品之间转录水平的mRNA定性和定量变化。这种优势同样可体现在中药机理研究中,可同时显示中药作用后对多种基因转录的不同影响,将有影响的靶基因条带回收,再扩增、克隆、测序,查询确定是什么基因,是已知或未知序列,这样就可以确定中药起效可能源于影响那些基因转录。但这些优势目前部分还停留在理论上,还有许多技术问题有待解决,如经DD2PCR鉴定出来的超过半数的cDNA是假阳性条带,靶细胞的总mRNA中的一部分不能被高水平扩增、造成丢失等[ 17 ] 。尽管目前DD2PCR应用在中药基因转录水平的机理研究报道还很少,但毋庸置疑,其潜力巨大。 4.分子生物学技术在中药药效研究中的应用 近年来,中药研究开发已开始在中医药基础理论指导下引入现代分子生物学,吸纳新的研究方法,在中医药现代化研究方面开辟了一个新的领域。回顾整个药物发现过程,药物的有效性、毒副作用一直是人们普遍关注的焦点。有效药物靶位的筛选与鉴定无疑是其核心技术之一。也是新药研制与开发的突破口。药靶的确定一般依据疾病的发生机制,建立筛选模型,关键是寻找、确定和制备药物作用靶点。有限的侯选靶基因数和靶标疗效确认是现存的困难,是急需克服的障碍。充分利用人类基因组得到的数据库资源,通过同源比较、差异分析、基因分类、功能预测、药物靶位的辨认等在药物开发中发挥重要作用。田志刚等观察了人参三醇皂甙(PTS) 对人淋巴细胞在植物血凝素刺激下的影响,发现PTS 可促进植物血凝素活化的淋巴细胞蛋白质的合成,促进IL-1、IL-3、IL-6 的基因表达,从而显示出PTS 的基因调控效应[2 ] 。中药抗癌机制可能是通过调控c-fos、P53 、PCL - 2 、c-myc等癌基因的表达来诱导肿瘤细胞凋亡[3 ] 。如复方儿茶素能抑制促癌剂引起的c-fos 和c-myc的基因表达,而对抑癌基因Rb表达则有调控作用[4 ] 。张其胜等[5 ]通过动物实验模型,从细胞分子水平揭示了甘草酸的抗纤维化机制。认为甘草酸可抑制Ito 细胞的增殖,进而抑制胶原的合成。而甘草甜素可通过抑制肝细胞NF - κB 的结合活性或阻断其激活。防止肝细胞损伤和肝纤维化[6 ] 。有研究表明,中药抗衰老机制是通过改善老年人的DNA 修复能力及基因调控以增强编码抗氧化酶的mRNA 表达水平而实现的。如三七、枸杞子、人参改善老年人核酸修复能力,延缓衰老进程。首乌、灵芝、五味子、枸杞子、人参可以提高SOD 水平。降低Lpo水平及脂褐素在细胞内的堆积发挥清除自由基、抗氧化作用[7 ] 。陈智松[8 ]应用半定量RT - PCR 检测小鼠骨髓原癌基因c-myc表达的变化,发现抑制原癌基因c-myc表达是枸杞多糖抗衰老分子机制之一。 5．结语 分子生物学技术在中药研究各个领域的渗透使得中药的发展有了更广阔的前景。日新月异的分子生物学理论和技术的发展将推动中药的鉴定、生产、机理研究和新药开发各个方面的理论和技术更加完善和科学, 使中药为世界所接受成为可能。我们可以预见现代分子生物学技术与传统中药的完美结合将给中药带来一次发展的契机。 参考文献： [1] 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