人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定

一 1 272 一 重庆医科大学学报2007年第32卷第12期 (Journal of Chongqing Medical University 2007．Vo1．32 NO．12} 论 著 文章编号：0253一．3626(2007)12-一1272-一04 人皮干细胞的体外分离培养和鉴定 李 丹，李世荣，曹 川 (第三军医大学西南医院整形外科，重庆 400038) 【摘 要】目的：探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定。方法：中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮 组织中分离表皮层和真皮层，并获得表皮单细胞悬液，采用Ⅳ型胶原铺板选择性黏附、分离和角质细胞无血清培养基(K-．-SFM) 培养表皮干细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况，检测细胞克隆形成率，免疫组化染色观察表皮干细胞标志物 B 1整 合素和角蛋白19(KI9)的表达；以角质形成细胞作为对照。结果：组织学观察显示，培养24h后细胞呈克隆状生长；所分离、培养 细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞；免疫组化染色显示，培养细胞 B 1整合素及 K19均呈阳性表达。结论：运用Ⅳ型胶 原黏附结合 K—SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养。 【关键词】表皮干细胞；细胞培养；细胞分离；鉴定 【中国图书分类法分类号】Q813．1+1 【文献标识码】A 【收稿日期】2007-05—12 Isolation。culture and identification Of hmnan epithelialI stem cells LI Dan，et al (Department of Burns and Plastic，Southwest Hospital，the rd ll~litary Medical University) 【Abstract】Objective：To explor~a method for isolation and culture of human epidermal stem cells．Methods：The Epidermal stem cell were isolated by adhering to collagen type IV after obtained by digesting human foreskin with Dispase II and Tryp and cuhure in vitro in K---SFM．The expressions ofB 1-integrin and keratin 19 (K19)in epidermal stem cell were detected with immunecytechemical method s，and the colony form ing efficiency was also studied ．Keratinecytes were served also detected． Resu／ts：It Was revealed by histological observation that colonieswere form ed 24 hours after inoculation．Th e isolated an d cuhured cell cloning efficiency Was higher than that of the control group．Positive expression of13 1-integrin and K19 of cultured cells Was detected by immunecytechemistry．Conclusion：Aduh epiderm al stem cells could be successfully isolated and cultured by adhension with type 1V collagen and cuhure with K--SFM 【Key words】Epidermal stem cells；Cell culture；Cell isolation；Identification 皮肤作为人体最大的器官，外层的表皮终生不 断自我更新。这种更新由表皮基底层具有再生能力 的角质形成细胞分裂、增殖、分化来完成。皮肤角质 形成细胞主要包括表皮干细胞(Epidermal stem cell，ESC)、短暂扩增细胞 (Transit amplifying cell， TA cel1)及终末分化细 (Postmitotic differentiating cell，PMD)。其中，位于基底部的表皮干细胞持续增 殖分化以取代外层终末分化细胞。从而在维持组织 结构的更新、细胞内环境的稳定和创伤后创面修复 过程中起着至关重要的作用，但由于 ESC数量较 少(只占基底细胞总数的 l％～lO％【。1)，缺乏明确的 特异性分子标志，体外培养很容易丢失其干细胞生 作者介绍：李 丹(1983一 )，女，硕士， 主要研究方向：创伤愈合表皮干细胞。 物学特性，如何大量获得纯度较高的表皮干细胞成 为目前干细胞研究领域的热点。本研究利用酶消化 法和IV胶原筛选贴壁对人包皮表皮干细胞进行分 离和纯化，以期为进一步研究奠定基础。 1 材料与方法 1．1 材料来源 角质细胞无血清培养基 (SFM—KC)(美国Gibco公司)， Dispease酶(美国Gibco公司)，人胎盘 IV型胶原(美国 Sigma 公司)，胰蛋白酶、小鼠抗人角蛋白 19、小鼠抗人 Bl整合素， PowerVisionTM二步法免疫组织化学检测试剂盒 (北京中杉 金桥生物技术公司)。 1．2 标本采集与处理 包皮皮片来自本院泌尿外科包皮环切术患者，无泌尿系 重庆医科大学学报 2007年第 32卷第 12期 (Journal of Chongqing Medical University 2007．Vo1．32 No．12) 天即可融合。 表 1 表皮干细胞与角质细胞的克隆形成结果比较 注：与角质细胞组比较，-P<0．05 2_3 免疫细胞化学染色 B 1整合素、K19免疫细胞化学染色均在细胞 胞浆内出现，呈棕黄色着色的阳性表达(图4a、4b． 图5a、5b)。 图4a 人表皮干细胞 Bl整合素，免疫组化染色阳性克隆(1OOx) 图4b人表皮干细胞 Bl整合素，免疫组化染色阳性克隆(200x) 图5a 人表皮干细胞 KI9，免疫组化染色阳性克隆(100x) ’ 图 5b 人表皮干细胞 K19，免疫组化染色阳性克隆(200x) 3 讨 论 表皮层由深层至表面分为基底层 、棘层 、颗粒 层 、透明层和角质层 ，代表了表皮干细胞分化和成 熟的不同阶段。基底层的表皮干细胞分化为短暂扩 充细胞，并由其继续增殖、分化为终末分化细胞，最 终角化由表皮脱落 ，完成正常皮肤的新成代谢过 程 ；不仅如此，表皮干细胞还积极参与皮肤损伤后 的修复，是皮肤发生、修复和重塑的关键性源泉[12，13]。 表皮干细胞具有慢周期性 ，体外培养时有较高 的克隆形成率，自我更新能力强 ，与皮肤基底膜黏 附紧密等特点19]。目前，表皮干细胞的分选有两种方 法，利用公认的细胞表面标志物，制备单克隆抗体， 用流式细胞仪或免疫磁株进行筛选【，I1；或利用表皮 干细胞对Ⅳ型胶原的快速黏附能力进行筛选。前者 分选的精度较高 ，阳性细胞率大，但分选后细胞活 性会受影响，且实验成本较高；后者分选的精度较 低 ，但细胞生长良好 ，方法简单易行。Bickenback 等[io1报道，37℃孵育 10～20min后表皮干细胞可在 I型胶原、Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等 基质上黏附，但只在Ⅳ型胶原上生长 良好 ，利用其 他基底层细胞黏附慢的特性可将表皮干细胞初步 分离并进行培养。本试验即选用细胞外基质成分Ⅳ 型胶原分选表皮干细胞 ，观察到表皮细胞接种 15min后 ，实验组细胞贴壁较为分散 ，数 目较多；对 照组贴壁细胞数较少。孵育 24h后，实验组细胞 80％已伸展伪足，少量细胞脱壁悬浮，对照组细胞 伸展不明显，脱壁细胞较多。孵育 72h后，实验组个 别细胞形成较小克隆，贴壁牢固，换液后细胞脱落 不明显，而对照组未见明显克隆形成 ，细胞贴壁不 牢，换液后细胞脱落较多。表皮干细胞这种对Ⅳ型 胶原依赖性，可以较好的解释细胞外基质成分对细 重庆医科大学学报2007年第32卷第 12期 (Joumal of Chongqing Medical Univers 2007．Vo1．32N0．12) 一 1275一 胞的粘附、生长、移行等方面起着重要的作用Il4J。实 验 中，还采用 了限定性角质形 成细胞 培养基 K—SFM，应用无血清培养技术可以排除血清中许多 未知因素对干细胞分化的影响。 鉴定表皮干细胞的关键是要找到特异的细胞 表面标志物。研究表明，表皮细胞能够表达多种粘 附分子 ，包括 ot 2 p 1、ot 3 p 1、ot 5 p 1、ot 6 p 4及 ot v B 5等 ，这些粘附分子不仅介导着细胞与细胞外 基质的结合，同时也调控着细胞的分化程度【I5J。13 1 整合素不仅介导表皮干细胞与细胞外基质的黏附， 也调控终末分化启动。有实验证实，13 1整合素表达 的降低会刺激角质干细胞离开干细胞池，向上迁移 成为分化细胞【16 8】，因而认为 13 1整合素高表达可 以是表皮干细胞的标志物之一。在非整合素的表面 标记中，研究较多的是细胞角蛋白家族里的一些成 员。角蛋白是表皮干细胞的结构蛋白，能较精细地 反映细胞的增殖、分化状态。K19表达阳性的细胞 多位于毛囊隆突区和表皮基底层，该部位都是公认 的表皮干细胞分布区域；且具有干细胞的慢周期性 和强大的增殖特性。而终末分化细胞则表达 K10。 所以K19被认为是表皮干细胞的另一种表面标志口91。 综上所述，目前关于表皮干细胞的培养及分离 技术已经取得了很大的突破，但仍有很多问有待 进一步解决；如表皮干细胞的特异性标志物仍未能 完全确定；如何确保体外培养的表皮干细胞稳定的 生物学特性；构建完整可用的皮肤所需时间仍较 长，且移植后的疗效仍不理想等。更多的研究仍需 进一步的开展，为表皮干细胞更好地临床应用提供 可靠的理论基础。 (李世荣：教授，博士生导师，023—65410724) 参 考 文 献 【1】 Faylor G，Michael S，Lehrer P stem calls in forming not only the Cell，2000；102：451—461． J，et a1．Involvement of follicular follicle but also the epidermis[J]． 【2】 Watt FM，Hogan BL．Out of Eden：stem cells and their niches 『J]．Science；2000：287，1427一l430． 【3】 Potten CS．The epidermal proliferative unit：The possible role of the central hasal cell『J1．Cell Tissue Kinet，l974；7：77—78． IJi A，Sinmmons PJ，Kaur P． Identification and isolation of can— didate hunman keratinocyte stem cells based on cell surface pheno— type[J】．Proc Natl Acad Sci，1998；95：3902-3907． 【5】 Tani H，Morris RJ，Kaur P．Enrichment for murine keratin~yte stem cells based on cell surface 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